Summary
Een primaire kweek van runder corneale endotheelcellen werd gebruikt om het mechanisme van corneale endotheel-mesenchymale overgang te onderzoeken. Verder werd een rat hoornvliesendotheel cryoinjury model gebruikt om corneale endotheel-mesenchymale overgang in vivo te demonstreren.
Protocol
Al de gevolgde procedures in deze studie overeenkomen met de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde Verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Geluid Onderzoek en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de National Taiwan University Hospital.
1. Isolatie, Primary Cultuur Voorbereiding en Immunokleuring van Bovine CECs
- Verwerven van vers vlees van runderen ogen van een lokale slachthuis.
- Desinfecteren ogen in een 10% w / v povidon-joodoplossing gedurende 3 min. Wassen met zoutoplossing (PBS) oplossing fosfaatgebufferde.
- Oogst de corneale knoop met een scalpel en schaar onder steriele omstandigheden. Verwijder het membraan van Descemet met een tang onder een stereomicroscoop (merk op dat in deze studie werden runderen ogen enucleated door plaatselijk slachthuis, dus de eerste studie procedure desinfectie van de preenucleated ogen in het laboratorium).
- Incubeer de membraan van Descemet in 1 ml trypsin bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Verzamel de runder LME door centrifugatie bij 112 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cellen in 1 ml aangevuld hormonale epitheliale medium (SHEM) die gelijke hoeveelheden van HEPES-gebufferde Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium en Ham's F12 medium, aangevuld met 5% foetaal runderserum, 0,5% dimethylsulfoxide, 2 ng / ml humaan epidermale groeifactor, 5 mg / ml insuline, 5 mg / ml transferrine, 5 ng / ml seleen, 1 nmol / l choleratoxine, 50 mg / ml gentamycine en 1,25 mg / ml amfotericine B.
- Zaad de cellen (ongeveer 1 x 10 5 cellen per oog) in een 6 cm schotel. Cultuur hen in de SHEM. Incubeer de schotel bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 in lucht. Verander het kweekmedium om de 3 dagen.
- Wanneer de cellen samenvloeiing bereiken, wassen in PBS en incubeer ze in 1 ml trypsine bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Verzamelen door centrifugatie bij 112 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cel pellet in 1 ml van de SHEM.
2. Rat hoornvliesendotheel Cryoinjury Model en intracamerale Injection
- Verdoven 12 weken oude mannelijke Sprague-Dawley ratten met intramusculaire injecties van 2% xylazine (5,6 mg / kg) en tiletamine plus zolazepam (18 mg / kg). Knijp voorzichtig in de huid van de dieren om de juiste verdoving in de afwezigheid van de huid spiertrekkingen bevestigen.
- Inboezemen een daling van 0,5% proparacaïne hydrochloride aan het rechter oog van elke rat om pijn aan de ogen en de knipperreflex minimaliseren. inboezementetracycline zalf het linkeroog cornea voorkomen droogheid.
- Afkoelen een roestvrij stalen sonde (diameter = 3 mm) in vloeibare stikstof. Breng de roestvrij stalen sonde naar de centrale cornea van het rechteroog voor 30 sec. Vaak druppelen PBS rechts oog tijdens de procedure corneale uitdroging te voorkomen.
- Inboezemen 0,1% atropine en 0,3% gentamicinesulfaat onmiddellijk na cryoinjury en eenmaal daags oculaire pijn als gevolg van ciliaire spasmen te verlichten en om infectie te voorkomen.
- Na de procedure, blijven de ratten te verwarmen met behulp van een warmtelamp, en observeer hun herstel om de 15 min na de anesthesie totdat ze motorische controle te herwinnen. Bijkomend nemen tetracycline zalf op het rechteroog hoornvlies droog tijdens de herstelperiode voorkomen.
- Herhaal het corneale cryoinjury gedurende 3 opeenvolgende dagen.
- Voor het afgeven marimastat of bFGF in de voorste kamer van de rat ogen verdoven de ratten zoals eerder beschreven. Inboezemen één druppelvan 0,5% proparacaïne hydrochloride in het rechter oog in oog pijn en het knipperen reflex een minimum te beperken.
- Irrigeren het oogoppervlak met steriele PBS. Voer voorste kamer paracentesis onder een operatiemicroscoop door het met een 30 G naald bevestigd aan een 1 ml spuit op paralimbal heldere cornea in een vlak boven en evenwijdig aan de iris.
- Draai de naald bevel op, en iets druk het hoornvlies wond om wat waterig vocht af te voeren en de intra-oculaire druk te verminderen. Injecteren 0,02 ml van het geneesmiddel intracamerally. Voorzichtig comprimeren van de naald-darmkanaal met een wattenstaafje in de loop van de naald terugtrekken.
- Fotografeer de externe oog op een aangegeven tijdstip in het kader van het operationele microscoop.
3. Het oogsten van de Rat cornea knop en Immunokleuring
- Om de ratten euthanaseren, plaats ze in een euthanasie kamer en bezielen 100% CO 2 bij een fill rate van 10-30% van de kamer volume per minuut. Handhaaf CO 2 infuus voor eenextra minuten na het ontbreken van ademhaling en vervaagde oogkleur.
- Doordringen in de rat oog op de limbus met een scherp mes. Snijd de hoornvliezen met hoornvlies een schaar langs de limbus. Strijk het hoornvlies op een dia. Maak extra radiale incisies als de hoornvliezen opkrullen.
- Bevestig de cornea met 250 ui 4% paraformaldehyde, pH 7,4, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Permeabilize met 250 pl 0,5% Triton X-100 gedurende 5 minuten, en blokkeren met 10% runderserum albumine gedurende 30 minuten.
- Incubeer de cornea met primaire antilichamen tegen ABC overnacht bij 4 ° C met een verdunning van 1: 200 in antilichaam verdunningsmiddel. Was de cornea tweemaal met PBS gedurende 15 minuten en incubeer ze met het secundaire antilichaam (1: 100 in antilichaamverdunningsmiddel) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Tegenkleuring de celkern door het bedekken van de cellen met 2 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol, en was de cellen tweemaal met PBS gedurende 15 minuten.
- Monteer de hoornvliezen in anti-fading montage oplossing. obtain de immunofluorescentie beelden op golflengten van 405 en 561 nm met een laser scanning confocale microscoop bij 20X objectiefvergroting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na de isolatie van runderen CECs, de cellen werden gekweekt in vitro. Figuur 1 toont de fasecontrastbeelden van runderen LME. De zeshoekige vorm van de cellen op confluentie aangegeven dat de cellen niet werden aangetast door corneale stromale fibroblasten gedurende celisolatie. Figuur 2 toont de immunokleuring die werd uitgevoerd met antilichamen tegen ABC, slak en slak op een aangegeven tijdstip. Naast fenotypische veranderingen in het in vitro kweek, een overeenkomstige nucleaire translocatie van ABC en EMT regulatoren waargenomen. Figuur 3 illustreert het effect van marimastat, een breed-spectrum MMP inhibitor op EnMT werkwijze van de in vitro gekweekte runder LME. Figuur 4 omvat het uitwendige oog foto van ratten na cryoinjury gevolgd door intracamerale injectie. Figuur 5 toont de immunokleuring van de r bij cornea knop die werd uitgevoerd met antilichamen tegen ABC na cryoinjury gevolgd door intracamerale injectie. De nucleaire translocatie van ABC werd waargenomen in de PBS groep en was significant verhoogd in de bFGF groep aangeeft activatie van de Wnt / β-catenine signalering en EnMT proces. Na intracamerale injectie van bFGF gevolgd door marimastat injectie, de nucleaire kleuring van ABC was verminderd, wat suggereert dat de EnMT-remmende effect van marimastat.
Figuur 1:. Fase contrastrijke beelden van in vitro gekweekte runderen LME Na te zijn geënt op de cultuur plaat, runderen ME-landen leek aanvankelijk fibroblast-achtige op dag 3 en 6. Ze werden meer zeshoekige bij het bereiken van volledige samenvloeiing op dag 9. Schaal bar = 50 urn. Representatieve beelden van 3 herhalingen.4329fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Immunokleuring van in vitro gekweekte runderen CECs Gedurende de in vitro cultuur van de runderen LME, de nucleaire translocatie van ABC, slak en naaktslak werd opgespoord door middel van de dag 14. ABC:. Actieve β-catenine. Schaal bar = 100 micrometer. Representatieve beelden van 3 herhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Immunokleuring van in vitro gekweekte runderen LME met of zonder marimastat op verschillende cel samenloop niveaus Immunokleuring demonentreerde dat ABC, slak en naaktslak waren duidelijk in de kern van runderen LME met of zonder 10 pM van marimastat op dag 3. Echter, marimastat significante vermindering van het nucleaire kleuring van ABC, slak en slak op dag 9 bij runderen LME werd volledig confluent. Schaal bar = 100 micrometer. Representatieve beelden van 3 herhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Extern oog foto ratten bij bepaalde tijdstippen na cryoinjury Na cryoinjury gedurende 3 opeenvolgende dagen werden de ratten onderworpen aan intracamerale injectie van 0,02 ml PBS of 50 ng / ml bFGF op dag 3. Op dag 6, 0,02 ml 10 uM marimastat werd intracamerally geïnjecteerd in de bFGF / Mari groep, terwijl PBS in de andere 2 grou werd geïnjecteerdps (n = 9 in elke groep). Externe oog foto's werden verminderde hoornvliesoedeem bFGF na injectie, terwijl marimastat verder verminderd hoornvliesoedeem vergelijking met bFGF alleen. N = 9 in elke groep. Schaal bar = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Immunokleuring van de rat cornea knoppen Immunokleuring van de rat cornea knoppen die op dag 9 werden geoogst onthuld kleine nucleaire kleuring van ABC in de PBS-groep. In de bFGF-groep, was er een uitgebreide nucleaire kleuring van ABC, die aanzienlijk in de bFGF / Mari groep werd verminderd. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van thi bekijkens figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ME-landen staan bekend om hun neiging om EnMT ondergaan tijdens cel proliferatie. Strategieën te ontwikkelen voor het onderdrukken van de EnMT werkwijze voor therapeutische doeleinden, een grondig begrip van de EnMT mechanisme noodzakelijk. We beschreven 2 modellen om EnMT, namelijk het runder CEC in vitro cultuur model en rat hoornvliesendotheel cryoinjury model te onderzoeken. Onze resultaten toonden de EnMT proces in beide modellen. Bovendien is de EnMT-onderdrukkende effect van marimastat werd opgenomen in beide modellen, suggereert dat deze 2 modellen hebben hetzelfde mechanisme.
De runderen CEC in vitro cultuur model biedt het gemak van manipulatie. In vergelijking met de menselijke of primaten CEC in vitro cultuurmodellen toegepast in eerdere studies 17,18, runder ogen groter en eenvoudiger te verkrijgen en derhalve meer LME beschikbaar. In onze studie hebben we verwierf de ontkernde runderen ogen van een lokale slachthuis. Vanwege de FRES h aard van de runderen ogen, het exacte aantal runderen CECs geoogst is onderhevig aan variatie, op ongeveer 1 x 10 5 cellen per oog. Daarentegen is het aantal menselijke CECs in een normale cornea ongeveer 3 x 10 5 per oog. Dit aantal is lager in onderzoek-grade hoornvliezen en nog lager in de resterende cornea velgen na transplantatie. Manipulaties tijdens de oogstprocedure verder verminderen van het aantal cellen verkregen. Bovendien kan runder LME groeien en spontaan ondergaan EnMT; Daarom runderen CEC in vitro kweek model is nuttig bij het onderzoeken van het mechanisme EnMT en screening EnMT-onderdrukkende stoffen zoals marimastat. Hoewel er zorg blijft over species-gerelateerde verschillen, zoals de proliferatieve capaciteit van CECs Onze resultaten toonden dat de EnMT signaleringsroute boviene CECs is vergelijkbaar met die van menselijke LME, waaronder de activering van Wnt / β-catenine 18,19.
tent "> Tijdens de isolatie van runderen LME, het schillen van de membraan van Descemet is van cruciaal belang. In sommige runderen ogen, kan de membraan van Descemet strakke adhesie hebben met het hoornvlies stroma, wat leidt tot overmatige stromale weefsel aan de geschilde membraan van Descemet. Verdere behandeling met trypsine kan leiden tot de afgifte van stromale keratocyten die veranderen in corneale fibroblasten, welke cel zuiverheid beïnvloeden en derhalve de experimentele resultaten. in onze studie hebben we gepeld het membraan van Descemet voorzichtig onder een microscoop. Om verder te zorgen cel zuiverheid we eerst gekweekt de geoogste cellen in een 6 cm schaaltje totdat celconfluentie. Alleen wanneer de cellen zeshoekig van vorm waren gebruikt in verdere experimenten.Om verder te onderbouwen de bevindingen van de runderen CEC cultuur in vitro model, gebruikten we de rat cornea endotheel cryoinjury model in eerdere studies 20,21 aangenomen. Na cryoinjury, de rat LME onderging EnMT tijdens de regeneratie, manifested door de nucleaire translocatie van actieve β-catenine, wat aangeeft dat activering van Wnt / β-catenine signalering tussen soorten is geconserveerd in CEC regeneratie. Daarnaast is dit model bruikbaar bij onderzoeken van de functie van LME omdat lage CEC functie leidt tot duidelijke hoornvliesoedeem. In combinatie met andere apparatuur, zoals echografie biomicroscoop voorste segment optische coherentie tomografie, en confocale microscopie, kan het hoornvlies dikte kwantitatief worden geëvalueerd en weerspiegelen dus CEC-functie.
De regeneratie van LME stimuleren en onderdrukken EnMT na wondgenezing, we toegediend intracamerale injectie van bFGF gevolgd door marimastat injectie. De verminderde significant de mate van hoornvliesoedeem. Eerdere studies hebben de plaatselijke toepassing van CEC-groei stimulerende middelen, zoals ROCK-remmer, en EnMT-onderdrukkende middelen, zoals Notch inhibitor 21,22 gebruikt. Echter, de penetratie van drugs in de CEC te leggener wordt beperkt door het corneale epitheel en stroma, die de werkzaamheid van de behandeling 23 kan beïnvloeden. In tegenstelling tot topicale toepassing, intracamerale injectie maakt directe toegang tot het corneale endotheel door invoering geneesmiddelen direct in de voorste kamer. Daarom kan de groei te stimuleren en te EnMT-onderdrukkende effect van chemicaliën unbiasedly worden ingedeeld volgens cryoinjury. In ons onderzoek voerden wij voorste oogkamer paracentese de intraoculaire druk voor intracamerale injectie verlagen. Zonder paracentesis, een abrupte stijging van de intra-oculaire druk veroorzaakt cornea-oedeem of zelfs verzakking van de iris door de naald-darmkanaal. Voorzichtig het comprimeren van de luchtwegen tijdens de naald terugtrekken helpt bij het afdichten van de wond en het voorkomen van intra-oculaire infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trypsin | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium | ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| human epidermal growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insulin, transferrin, selenium | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 111219 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anti-active beta-catenin antibody | Millpore | 05-665 | |
| anti-snail antibody | Santa cruz | sc28199 | |
| anti-slug antibody | Santa cruz | sc15391 | |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11001 | for staining of ABC of bovine CECs |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11003 | for staining of ABC of rat corneal endothelium |
| goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | for staining of snail and slug of bovine CECs |
| antibody diluent | Genemed Biotechnologies | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| laser scanning confocal microscope | ZEISS | LSM510 | |
| xylazine | Bayer | N/A | |
| tiletamine plus zolazepam | Virbac | N/A | veterinary drug |
| proparacaine hydrochloride ophthalmic solution | Alcon | N/A | veterinary drug |
| 0.1% atropine | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | clinical drug |
| 0.3% gentamicin sulfate | Sinphar Group | N/A | clinical drug |
| basic fibroblast growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | clinical drug |
References
- Maurice, D. M. The location of the fluid pump in the cornea. J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).
- Joyce, N.
- Morishige, N., Sonoda, K. H. Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies. Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).
- Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report. Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).
- Wilson, S. E., Lloyd, S. A. Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).
- Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).
- Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).
- Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. Growth of human corneal endothelial cells in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).
- Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview. Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).
- Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors. Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).
- Ko, M. K., Kay, E. P. Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).
- Lee, H. T., Kay, E. P. FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells. Mol Vis. 9, 624-634 (2003).
- Pipparelli, A., et al. ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells. PloS one. 8 (4), e62095 (2013).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Jakobiec, F. A., Bhat, P. Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins. Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).
- Okumura, N., et al. Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).
- Okumura, N., et al. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).
- Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions. J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).
- Ho, W. T., et al. Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).
- Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).
- Li, C., et al. Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).
- Okumura, N., et al. The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).
- Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics. Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).
