Summary
ウシ角膜内皮細胞の初代培養は、角膜内皮間葉移行のメカニズムを調べるために使用しました。さらに、ラット角膜内皮cryoinjuryモデルは、in vivoで角膜内皮間葉移行を示すために使用されました。
Protocol
すべての手順は、眼科と視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科計算書の研究のための協会に従う本研究で続き、国立台湾大学病院の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
1.単離、初代培養の準備、およびウシのCECの免疫染色
- 地元の食肉処理場から新鮮な牛の目を獲得。
- 3分間10％w / vのポビドンヨード溶液中で目を消毒。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液でそれらを洗浄します。
- 無菌条件下でのメスやハサミで角膜ボタンを収穫。ピール解剖顕微鏡下でピンセットでデスメ膜は、（本研究では、ウシ目は地元の食肉処理場により摘出していることに注意してください。したがって、最初の研究手順は研究室でpreenucleated目の消毒ありました）。
- トライの1ミリリットルでデスメ膜をインキュベート37℃で30分間PSIN。 5分間112×gで遠心分離することによってウシのCECを収集します。補充ホルモン上皮培地（SHEM）HEPES緩衝ダルベッコ改変イーグル培地、5％ウシ胎児血清を補充したハムF12培地、0.5％のジメチルスルホキシド、人間の表皮の2 ng / mlでの等量を含有する1mlの細胞を再懸濁成長因子、インスリンの5 mg / mlで、トランスフェリンの5 mg / mlで、セレン5ngの/ mlのコレラ毒素の1ナノモル/ Lのゲンタマイシンを50mg / mlであり、アンフォテリシンBの1.25 mg / mlで
- 6センチメートル皿に細胞（眼あたり約1×10 5細胞）をシード。 SHEM文化それらを。空気中5％のCO 2の雰囲気中、37℃で皿をインキュベートします。 3日ごとに培地を変更します。
- 細胞がコンフルエントに達したとき、PBSでそれらを洗浄し、5分間37℃でトリプシン1mlにそれらをインキュベートします。 5分間、112×gで遠心分離することによって、それらを収集します。 SHEMの1ミリリットル中に細胞ペレットを再懸濁します。
2.ラット角膜内皮Cryoinjuryモデルと房内注入
- 2％キシラジン（5.6ミリグラム/キログラム）とチレタミンプラスゾラゼパム（18ミリグラム/キログラム）の筋肉内注射で12週齢の雄性Sprague-Dawleyラットを麻酔。優しく肌のけいれんの不在下で適切な麻酔を確認するために、動物の皮膚をつまみます。
- 眼の痛みや瞬目反射を最小限に抑えるために、各ラットの右眼に0.5％塩酸プロパラカインを一滴を植え付けます。植え付けます角膜の乾燥を防ぐために、左眼にテトラサイクリン軟膏。
- 液体窒素中でステンレススチールプローブ（直径= 3 mm）を冷却します。 30秒間、右眼の角膜中央にステンレス製のプローブを適用します。頻繁に角膜の乾燥を防ぐための処置中に右眼にPBSを植え付けます。
- すぐcryoinjuryた後、0.1％アトロピンおよび0.3％の硫酸ゲンタマイシンを植え付けると、一日一回毛様体のけいれんに起因する眼の痛みを和らげるために、感染を防ぐために。
- 手順の後、ヒートランプを使用して温め、そして彼らは、モータ制御を取り戻すまで、15分ごとに、麻酔後にそれらの回復を観察したラットを保ちます。また、回復期間中に角膜の乾燥を防ぐために、右目にテトラサイクリン軟膏を適用します。
- 3日間連続して角膜cryoinjuryを繰り返します。
- 前述のようにラットの眼の前房内にマリマスタットまたはbFGFのを提供するために、ラットを麻酔。一滴を植え付けます眼の痛みや瞬目反射を最小限に抑えるために、右眼に0.5％プロパラカイン塩酸塩。
- 滅菌PBSで眼表面を灌漑。アイリスに上記と平行面でparalimbal透明な角膜で1mlシリンジに取り付けた30 G針を挿入することにより、手術用顕微鏡下で前房穿刺を行います。
- 針のベベルアップを回し、少しいくつかの房水を排出し、眼圧を低下させるために角膜の傷を押し下げます。房内薬剤の0.02ミリリットルを注入します。静かに針引き抜きの間綿棒で針管を圧縮します。
- 手術用顕微鏡下で指示された時点で、外部の目を撮影します。
3.収穫ラット角膜ボタンと免疫染色
- ラットを安楽死させるために、安楽死室でそれらを配置し、毎分室容積の10から30パーセントの充填率で100％のCO 2を吹き込みます。以下のためのCO 2注入を維持します呼吸と色あせた目の色の欠如後の追加分。
- 鋭利な刃で角膜輪部でのラットの目を貫通します。角膜輪部に沿って角膜ハサミで角膜をカットします。スライド上の角膜を平ら。角膜が丸まる場合には、追加の半径方向の切開を行います。
- 室温で30分間、4％パラホルムアルデヒドを250μl、pH7.4で角膜を修正しました。 5分間、0.5％トリトンX-100250μlの透過性、及び30分間、10％のウシ血清アルブミンでブロックします。
- 1の希釈で4℃で一晩ABCに対する一次抗体を用いて角膜をインキュベート：抗体希釈液で200。 15分間、PBSで2回角膜を洗浄し、二次抗体でそれらをインキュベート：1時間室温で（1抗体希釈液中の100）。 4を2μg/ mlの細胞を覆うことによって細胞核を対比染色 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、及び15分間、PBSで細胞を2回洗浄します。
- 退色防止マウントソリューションで角膜をマウントします。オビ20X対物倍率でのレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて405と561 nmでの励起波長での免疫蛍光画像をテイン。
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Representative Results
ウシのCECの単離後、細胞をインビトロで培養した。 図1は、ウシのCECの位相コントラスト画像を提示します。コンフルエンスの細胞の六角形は、細胞が細胞単離の間、角膜間質線維芽細胞によって汚染されていないことを示した。 図2に示された時点でABC、カタツムリ及びナメクジに対する抗体を用いて行った免疫染色を示します。 in vitro培養における表現型の変化とは別に、ABCとEMTレギュレータの対応する核内移行を観察した。 図3は、in vitroで培養されたウシのCECのEnMTプロセスに、マリマスタット、広域スペクトルのMMP阻害剤の効果を示す。 図図4は、房内注入しcryoinjury後のラットの外部目の写真を含んでいる。 図5は、Rの免疫染色を示しています房内注射、続いcryoinjury後ABCに対する抗体を用いて行った角膜ボタンで。 ABCの核移行は、PBS群で観察された有意なWnt /βカテニンシグナルとEnMTプロセスの活性化を示し、bFGFの群において増加しました。マリマスタット注射したbFGFの房内注入した後、ABCの核染色は、マリマスタットのEnMT抑制効果を示唆し、減少しました。
図1：in vitroで培養されたウシのCECは、培養プレート上に播種された後、ウシのCECが最初に現れたの位相コントラスト画像は、線維芽細胞様の日3と6には、彼らは= 9日スケールバー上の完全なコンフルエンスに達した時に、より六角形になりました50μmです。 3反復の代表的な画像。4329fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：アクティブβカテニン：in vitroで培養されたウシのCECウシのCEC、ABC、カタツムリ、およびスラグの核移行のin vitro培養中に14日ABCを通じて検出されたの免疫染色 。スケールバー=100μmです。 3反復の代表的な画像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：付きまたは異なる細胞合流レベルでマリマスタットなしのin vitroで培養ウシのCECの免疫染色免疫染色悪魔ABCは、カタツムリ、およびスラグを持つか、しかし3日目にマリマスタットの10μMのない牛のCECの核内で明らかになったことをtrated、マリマスタットは大幅に9日目ウシのCEC上の核ABC、カタツムリの染色、およびスラグを縮小しました完全にコンフルエントになりました。スケールバー=100μmです。 3反復の代表的な画像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：示された時点でのラットの外部目の写真cryoinjury後 3日間連続cryoinjury後、ラットは、6日目、3日目にPBSまたは50 ngの/ mlのbFGFの0.02ミリリットルの房内注入に供した、0.02ミリリットルの。 PBSは、他の2 grouに注入したのに対し、10μMマリマスタットは、bFGFを/マリ・グループに房内に注入しましたPS（各群n = 9）。外部の目の写真は、bFGF単独と比較してマリマスタットさらに還元角膜浮腫のに対し、bFGFを注射した後に減少した角膜浮腫を明らかにした。各群n = 9。スケールバー= 1mmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：9日目に収穫したラット角膜ボタンのラット角膜ボタンの免疫染色免疫染色は、PBS群でABCの小さな核染色を明らかにしました。 bFGFのグループでは、かなりのbFGF /マリ群において減少したABCの大規模な核染色は、ありました。スケールバー=100μmである。 THIの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。sのフィギュア。
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Discussion
CECは、細胞増殖中EnMTを受けるそれらの傾向のために知られています。治療目的のためにEnMTプロセスを抑制するための戦略を開発するには、EnMTメカニズムの完全な理解が必要です。我々はEnMT、 インビトロ培養モデルおよびラット角膜内皮cryoinjuryモデルで 、すなわちウシCECを調査するために2モデルを説明しました。我々の結果は、両方のモデルでEnMTプロセスを実証しました。さらに、マリマスタットのEnMT抑制効果は、これらの2モデルが同じメカニズムを共有することを示唆し、両方のモデルで再現されました。
体外培養モデルにおけるウシCECは、操作のしやすさを提供しています。また、以前の研究17,18で採用インビトロ培養モデルにおけるヒトまたは霊長類CECと比較して、ウシの目が大きく、取得が容易であるため、より多くのCECを用意して。私たちの研究では、地元の食肉処理場から除核された牛の目を獲得しました。そのためFRESのウシ目の時間的性質は、収穫したウシのCECの正確な数は、眼あたり約1×10 5個の細胞で、変動の対象となります。これとは対照的に、正常な角膜における人間のCECの数は約3×10 5目あたりです。この数は、研究グレードの角膜に低く、移植後の残存角膜縁であっても低いです。採取手順の間の操作は、さらに得られた細胞の数を減少させます。また、ウシのCECは自発的にEnMTを増殖して受けることができます。したがって、 体外培養モデルにおけるウシCECはEnMTメカニズムを調査し、そのようなマリマスタットなどEnMT抑制化学物質を、スクリーニングに有用です。そのようなのCECの増殖能力などの種に関連した違い、懸念が残るものの、我々の結果は、ウシのCECのEnMTシグナル伝達経路がWnt /βカテニン18,19の活性化を含む人間のCEC、と同様であることを実証しました。
ウシのCECの単離の間にテント ">、デスメ膜を剥離することが重要である。いくつかのウシの目には、デスメ膜を剥離デスメ膜に過大な間質組織につながる、角膜実質との密着性を有することができる。さらに、トリプシン処理は、につながる可能性があり細胞の純度、したがって、実験結果に影響を与え、角膜線維芽細胞に変身間質角膜実質のリリース。私たちの研究では、顕微鏡下で慎重にデスメ膜を剥離した。さらに、細胞の純度を確保するために、我々は最初の6で回収された細胞を培養し細胞コンフルエンスまで10cmディッシュ。細胞の形状が六角形であっただけそれらがさらなる実験に使用しました。さらに体外培養モデルにおけるウシCECの知見を実証するために、我々は以前の研究20,21で採用したラット角膜内皮cryoinjuryモデルを用いました。 cryoinjury後、ラットのCECはmanife、再生時のEnMTを受けましたWnt /βカテニンシグナル伝達の活性化はCECの再生中に種間で保存されていることを示す、アクティブβカテニンの核移行によってSTED。低CEC機能は明白な角膜浮腫につながるためまた、このモデルはのCECの機能を研究するのに有用です。このような超音波生体顕微鏡、前眼部光干渉断層撮影、および共焦点顕微鏡などの他の機器と組み合わせて、角膜の厚さを定量的に評価し、このようにCEC機能を反映することができます。
CECの再生を刺激し、創傷治癒後EnMTを抑制するために、我々は、マリマスタット注入しbFGFの房内注射を投与します。処置は、角膜浮腫の程度を減少させました。以前の研究では、このようなノッチ阻害剤21,22などのROCK阻害剤、およびEnMT抑制剤としてのCEC増殖刺激剤は、局所適用を使用していました。しかし、CECへの薬剤の浸透が横たわっていましたERは、治療効果23に影響を与える可能性角膜上皮および間質によって制限されます。局所適用とは対照的に、房内注入は、直接前房内に薬剤を導入することにより、角膜内皮への直接アクセスを可能にします。したがって、化学物質の増殖刺激とEnMT抑制効果がcryoinjury以下unbiasedly評価することができます。私たちの研究では、房内注入前に眼圧を下げるために前房穿刺を行いました。穿刺することなく、眼圧の急激な増加は、針管を通って角膜浮腫や虹彩のさえ脱出を引き起こします。静かに傷を密封し、眼内感染症を予防するには、針の離脱を助ける時に管を圧縮します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trypsin | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium | ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| human epidermal growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insulin, transferrin, selenium | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 111219 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anti-active beta-catenin antibody | Millpore | 05-665 | |
| anti-snail antibody | Santa cruz | sc28199 | |
| anti-slug antibody | Santa cruz | sc15391 | |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11001 | for staining of ABC of bovine CECs |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11003 | for staining of ABC of rat corneal endothelium |
| goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | for staining of snail and slug of bovine CECs |
| antibody diluent | Genemed Biotechnologies | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| laser scanning confocal microscope | ZEISS | LSM510 | |
| xylazine | Bayer | N/A | |
| tiletamine plus zolazepam | Virbac | N/A | veterinary drug |
| proparacaine hydrochloride ophthalmic solution | Alcon | N/A | veterinary drug |
| 0.1% atropine | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | clinical drug |
| 0.3% gentamicin sulfate | Sinphar Group | N/A | clinical drug |
| basic fibroblast growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | clinical drug |
References
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