Summary
Eine Primärkultur von Rinder Endothelzellen wurde verwendet, um den Mechanismus der Cornea-Endothelzellen-mesenchymale Transition zu untersuchen. Weiterhin wurde eine Ratte Hornhautendothel cryoinjury Modell kornealen Endothel-mesenchymale Transition in vivo zu demonstrieren.
Protocol
Alle folgten die Verfahren in dieser Studie mit der Association for Research gewährt in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der National Taiwan University Hospital genehmigt.
1. Isolierung, Primärkultur Vorbereitung, und Immunfärbung von Bovine MEL
- Erwerben Sie frische Rinderaugen von einem lokalen Schlachthof.
- Desinfizieren der Augen in einer 10% w / v Povidon-Iod-Lösung für 3 min. Wasche sie mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Lösung.
- Ernten Sie die Hornhaut-Taste mit einem Skalpell und Schere unter sterilen Bedingungen. Ziehen Sie die Descemet-Membran mit einer Pinzette unter einem Binokular (beachten Sie, dass in dieser Studie wurden die Rinderaugen von einem örtlichen Schlachthof entkernte, daher ist die erste Studie Verfahren war die Desinfektion der preenucleated Augen im Labor).
- Inkubieren der Membran Descemet in 1 ml tryPSIN bei 37 ° C für 30 min. Sammeln Sie die Rinder MEL durch Zentrifugation bei 112 × g für 5 min. Resuspendieren der Zellen in 1 ml supplementiert hormonellen epithelial Medium (SHEM) gleiche Volumina von HEPES-gepufferter Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium und Ham-F12-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 0,5% Dimethylsulfoxid, 2 ng / ml des humanen epidermalen Wachstumsfaktor, 5 mg / ml Insulin, 5 mg / ml Transferrin, 5 ng / ml Selen, 1 nmol / l des Choleratoxins, 50 mg / ml Gentamicin und 1,25 mg / ml Amphotericin B.
- Seed die Zellen (etwa 1 x 10 5 Zellen pro Auge) in eine 6 cm Schale. Kultur sie in der SHEM. Inkubiere die Schale bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 in Luft. Ändern Sie das Kulturmedium alle 3 Tage.
- Wenn die Zellen Konfluenz erreichen, waschen Sie sie in PBS und Inkubation sie in 1 ml Trypsin bei 37 ° C für 5 min. Sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 112 × g für 5 min. Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml des SHEM.
2. Rat Korneaendothelium cryoinjury Modell und intrakamerale Injection
- Anästhesieren 12 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley Ratten mit intramuskulären Injektionen von 2% Xylazin (5,6 mg / kg) und Tiletamin und Zolazepam (18 mg / kg). kneifen sanft die Haut der Tiere geeignete Anästhesie in Abwesenheit von Haut Zucken zu bestätigen.
- Flößen Sie einen Tropfen von 0,5% Proparacainhydrochlorid dem rechten Auge jeder Ratte Augenschmerzen und Blinzelreflex zu minimieren. einflößenTetracyclin-Salbe auf das linke Auge kornealen Trockenheit zu verhindern.
- Kühlen Sie eine Sonde aus rostfreiem Stahl (Durchmesser = 3 mm) in flüssigem Stickstoff. Tragen Sie die Sonde aus rostfreiem Stahl an die zentrale Hornhaut des rechten Auges für 30 Sekunden. Häufig PBS für das rechte Auge während des Verfahrens zu vermitteln kornealen Trockenheit zu verhindern.
- Instill 0,1% Atropin und 0,3% Gentamicinsulfat unmittelbar nach cryoinjury und einmal täglich Augenschmerzen zu lindern von Ziliarspasmus ergeb und Infektion zu verhindern.
- Nach dem Eingriff halten die Ratten mit einer Heizlampe erwärmen und ihre Genesung alle 15 Minuten nach der Narkose zu beobachten, bis sie Motor wieder die Kontrolle. Zusätzlich Tetracyclin-Salbe auf das rechte Auge gelten für Hornhauttrockenheit während der Erholungsphase zu verhindern.
- Wiederholen Sie die Hornhaut cryoinjury für 3 aufeinander folgenden Tagen.
- Für die Bereitstellung von Marimastat oder bFGF in die vordere Kammer des Rattenaugen, anästhesieren die Ratten, wie vorher beschrieben. Flößen Sie einen Tropfenvon 0,5% Proparacainhydrochlorid in das rechte Auge Augenschmerzen und Blinzelreflex zu minimieren.
- Spülen Sie die Augenoberfläche mit sterilem PBS. Führen Vorderkammer Parazentese unter einem Operationsmikroskop mit einer 30 G-Nadel in eine 1 ml Spritze am paralimbal klare Hornhaut in einer Ebene oberhalb und parallel zu der Iris befestigt Einsetzen.
- Drehen Sie die Nadel Schräge nach oben, und drücken Sie leicht die Hornhautwunde etwas wässrigen Humor und reduzieren den intraokularen Druck abzulassen. Injizieren 0,02 ml des intrakameral Droge. Vorsichtig komprimieren während der Nadel Rückzug der Nadel-Darm-Trakt mit einem Wattestäbchen.
- Fotografieren Sie das äußere Auge bei einer angegebenen Zeitpunkt unter dem Operationsmikroskop.
3. Ernten der Ratte Corneal Knopf und Immunostaining
- Um die Ratten einschläfern, legen Sie sie in einer Euthanasie Kammer und ziehen lassen 100% CO 2 bei einer Füllrate von 10 bis 30% des Kammervolumens pro Minute. Pflegen CO 2 Infusion für eineweitere Minute nach mangelnder Atmung und verblasste Augenfarbe.
- Dringen die Ratte Auge am Limbus mit einer scharfen Klinge. Schneiden Sie die Hornhaut mit Hornhaut-Schere entlang des Limbus. Flatten die Cornea auf einer Folie. Nehmen Sie zusätzliche radiale Einschnitte, wenn die Cornea einrollen.
- Fix die Cornea mit 250 ul 4% Paraformaldehyd, pH 7,4, für 30 min bei Raumtemperatur. Permeabilisieren mit 250 ul 0,5% Triton X-100 für 5 min, und der Block mit 10% Rinderserumalbumin für 30 min.
- Inkubieren der Kornea mit primären Antikörpern gegen ABC über Nacht bei 4 ° C mit einer Verdünnung von 1: 200 in Antikörperverdünnungsmittel. Waschen Sie die Cornea zweimal mit PBS für 15 min, und inkubieren sie mit dem sekundären Antikörper (1: 100 in Antikörperverdünnungsmittel) bei Raumtemperatur für 1 Std. Counterstain den Zellkern, indem die Zellen mit 2 & mgr; g / ml 4 abdeckt ', 6-Diamidino-2-phenylindol und die Zellen zweimal waschen mit PBS für 15 min.
- Montieren Sie die Cornea in der Anti-Fading-Montagelösung. ObTain die Immunfluoreszenz-Bilder bei Anregungswellenlängen von 405 und 561 nm mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop bei 20facher Objektivvergrößerung.
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Representative Results
Nach der Isolierung von Rinder-MEL wurden die Zellen in vitro kultiviert. Abbildung 1 zeigt die Phasenkontrastbilder der Rinder-MEL. Die hexagonale Form der Zellen bei Konfluenz angedeutet , dass die Zellen durch Fibroblasten während der Zellisolierung Hornhaut Stroma nicht kontaminiert wurden. Abbildung 2 zeigt die Immunfärbung , die Antikörper gegen ABC, Schnecke und Schnecke mit in einem angegebenen Zeitpunkt durchgeführt wurde. Abgesehen von phänotypischen Veränderungen in der in vitro Kultur, eine entsprechende nukleäre Translokation von ABC und EMT Regulatoren beobachtet. 3 veranschaulicht die Wirkung von Marimastat, eine Breitspektrum - MMP - Inhibitors auf der ENMT Prozess der in vitro kultivierten bovinen CECs. Figure 4 umfaßt die äußeren Augen Fotografien von Ratten nach cryoinjury durch intracameral Injektion folgte. 5 zeigt die Immunfärbung des r auf der Hornhaut-Taste ausgestattet, wurde unter Verwendung von Antikörpern gegen ABC nach cryoinjury gefolgt von intrakamerale Injektion durchgeführt. Die nukleäre Translokation von ABC wurde in der PBS-Gruppe beobachtet und wurde in der bFGF-Gruppe signifikant erhöht, was auf die Aktivierung der Wnt / β-Catenin-Signalisierung und ENMT Prozess. Nach intracameral Injektion von bFGF durch Marimastat Injektion gefolgt wurde die Kernfärbung der ABC vermindert, was auf die ENMT hemmende Wirkung von Marimastat.
Abb . 1: Phasenkontrast - Bilder von in vitro gezüchteten Rinder-MEL Nachdem auf der Kulturplatte ausgesät werden, die Rinder-MEL zunächst erschien Fibroblasten wie an den Tagen 3 und 6. Sie wurden mehr hexagonal bei Erreichen der vollständigen Konfluenz am Tag 9. Maßstabsbalken = 50 um. Repräsentative Bilder von 3 Replikaten.4329fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Immunfärbung von in vitro gezüchteten Rinder-MEL Während der in - vitro - Kultur des Rinder LME, die nukleäre Translokation von ABC, Schnecke und Schnecken wurde durch Tag erkannt 14. ABC:. Aktive β-Catenin. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Repräsentative Bilder von 3 Replikaten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Immunostaining von in vitro gezüchteten Rinder-MEL mit oder ohne Marimastat bei verschiedenen Zell Einmündung Ebenen Immunostaining Dämonenschaulicht, dass ABC, Schnecke und Schnecke im Kern der Rinder-MEL offensichtlich waren 3. mit oder ohne 10 & mgr; M Marimastat am Tag Marimastat jedoch deutlich reduziert die Kernfärbung von ABC, Schnecke und Schnecke am Tag 9, wenn die Rinder-MEL wurde vollständig konfluent. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Repräsentative Bilder von 3 Replikaten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Externe Auge Fotos von Ratten zu den angegebenen Zeitpunkten nach der cryoinjury Nach cryoinjury für drei aufeinander folgenden Tagen wurden die Ratten zu intrakamerale Injektion von 0,02 ml PBS oder 50 ng / ml bFGF am 3. Am Tag 6 Tag ausgesetzt 0,02 ml 10 & mgr; M Marimastat wurde intrakameral in der bFGF / Mari Gruppe injiziert, während PBS in den anderen 2 Grou injiziert wurdeps (n = 9 in jeder Gruppe). Externe Auge Fotografien ergab Hornhautödems nach bFGF Injektion reduziert, während Marimastat weiter reduziert Hornhautödems verglichen mit bFGF allein. N = 9 in jeder Gruppe. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:. Immunostaining von Rattenhornhautscheibchen Immunostaining der Ratte Hornhautscheibchen, die am Tag geerntet wurden 9 ergab wenig Kernfärbung von ABC in der PBS - Gruppe. In der bFGF-Gruppe gab es umfangreiche Kernfärbung von ABC, die maßgeblich an der bFGF / Mari-Gruppe reduziert wurde. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version von thi zu sehenWert.
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Discussion
CECs sind für ihre Neigung bekannt ENMT während der Zellproliferation zu unterziehen. Entwicklung von Strategien zur Unterdrückung des ENMT Prozess zu therapeutischen Zwecken, ein gründliches Verständnis der ENMT Mechanismus notwendig. Wir 2 beschriebenen Modelle ENMT, nämlich die Rinder-CEC in - vitro - Kulturmodell und Ratte Korneaendothelium cryoinjury Modell zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigten die ENMT Prozess in beiden Modellen. Darüber hinaus wurde die ENMT Unterdrückungseffekt von Marimastat in beiden Modellen wiedergegeben werden, was darauf hindeutet, dass diese zwei Modelle denselben Mechanismus teilen.
Die Rinder-CEC in - vitro - Kultur - Modell bietet eine einfache Manipulation. Zusätzlich, verglichen mit dem menschlichen oder Primaten - CEC in vitro Kulturmodellen in früheren Studien verwendet 17,18 sind Rinderaugen größer und leichter zu erfassen, und damit CECs zur Verfügung haben. In unserer Studie haben wir auf der entkernte Rinderaugen von einem örtlichen Schlachthof. Wegen der fres h Natur der Rinderaugen, die genaue Zahl der Rinder CECs geerntet unterliegt Variation, bei etwa 1 x 10 5 Zellen pro Auge. Im Gegensatz dazu ist die Zahl der menschlichen CECs in einer normalen Hornhaut ungefähr 3 x 10 5 pro Auge. Diese Zahl ist niedriger in der Studie-Grade Cornea und ist sogar noch niedriger Resthornhautränder nach der Transplantation. Manipulationen während des Ernteverfahrens wird weiter die Anzahl der Zellen erhalten reduzieren. Darüber hinaus können Rinder LME vermehren und unterliegen ENMT spontan; Daher ist die bovine CEC in vitro Kulturmodell nützlich , die ENMT Mechanismus bei der Untersuchung und Screening ENMT Unterdrückungs Chemikalien, wie Marimastat. Obwohl es Bedenken bezüglich speziesbedingte Unterschiede, wie die proliferative Kapazität von CECs bleibt zeigte unsere Ergebnisse , dass die ENMT Signalweg von bovinem CECs der von menschlichem CECs ähnlich ist, einschließlich der Aktivierung der Wnt / β-Catenin 18,19.
Zelt "> Während der Isolierung von Rinder-MEL, der Membran Descemet Peeling ist von entscheidender Bedeutung. In einigen Rinderaugen, der Membran Descemet enge Haftung mit dem Hornhautstroma haben kann, auf der geschälten Descemetschen Membran zu einer übermäßigen Stromagewebe führt. Weitere Trypsinierung führen kann die Freisetzung von Stromazellen Keratozyten, die in der Hornhaut Fibroblasten verwandeln, die die Zell Reinheit beeinflussen und damit die experimentellen Ergebnisse. in unserer Studie haben wir die Descemet-Membran sorgfältig unter einem Mikroskop abgezogen. weitere Zell Reinheit zu gewährleisten, kultiviert wir zunächst die geernteten Zellen in einem 6 cm-Schale, bis Zellkonfluenz. Nur wenn die Zellen in Form hexagonal waren, waren sie in weiteren Experimenten verwendet.Um die Ergebnisse der Rinder-CEC in - vitro - Kulturmodell untermauern, haben wir die Ratte Korneaendothelium cryoinjury Modell in früheren Studien angenommen 20,21. Nach cryoinjury unterzog sich die Ratte LME ENMT während der Regeneration, manifested durch die nukleäre Translokation von aktiven β-Catenin, was darauf hinweist, dass die Aktivierung der Wnt / β-Catenin-Signalweg zwischen den Arten bei CEC Regeneration konserviert ist. Darüber hinaus ist dieses Modell nützlich, um die Funktion von MEL untersuchen, weil niedrige CEC-Funktion offensichtlich Hornhautödems führt. In Kombination mit anderen Geräten, wie zum Beispiel Ultraschall biomicroscope, vordere Segment der optischen Kohärenztomographie und konfokaler Mikroskopie kann die Hornhautdicke quantitativ und damit CEC-Funktion widerspiegeln ausgewertet werden.
Um die Regeneration von MEL stimulieren und zu unterdrücken ENMT nach Wundheilung, wir intrakamerale Injektionen von bFGF gefolgt von Marimastat Injektion verabreicht. Die Behandlung reduziert signifikant das Ausmaß der Hornhautödems. Frühere Studien haben die topische Anwendung von CEC wachstumsstimulierende Mittel, wie ROCK - Inhibitor und ENMT Unterdrückungsmittel, wie Notch - Inhibitor 21,22 verwendet. Allerdings lag das Eindringen von Drogen in die CECer wird durch das Hornhautepithel und Stroma beschränkt, die die Wirksamkeit der Behandlung 23 beeinflussen können. Im Gegensatz zur topischen Anwendung ermöglicht intracameral Injektions direkten Zugang zum Hornhautendothel durch Medikamente direkt in die vordere Kammer eingeführt wird. Daher kann die wachstumsstimulierenden und ENMT-unterdrückende Wirkung von Chemikalien unbiasedly cryoinjury folgenden werden bewertet. In unserer Studie führten wir Parazentese Vorderkammer des intraokularen Drucks vor intracameral Injektion zu senken. Ohne Parazentese verursacht eine abrupte Zunahme des intraokularen Drucks Hornhautödem oder sogar Prolaps der Iris durch die Nadelwege. Sanft Komprimieren der Darm-Trakt während Nadel Rückzug Hilfen die Wunde und verhindert intraokularen Infektion in abdichten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trypsin | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium | ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| human epidermal growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insulin, transferrin, selenium | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 111219 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anti-active beta-catenin antibody | Millpore | 05-665 | |
| anti-snail antibody | Santa cruz | sc28199 | |
| anti-slug antibody | Santa cruz | sc15391 | |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11001 | for staining of ABC of bovine CECs |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11003 | for staining of ABC of rat corneal endothelium |
| goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | for staining of snail and slug of bovine CECs |
| antibody diluent | Genemed Biotechnologies | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| laser scanning confocal microscope | ZEISS | LSM510 | |
| xylazine | Bayer | N/A | |
| tiletamine plus zolazepam | Virbac | N/A | veterinary drug |
| proparacaine hydrochloride ophthalmic solution | Alcon | N/A | veterinary drug |
| 0.1% atropine | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | clinical drug |
| 0.3% gentamicin sulfate | Sinphar Group | N/A | clinical drug |
| basic fibroblast growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | clinical drug |
References
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