Summary
गोजातीय कॉर्निया endothelial कोशिकाओं के एक प्राथमिक संस्कृति कार्निया endothelial-mesenchymal संक्रमण की व्यवस्था की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, एक चूहे कार्निया endothelium cryoinjury मॉडल विवो में कार्निया endothelial-mesenchymal संक्रमण प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
Protocol
सभी प्रक्रियाओं इस अध्ययन नेत्र और विजन रिसर्च में जानवरों के इस्तेमाल के लिए विजन और नेत्र विज्ञान वक्तव्य में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन के साथ दी पर पीछा किया और नेशनल ताइवान विश्वविद्यालय अस्पताल के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. अलगाव, प्राथमिक संस्कृति तैयार करना, और गोजातीय सीईसी की Immunostaining
- एक स्थानीय वधशाला से ताजा गोजातीय आंखों मोल।
- 3 मिनट के लिए एक 10% w / v povidone आयोडीन के घोल में आंखों कीटाणुरहित। उन्हें फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान के साथ धो लें।
- बाँझ शर्तों के तहत एक छुरी और कैंची से कार्निया बटन हार्वेस्ट। एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत संदंश के साथ पील Descemet की झिल्ली (ध्यान दें कि इस अध्ययन में, गोजातीय आँखें एक स्थानीय वधशाला द्वारा enucleated कर रहे थे, इसलिए पहला अध्ययन प्रक्रिया प्रयोगशाला में preenucleated आंखों की कीटाणुशोधन था)।
- कोशिश के 1 मिलीलीटर में Descemet की झिल्ली सेते30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर psin। 5 मिनट के लिए 112 XG पर centrifugation द्वारा गोजातीय सीईसी लीजिए। पूरक हार्मोनल उपकला मध्यम (शेम) HEPES बफर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम और हाम F12 मध्यम, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, 0.5% डाइमिथाइल sulfoxide, मानव एपिडर्मल के 2 एनजी / एमएल के बराबर मात्रा युक्त के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend वृद्धि कारक, 5 मिलीग्राम / इंसुलिन की मिलीलीटर, 5 मिलीग्राम / transferrin मिलीलीटर, 5 एनजी / सेलेनियम की मिलीलीटर, 1 nmol / हैजा विष के एल, 50 मिलीग्राम / जेंटामाइसिन मिलीलीटर, और 1.25 मिलीग्राम / amphotericin बी के मिलीलीटर
- एक 6 सेमी डिश में कोशिकाओं (लगभग 1 x 10 5 आंख प्रति कोशिकाओं) बीज। उन्हें शेम में संस्कृति। हवा में 5% सीओ 2 के माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर पकवान सेते हैं। संस्कृति के माध्यम से परिवर्तन हर 3 दिन।
- कोशिकाओं संगम तक पहुँचते हैं, उन्हें पीबीएस में धोने के लिए और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर trypsin के 1 मिलीलीटर में उन्हें सेते हैं। 5 मिनट के लिए 112 XG पर centrifugation द्वारा उन्हें इकट्ठा। शेम के 1 मिलीलीटर में सेल गोली फिर से निलंबित।
2. चूहा कॉर्नियल अन्तःस्तर Cryoinjury मॉडल और Intracameral इंजेक्शन
- 2% xylazine (5.6 मिलीग्राम / किग्रा) और tiletamine प्लस zolazepam (/ किलो 18 मिलीग्राम) के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ 12 सप्ताह के एक पुरुष Sprague-Dawley चूहों anesthetize। धीरे त्वचा हिल के अभाव में उचित संज्ञाहरण पुष्टि करने के लिए जानवरों की त्वचा चुटकी।
- प्रत्येक चूहे की दाहिनी आंख के लिए 0.5% proparacaine हाइड्रोक्लोराइड की एक बूंद टपकाना आंख में दर्द और झपकी पलटा कम से कम। टपकानाबाईं आंख के लिए टेट्रासाइक्लिन मरहम कार्निया सूखापन को रोकने के लिए।
- तरल नाइट्रोजन में एक स्टेनलेस स्टील जांच (व्यास = 3 मिमी) शांत। 30 सेकंड के लिए दाहिनी आंख के केंद्रीय कॉर्निया के लिए स्टेनलेस स्टील के मामले की जांच को लागू करें। अक्सर पूछे जाने वाले कार्निया सूखापन को रोकने के लिए प्रक्रिया के दौरान दाहिनी आंख के लिए पीबीएस टपकाना।
- तुरंत cryoinjury के बाद 0.1% और 0.3% atropine जेंटामाइसिन सल्फेट टपकाना और दैनिक एक बार आंख सिलिअरी ऐंठन से उत्पन्न दर्द को दूर करने के लिए और संक्रमण को रोकने के लिए।
- प्रक्रिया के बाद, रख चूहों एक गर्मी दीपक का उपयोग कर गर्म है, और संज्ञाहरण के बाद उनके वसूली हर 15 मिनट का निरीक्षण जब तक वे मोटर नियंत्रण हासिल। इसके अतिरिक्त, वसूली की अवधि के दौरान कार्निया सूखापन को रोकने के लिए दाहिनी आंख के लिए टेट्रासाइक्लिन मरहम लागू होते हैं।
- लगातार 3 दिन के लिए कार्निया cryoinjury दोहराएँ।
- चूहे आँखों के पूर्वकाल कक्ष में marimastat या bFGF पहुंचाने के लिए, चूहों के रूप में पहले से वर्णित anesthetize। एक बूंद टपकानादाहिनी आंख में 0.5% proparacaine हाइड्रोक्लोराइड की आंख में दर्द और झपकी पलटा कम से कम।
- बाँझ पीबीएस के साथ सतह नेत्र सिंचाई। आईरिस के लिए ऊपर और समानांतर एक विमान में paralimbal स्पष्ट कॉर्निया में एक 30 जी सुई एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी डालने से एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत पूर्वकाल कक्ष paracentesis प्रदर्शन करना।
- सुई अप उठाव कर दें, और थोड़ा कुछ जलीय हास्य नाली और intraocular दबाव को कम करने के लिए कॉर्निया घाव दबाना। intracamerally दवा के 0.02 मिलीलीटर इंजेक्षन। धीरे सुई वापसी के दौरान एक कपास टिप के साथ सुई पथ सेक।
- ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत एक संकेत समय बिंदु पर बाहरी आंख की तस्वीर।
3. कटाई चूहा कॉर्नियल बटन और immunostaining
- चूहों euthanize करने के लिए, उन्हें एक इच्छामृत्यु कक्ष में डाल दिया है और प्रति मिनट चैम्बर मात्रा का 10-30% की एक भरने दर पर 100% सीओ 2 दिखे। को बनाए रखने के लिए एक सीओ 2 निषेचनश्वसन की कमी और फीका आँख का रंग बाद अतिरिक्त मिनट।
- एक तेज ब्लेड के साथ किनारी पर चूहे आँख घुसना। किनारी साथ कार्निया कैंची से कॉर्निया कट। एक स्लाइड पर कॉर्निया समतल। यदि कॉर्निया कर्ल अतिरिक्त रेडियल चीरों बनाओ।
- 4% paraformaldehyde के 250 μl, पीएच 7.4 से कॉर्निया को ठीक करें, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए। 5 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन X-100 के 250 μl के साथ permeabilize, और 30 मिनट के लिए 10% गोजातीय सीरम albumin के साथ ब्लॉक।
- एंटीबॉडी मंदक में 200: 1 के कमजोर पड़ने के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एबीसी के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कॉर्निया सेते हैं। 15 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो बार कॉर्निया धो लें, और उन्हें माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं: 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर (1 100 एंटीबॉडी मंदक में)। 4 में से 2 माइक्रोग्राम / एमएल ', 6-diamidino-2-phenylindole के साथ कोशिकाओं को कवर द्वारा सेल नाभिक, और 15 मिनट के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो Counterstain।
- बढ़ते समाधान विरोधी लुप्त होती में कॉर्निया माउंट। ओबी20X उद्देश्य बढ़ाई पर एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन के साथ 405 की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में immunofluorescent छवियों और 561 एनएम टाइन।
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Representative Results
गोजातीय सीईसी के अलगाव के बाद, कोशिकाओं इन विट्रो में सुसंस्कृत थे। चित्रा 1 गोजातीय सीईसी के चरण विपरीत छवियों को प्रस्तुत करता है। संगम पर कोशिकाओं के हेक्सागोनल आकार का संकेत दिया। कोशिकाओं है कि सेल अलगाव के दौरान कार्निया stromal fibroblast से दूषित नहीं कर रहे थे चित्रा 2 दर्शाया गया है immunostaining है कि एक संकेत समय बिंदु पर के खिलाफ एबीसी, घोंघा, और काउंटर एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। इसके अलावा इन विट्रो संस्कृति में प्ररूपी परिवर्तन से, एबीसी और EMT नियामकों की एक इसी परमाणु translocation मनाया गया। चित्रा 3 marimastat का प्रभाव है, एक व्यापक स्पेक्ट्रम एमएमपी अवरोध, इन विट्रो सुसंस्कृत गोजातीय सीईसी की EnMT प्रक्रिया पर दिखाता है। चित्रा 4 intracameral इंजेक्शन द्वारा पीछा cryoinjury के बाद चूहों के बाहरी आंख फोटोग्राफ शामिल हैं। चित्रा 5 आर के immunostaining से पता चलता कार्निया बटन पर कि intracameral इंजेक्शन द्वारा पीछा cryoinjury के बाद एबीसी के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। एबीसी के परमाणु translocation पीबीएस समूह में मनाया गया था और काफी bFGF समूह में वृद्धि की गई थी, wnt / β-catenin संकेतन और EnMT प्रक्रिया के क्रियान्वयन के संकेत मिलते हैं। बाद bFGF के intracameral इंजेक्शन marimastat इंजेक्शन द्वारा पीछा किया, एबीसी के परमाणु धुंधला कम हो गया था, marimastat की EnMT बाधा प्रभाव का सुझाव दे।
चित्रा 1:। दिन 3 और 6 पर की इन विट्रो सुसंस्कृत गोजातीय सीईसी संस्कृति की थाली पर वरीयता प्राप्त किया जा रहा करने के बाद, गोजातीय सीईसी शुरू में छपी चरण विपरीत छवियों fibroblast-जैसे वे दिन 9. स्केल पट्टी पर पूरा संगम पर पहुंचने पर अधिक हेक्सागोनल बन = 50 माइक्रोन। 3 प्रतिकृति की प्रतिनिधि छवियाँ।4329fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। सक्रिय β-catenin: इन विट्रो सुसंस्कृत गोजातीय सीईसी गोजातीय सीईसी, एबीसी, घोंघा, और काउंटर के परमाणु स्थानान्तरण के इन विट्रो संस्कृति के दौरान दिन के 14. एबीसी के माध्यम से पता चला था की Immunostaining। स्केल बार = 100 माइक्रोन। 3 प्रतिकृति की प्रतिनिधि छवियाँ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। के साथ या अलग सेल संगम स्तरों पर marimastat बिना इन विट्रो सुसंस्कृत गोजातीय सीईसी की Immunostaining Immunostaining राक्षसोंtrated कि एबीसी, घोंघा, और काउंटर के साथ या 10 माइक्रोन हालांकि 3. दिन पर marimastat के बिना गोजातीय सीईसी के नाभिक में स्पष्ट किया गया है, marimastat काफी दिन 9 जब गोजातीय सीईसी पर एबीसी, घोंघा के परमाणु धुंधला हो जाना, और काउंटर कम हो पूरी तरह से मिला हुआ बन गया। स्केल बार = 100 माइक्रोन। 3 प्रतिकृति की प्रतिनिधि छवियाँ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:। बाहरी आंख cryoinjury के बाद संकेत समय बिंदुओं पर चूहों की तस्वीरें लगातार 3 दिनों के लिए cryoinjury के बाद, चूहों intracameral इंजेक्शन के लिए पीबीएस के 0.02 मिलीलीटर या 50 की एनजी / एमएल bFGF 3. दिन 6 दिन पर, 0.02 मिलीग्राम के अधीन थे 10 माइक्रोन marimastat, bFGF / मारी समूह में intracamerally इंजेक्ट किया गया था, जबकि अन्य 2 पीबीएस चल मैदान में इंजेक्ट किया गया थापी एस (एन = प्रत्येक समूह में 9)। बाहरी आंख फोटो, bFGF इंजेक्शन के बाद कॉर्निया शोफ कम किया जबकि marimastat आगे कम कार्निया शोफ अकेले n = प्रत्येक समूह में 9 bFGF के साथ तुलना में। पता चला। स्केल बार = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5:। चूहे कार्निया बटन के Immunostaining चूहे कार्निया बटन है कि 9 दिन पर काटा गया की Immunostaining पीबीएस समूह में एबीसी के छोटे परमाणु धुंधला का पता चला। bFGF समूह में, वहाँ एबीसी, जो काफी bFGF / मारी समूह में कम हो गया था की व्यापक परमाणु धुंधला था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। Thi का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंएस आंकड़ा।
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Discussion
सीईसी उनकी प्रवृत्ति सेल प्रसार के दौरान EnMT से गुजरना करने के लिए जाना जाता है। चिकित्सकीय प्रयोजनों के लिए EnMT प्रक्रिया को दबाने के लिए रणनीति विकसित करने के लिए, EnMT तंत्र की गहन समझ के लिए आवश्यक है। हम 2 मॉडल वर्णित EnMT, इन विट्रो संस्कृति मॉडल और चूहे कार्निया endothelium cryoinjury मॉडल में अर्थात् गोजातीय सीईसी की जांच करने के लिए। हमारे परिणाम दोनों मॉडलों में EnMT प्रक्रिया का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, marimastat की EnMT-दबा प्रभाव दोनों मॉडलों में reproduced किया गया था, सुझाव है कि इन 2 मॉडल ही तंत्र का हिस्सा है।
इन विट्रो संस्कृति मॉडल में गोजातीय सीईसी में गड़बड़ी की आसानी प्रदान करता है। इसके अलावा, पिछले अध्ययनों 17,18 में कार्यरत इन विट्रो संस्कृति मॉडल में मानव या रहनुमा सीईसी के साथ तुलना में, गोजातीय आंखें बड़ी और प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं, और इस प्रकार अधिक सीईसी उपलब्ध है। हमारे अध्ययन में, हम एक स्थानीय वधशाला से enucleated गोजातीय आंखों हासिल कर ली। क्योंकि fres की गोजातीय आंखों की ज प्रकृति, काटा गोजातीय सीईसी की सही संख्या भिन्नता के अधीन है, आंख के अनुसार लगभग 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं पर। इसके विपरीत, एक सामान्य कॉर्निया में मानव सीईसी की संख्या आंख के अनुसार लगभग 3 एक्स 10 5 है। यह संख्या अध्ययन ग्रेड कॉर्निया में कम है और प्रत्यारोपण के बाद अवशिष्ट कार्निया रिम्स में भी कम है। कटाई की प्रक्रिया के दौरान जोड़तोड़ आगे प्राप्त कोशिकाओं की संख्या कम हो जाएगा। इसके अलावा, गोजातीय सीईसी पैदा करना और अनायास EnMT गुजरना कर सकते हैं; इसलिए, इन विट्रो संस्कृति मॉडल में गोजातीय सीईसी EnMT तंत्र की जांच कर रही है और इस तरह के रूप में marimastat EnMT-दबा रसायन, स्क्रीनिंग में उपयोगी है। वहाँ के बारे में इस तरह की सीईसी की proliferative क्षमता के रूप में प्रजातियों से संबंधित मतभेद, चिंता का विषय बनी हुई है हालांकि, हमारे परिणाम दिखा दिया है कि गोजातीय सीईसी की EnMT संकेतन मार्ग Wnt / β-catenin 18,19 के सक्रियण सहित मानव सीईसी, के समान है।
तम्बू "> गोजातीय सीईसी के अलगाव के दौरान, Descemet की झिल्ली छीलने महत्वपूर्ण है। कुछ गोजातीय आँखों में, Descemet की झिल्ली कार्निया स्ट्रोमा के साथ तंग आसंजन हो सकता है, खुली Descemet की झिल्ली पर अत्यधिक stromal ऊतक के लिए अग्रणी। इसके अलावा trypsinization को जन्म दे सकती stromal keratocytes कि कार्निया fibroblasts, जो सेल पवित्रता प्रभावित करते हैं और इसलिए प्रयोगात्मक परिणाम है। हमारे अध्ययन में, हम Descemet की झिल्ली ध्यान से एक खुर्दबीन के नीचे खुली में बदलना। आगे सेल शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए की रिहाई, हम पहली बार एक 6 में काटा कोशिकाओं सुसंस्कृत सेमी डिश सेल संगम तक। केवल जब कोशिकाओं के आकार में हेक्सागोनल थे, वे आगे के प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया।आगे इन विट्रो संस्कृति मॉडल में गोजातीय सीईसी के निष्कर्षों को पुष्ट करने के लिए, हम चूहे कार्निया endothelium cryoinjury मॉडल पिछले अध्ययनों 20,21 में अपनाया इस्तेमाल किया। cryoinjury बाद, चूहे सीईसी उत्थान, manife दौरान EnMT कराना पड़ासक्रिय β-catenin के परमाणु translocation द्वारा sted, यह दर्शाता है कि Wnt / β-catenin संकेतन की सक्रियता के मुख्य चुनाव आयुक्त उत्थान के दौरान प्रजातियों के बीच संरक्षित है। इसके अलावा, इस मॉडल सीईसी के समारोह की जांच में उपयोगी है क्योंकि कम सीईसी समारोह स्पष्ट कार्निया शोफ की ओर जाता है। ऐसे अल्ट्रासाउंड biomicroscope, पूर्वकाल खंड ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी, और confocal माइक्रोस्कोपी के रूप में अन्य उपकरणों, के साथ संयुक्त, कार्निया मोटाई मात्रात्मक मूल्यांकन किया जा सकता है और इस तरह सीईसी समारोह दर्शाते हैं।
सीईसी के उत्थान को प्रोत्साहित और घाव भरने के बाद EnMT को दबाने के लिए, हम bFGF के intracameral इंजेक्शन marimastat इंजेक्शन द्वारा पीछा दिलाई। इलाज में काफी कार्निया शोफ की हद तक कम हो। पिछले अध्ययनों में इस तरह के पायदान अवरोध 21,22 के रूप में जैसे रॉक अवरोध, और EnMT-दबा एजेंट के रूप में मुख्य चुनाव आयुक्त विकास उत्तेजक एजेंटों, के सामयिक आवेदन का इस्तेमाल किया है। हालांकि, सीईसी में दवाओं की पैठ रखनाएर कार्निया उपकला और स्ट्रोमा, जो उपचार प्रभावकारिता 23 प्रभावित कर सकते द्वारा सीमित है। सामयिक आवेदन के विपरीत, intracameral इंजेक्शन सीधे पूर्वकाल कक्ष में दवाओं को शुरू करने से कार्निया endothelium के लिए सीधी पहुँच सक्षम बनाता है। इसलिए, रसायनों के विकास उत्तेजक और EnMT-दबा प्रभाव unbiasedly cryoinjury निम्नलिखित का आकलन किया जा सकता है। हमारे अध्ययन में, हम intracameral इंजेक्शन से पहले intraocular दबाव कम करने के लिए पूर्वकाल कक्ष paracentesis प्रदर्शन किया। paracentesis बिना, intraocular दबाव में अचानक वृद्धि कार्निया शोफ या सुई तंत्र के माध्यम से आईरिस के भी आगे को बढ़ाव का कारण बनता है। धीरे घाव सील और intraocular संक्रमण को रोकने में सुई वापसी एड्स के दौरान पथ compressing।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trypsin | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium | ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| human epidermal growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insulin, transferrin, selenium | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 111219 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anti-active beta-catenin antibody | Millpore | 05-665 | |
| anti-snail antibody | Santa cruz | sc28199 | |
| anti-slug antibody | Santa cruz | sc15391 | |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11001 | for staining of ABC of bovine CECs |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11003 | for staining of ABC of rat corneal endothelium |
| goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | for staining of snail and slug of bovine CECs |
| antibody diluent | Genemed Biotechnologies | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| laser scanning confocal microscope | ZEISS | LSM510 | |
| xylazine | Bayer | N/A | |
| tiletamine plus zolazepam | Virbac | N/A | veterinary drug |
| proparacaine hydrochloride ophthalmic solution | Alcon | N/A | veterinary drug |
| 0.1% atropine | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | clinical drug |
| 0.3% gentamicin sulfate | Sinphar Group | N/A | clinical drug |
| basic fibroblast growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | clinical drug |
References
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