In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren

Summary

Eine Primärkultur von Rinder Endothelzellen wurde verwendet, um den Mechanismus der Cornea-Endothelzellen-mesenchymale Transition zu untersuchen. Weiterhin wurde eine Ratte Hornhautendothel cryoinjury Modell kornealen Endothel-mesenchymale Transition in vivo zu demonstrieren.

Abstract

Hornhaut-Endothelzellen (CECs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Klarheit der Hornhaut durch aktives Pumpen. Eine verminderte KEK-Zahl kann zu Hornhautödemen und verminderter Sehschärfe führen. Humane KEK sind jedoch anfällig für ein beeinträchtigtes proliferatives Potenzial. Darüber hinaus wird die Stimulation des Zellwachstums oft durch einen allmählichen endothelial-mesenchymalen Übergang (EnMT) erschwert. Daher ist das Verständnis des Mechanismus von EnMT notwendig, um die Regeneration von CECs mit kompetenter Funktion zu erleichtern. In dieser Studie stellten wir eine Primärkultur von Rinder-CECs her, indem wir die CECs mit Descemet-Membran vom Hornhautknopf schälten und zeigten, dass bovine CECs in der In-vitro-Kultur den EnMT-Prozess zeigten, einschließlich phänotypischer Veränderung, nukleärer Translokation von β-Catenin und EMT-Regulatoren Schnecke und Schnecke. Darüber hinaus verwendeten wir ein Kryoverletzungsmodell für Hornhautendothel von Ratten, um den EnMT-Prozess in vivo zu demonstrieren. Insgesamt bietet die in vitro Primärkultur von Rinder-CECs und in vivo Kryoverletzungsmodelle für das Hornhautendothel von Ratten nützliche Plattformen für die Untersuchung des Mechanismus von EnMT.

Introduction

Hornhaut-Endothelzellen (CECs) spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Klarheit der Hornhaut und damit der Sehschärfe, indem sie den Hydratationsstatus des Hornhautstromas durch aktives Pumpen regulieren¹. Aufgrund des begrenzten proliferativen Potenzials menschlicher CECs nimmt die Zellzahl mit zunehmendem Alter ab, und die Reparatur von Hornhautendothelwunden nach einer Verletzung wird in der Regel durch Zellvergrößerung und -migration und nicht durch Zellmitose erreicht². Wenn die CEC-Zahl unter einen Schwellenwert von etwa 500 Zellen/mm^{sinkt 2}, kann der Dehydratisierungsstatus des Hornhautstromas nicht aufrechterh....

Protocol

Alle folgten die Verfahren in dieser Studie mit der Association for Research gewährt in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der National Taiwan University Hospital genehmigt.

1. Isolierung, Primärkultur Vorbereitung, und Immunfärbung von Bovine MEL

1. Erwerben Sie frische Rinderaugen von einem lokalen Schlachthof.
2. Desinfizieren der Augen in einer 10% w / v Povidon-Iod-Lösung für 3 min. Wasche sie mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Lösung.
3. Ernten Sie die Hornhaut-Taste mit einem Skalpell und Schere....

Results

Nach der Isolierung von Rinder-MEL wurden die Zellen in vitro kultiviert. Abbildung 1 zeigt die Phasenkontrastbilder der Rinder-MEL. Die hexagonale Form der Zellen bei Konfluenz angedeutet , dass die Zellen durch Fibroblasten während der Zellisolierung Hornhaut Stroma nicht kontaminiert wurden. Abbildung 2 zeigt die Immunfärbung , die Antikörper gegen ABC, Schnecke und Schnecke mit in einem angegebenen Zeitpunkt durchgeführt wurde. Abgesehen von.......

Discussion

CECs sind für ihre Neigung bekannt ENMT während der Zellproliferation zu unterziehen. Entwicklung von Strategien zur Unterdrückung des ENMT Prozess zu therapeutischen Zwecken, ein gründliches Verständnis der ENMT Mechanismus notwendig. Wir 2 beschriebenen Modelle ENMT, nämlich die Rinder-CEC in - vitro - Kulturmodell und Ratte Korneaendothelium cryoinjury Modell zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigten die ENMT Prozess in beiden Modellen. Darüber hinaus wurde die ENMT Unterdrückungseffekt von Marimast.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco' s modifiziertes Eagle-Medium und Ham's F12-Medium	ThermoFisher Scientific	11330
fötales Rinderserum	ThermoFisher Scientific	26140-079
Dimethylsulfoxid	Sigma	D2650
humaner epidermaler Wachstumsfaktor	ThermoFisher Scientific	PHG0311
Insulin, Transferrin, Selen & nbsp;	ThermoFisher Scientific	41400-045
Choleratoxin	Sigma	C8052-1MG
Gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750-060
Amphotericin B	ThermoFisher Scientific	15290-026
Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie Sciences	111219
Triton X-100	Sigma	T8787
Rinderserumalbumin	Sigma	A7906
Marimastat	Sigma	M2699-25MG
antiaktiver Beta-Catenin-Antikörper	Millpore	05-665
Anti-Schnecken-Antikörper	Santa cruz	sc28199
Anti-Schnecken-Antikörper	Santa cruz	sc15391
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) sekundär Antikörper	ThermoFisher Scientific	A-11001	für die Färbung von ABC von Rindern,
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L), Sekundärantikörper	ThermoFisher Scientific	A-11003	für die Färbung von ABC von Ratten, Hornhautendothel
, Ziege Anti-Kaninchen-IgG (H+L), Sekundärantikörper	ThermoFisher Scientific	A-11008	für die Färbung von Schnecken und Nacktschnecken von Rindern, CECs,
Antikörperverdünnungsmittel	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-Diamidino-2-phenylindol	ThermoFisher Scientific	D1306
Einbettmedium	Vector Laboratories	H-1000
konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	ZEISS	LSM510
Xylazin &	Bayer	N/A
Tiletamin plus Zolazepam	Virbac	N/A	Tierarzneimittel
Proparacainhydrochlorid ophthalmische Lösung	Alcon	N/A	Tierarzneimittel
0,1% Atropin	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	klinisches Medikament
0,3% Gentamicinsulfat	Sinphar Group	N/A	klinisches Medikament
basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor	ThermoFisher Scientific	PHG0024	klinisches Medikament