Summary
sığır endotel hücrelerinin ana bir kültürü kornea endotelial-mezenkimal geçiş mekanizmasını araştırmak için kullanıldı. Ayrıca, bir fare endotel cryoinjury modeli in vivo olarak endotel-mezenkimal geçiş göstermek için kullanılmıştır.
Protocol
Tüm işlemler Oftalmik ve Vision Research Hayvanların Kullanım Vizyon ve Oftalmoloji Tablosunda Araştırma Derneği ile tanınan bu çalışmada izlenen ve Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
1. İzolasyon, İlköğretim Kültür Hazırlama ve Bovine CDKÖ immün
- Yerel bir mezbahaya taze sığır gözleri kazanır.
- 3 dakika boyunca% 10 w / v povidon-iyot çözeltisi gözleri dezenfekte. Fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi ile yıkanır.
- steril koşullar altında bir neşter ve makas ile kornea düğmeye hasat. bir mikroskop altında forseps ile Peel Descemet membranı (bu çalışmada unutmayın, sığır gözler yerel bir mezbahaya tarafından iki parçaya ayrıldı, bu nedenle ilk çalışma prosedürü laboratuvarda preenucleated gözlerinin dezenfeksiyon idi).
- try 1 ml Descemet membran inkübe30 dakika boyunca 37 ° C'de psin. 5 dakika boyunca 112 x g'de santrifüj ile sığır CDKÖ toplayın. takviye hormon epitel ortam (SHEM) HEPES-tamponlu Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı ve% 5 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş Ham F12 ortamında,% 0.5 dimetil sülfoksit, insan epidermal 2 ng / ml arasında eşit hacimlerde ihtiva eden 1 ml hücrelerin tekrar büyüme faktörü, 5 mg / ml arasında insülin, 5 mg / transferin ml, 5 ng / selenyum mi, kolera toksin 1 nmol / L, 50 mg / ml gentamisin ve 1.25 mg / amfoterisin B mi
- 6 cm çanak içine hücreleri (gözün başına yaklaşık 1 x 10 5 hücre) Tohum. Sam'ın Kültür onları. Hava içinde% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de çanak inkübe edin. 3 günde kültür ortamı değiştirin.
- Hücreler kaynaşmaya eriştikten sonra, PBS ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de tripsin 1 ml inkübe. 5 dakika boyunca 112 x g'de santrifüj ile toplayın. Sam'ın 1 ml hücre pelletini yeniden askıya.
2. Sıçan Kornea Endotel Cryoinjury Modeli ve İntrakameral Enjeksiyon
- % 2 ksilazin (5.6 mg / kg) ve tiletamin artı zolazepam (/ kg 18 mg) kas içine enjeksiyonu ile 12 haftalık erkek Sprague-Davvley sıçanları anestezisi. Yavaşça cilt seğirmesi yokluğunda uygun anestezi onaylamak için hayvanların derisini çimdik.
- Göz ağrısı ve göz kırpma refleksi en aza indirmek için her sıçanın sağ gözüne% 0.5 proparacaine hidroklorür bir damla aşılamak. Aşılamaksol göze tetrasiklin merhem kornea kuruluğunu önlemek için.
- sıvı nitrojen içinde paslanmaz çelikten bir prob (çap = 3 mm) soğutun. 30 sn sağ gözünün kornea santralinde paslanmaz çelik prob uygulayın. Sıkça kornea kuruluğunu önlemek için işlem sırasında sağ gözüne PBS aşılamak.
- hemen cryoinjury sonra% 0.1 atropin ve% 0.3 gentamisin sülfat aşılamak ve günde bir kez siliyer spazm kaynaklanan göz ağrısı rahatlatmak için ve enfeksiyonu önlemek için.
- İşlemden sonra, sıçanlar bir ısı lambası kullanarak sıcak tutmak ve onlar motor kontrolünü yeniden kadar anestezi sonrası kendi iyileşme her 15 dakika gözlemleyin. Ayrıca, iyileşme döneminde kornea kuruluğunu önlemek için sağ gözüne tetrasiklin merhem uygulayın.
- 3 gün üst üste kornea cryoinjury tekrarlayın.
- Daha önce açıklandığı gibi sıçan gözlerin ön odasına marimastat veya bFGF verilmesi için, fareler uyutmak. bir damla aşılamaksağ göz içine% 0.5 proparacaine hidroklorür göz ağrısı ve göz kırpma refleksi en aza indirmek için.
- steril PBS ile göz yüzeyi yıkayın. iris yukarıda ve paralel bir düzlemde paralimbal açık bir korneadaki bir 1 ml şırınga bağlanmış bir 30 G iğne sokarak bir ameliyat mikroskobu altında Ön bölme parasentezi gerçekleştirmek.
- İğne yukarı konik çevirin ve hafif bazı sulu mizah drenaj ve göz içi basıncını düşürmek için kornea yara bastırın. intrakameral ilacın 0.02 ml enjekte edilir. Yavaşça iğne çekilmesi sırasında pamuk uçlu iğne yolu sıkıştırmak.
- ameliyat mikroskobu altında belirtilen zaman noktasında dış göz fotoğraf.
3. Hasat Sıçan Kornea Düğme ve immün
- Fareleri euthanize için, ötenazi odasına koyun ve dakikada odası hacminin% 10-30 bir dolgu hızında% 100 CO 2 demlenmeye. Bir CO 2 infüzyon korumaksolunum yetersizliği ve soluk göz rengi sonra ek dakika.
- keskin bir bıçak ile limbusta sıçan göz nüfuz eder. limbusta boyunca kornea makasla korneaları kesin. bir slayt korneaları dümdüz. korneaları kıvrılıp, ek radyal kesiler olun.
- Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile,% 4 paraformaldehit 250 ul, pH 7.4 ile kornealar düzeltildi. 5 dakika için% 0.5 Triton X-100, 250 ul geçirgenliği, ve 30 dakika boyunca,% 10 büyükbaş hayvan serum albümini ile bloke eder.
- 1 oranında sulandırılmış bir gece boyunca 4 ° C 'de ABC karşı birincil antikor ile kornealar inkübe: 200 antikoru seyreltici içinde. 15 dakika boyunca PBS ile iki kez kornealar yıkayın ve ikincil antikor ile inkübe: 1 saat süre ile oda sıcaklığında (1 antikoru seyreltici içinde, 100). Hücre 2 ug 4 / ml ', 6-diamidino-2-fenilindol ile hücrelerin kaplayarak nükleus ve 15 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkama hücreleri Counterstain.
- montaj çözümü, anti-solmaya korneaları monte edin. ob20X objektif büyütme bir lazer tarama konfokal mikroskop ile immunofluorescent 405 uyarma dalga boylarındaki görüntüleri ve 561 nm tain.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sığır CECS izole edildikten sonra, hücreler, in vitro olarak kültürlendi. 1 sığır CDKÖ faz kontrast görüntüler sunar Şekil. Izdiham hücrelerin altıgen şekil hücreleri hücre izolasyonu sırasında kornea stromal fibroblast tarafından kontamine olmadığını belirtti. 2 belirtilen bir zaman noktasında ABC, salyangoz ve sümüklü böcek karşı antikorlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir immün tasvir etmektedir. Yanı sıra, in vitro kültür içinde fenotipik değişikliklerin, ABC veya EMT düzenleyiciler karşılık gelen bir nükleer translokasyon gözlemlenmiştir. Şekil 3, in vitro kültürlenmiş sığır CDKÖ arasında EnMT sürecinde marimastat etkisini geniş spektrumlu bir MMP önleyicisi göstermektedir. Şekil 4 intrakamaral enjeksiyon yoluyla takip cryoinjury sonra farelerin dış göz fotoğraflarını içermektedir. Şekil 5 r immün gösterir kornea renkli o intrakameral enjeksiyon, ardından cryoinjury sonra ABC karşı antikorlar kullanılarak yapıldı. ABC nükleer translokasyon PBS grubunda gözlendi ve önemli ölçüde Wnt / β-katenin ve EnMT işleminin aktivasyonuna işaret bFGF grubunda arttırılmıştır. bFGF intrakamaral enjeksiyon marimastat enjeksiyonu takiben sonra, ABC nükleer boyanma marimastat ve EnMT inhibe edici etkisi düşündüren, azalmış.
Şekil 1:., In vitro kültürlenmiş sığır CESler kültür plakası üzerinde tohumlandı sonra, sığır CESler ilk çıktı arasında Faz kontrast görüntüleri fibroblast benzeri gün 3 ve 6 onlar = gün 9. ölçek çubuğu komple kaynaşmaya eriştikten sonra daha fazla altıgen oldu 50 um. 3 çoğaltır Temsilcisi görüntüler.4329fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Aktif β-katenin: In vitro kültürlenmiş sığır CESler sığır CDKÖ, ABC, salyangoz, ve pisliklerin nükleer translokasyon in vitro kültür sırasında gün 14'te ABC ile tespit edildi immün. Ölçek çubuğu = 100 mikron. 3 çoğaltır Temsilcisi görüntüler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Ya da farklı hücre izdiham seviyelerinde marimastat olmadan in vitro kültür sığır CDKÖ bir immunboyanma iblislerABC, salyangoz ve sülük ile veya Ancak 3. günde marimastat 10 uM olmadan sığır CDKÖ çekirdeğinde belirgin olduğunu trated, marimastat anlamlı günde 9 büyükbaş kurulları nükleer ABC, salyangoz boyama ve sülük azaltılmış tam konfluent oldu. Ölçek çubuğu = 100 mikron. 3 çoğaltır Temsilcisi görüntüler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Cryoinjury sonra belirtilen zaman noktalarında sıçan dış göz fotoğraflar 3 gün üst üste cryoinjury ardından sıçanlar 0.02 ml, 6. günde 3. günde ng / ml bFGF PBS 0.02 ml ya da 50 intrakameral enjeksiyonuna tabi tutuldu PBS diğer 2 Grou enjekte edilmiştir, oysa 10 uM marimastat bFGF / Mari grubunda intrakameral enjekte edilmiştirpS (n = 9, her bir gruptaki). Marimastat daha da düşürülebilir kornea ödemi, tek başına bFGF ile karşılaştırıldığında. N = her grupta 9 ise dış göz fotoğraflar, bFGF enjeksiyonundan sonra kornea ödemi azaltılabilir saptandı. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. 9. günde hasat edildi sıçan kornea düğmeleri sıçan kornea düğmelerin immunboyanma PBS grubunda ABC küçük nükleer boyanma saptandı. bFGF grubunda, önemli ölçüde bFGF / Mari grubunda azalmıştır ABC, geniş nükleer boyama oldu. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Thi büyük halini görmek için tıklayınızs rakam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CESler hücre proliferasyonu sırasında EnMT geçmesi için kendi eğilimi bilinmektedir. Tedavi amaçlı EnMT sürecini bastırmak için stratejiler geliştirmek, EnMT mekanizmasının tam bir anlayış gereklidir. Biz EnMT, in vitro kültür modeli ve sıçan kornea endotel cryoinjury modelinde yani sığır CEC araştırmak için 2 modeller nitelendirdi. Bizim sonuçları Her iki modelde de EnMT süreci göstermiştir. Ayrıca, marimastat ve EnMT baskılayıcı etkisi bu 2 model aynı mekanizmayı paylaşan düşündüren, her iki modelde de çoğaltılabilir.
In vitro kültür modelinde sığır MSK manipülasyon kolaylığı sağlar. Buna ek olarak, daha önceki çalışmalarda 17,18 kullanılan in vitro kültür modellerinde insan ve primat CEC ile karşılaştırıldığında, sığır gözler daha büyük ve elde etmek daha kolaydır ve bu nedenle daha CESler kullanılabilir olması. Bizim çalışmamızda, yerel mezbahaya Enüklee sığır gözleri satın aldı. Çünkü fres arasında Sığır gözlerin h doğa, hasat sığır CDKÖ tam sayısı göz başına yaklaşık 1 x 10 5 hücre, değişime bağlıdır. Bunun aksine, normal bir kornea insan CDKÖ sayısı göz için yaklaşık 3 x 10 5'tir. Bu sayı çalışma dereceli kornealar düşüktür ve transplantasyon sonrası rezidüel kornea jantlar daha da düşüktür. hasat işlemi sırasında manipülasyonlar daha elde hücrelerin sayısını azaltacaktır. Ayrıca, sığır CESler çoğalabilir ve spontan EnMT katılmasının sağlanması; Bu nedenle, in vitro kültür modelinde sığır CEC EnMT mekanizmasının araştıran ve marimastat olarak EnMT bastıran kimyasallar taranmasında yararlıdır. Bu CECS proliferatif kapasitesini gibi türler ile ilgili farklılıklar, ilgili endişe olmasına rağmen, bizim bulgularımız sığır CDKÖ bölgesinin EnMT sinyal yolu Wnt / β-katenin 18,19 aktivasyonu da dahil olmak üzere, insan CDKÖ, benzer olduğunu göstermiştir.
Sığır CECS izolasyonu sırasında çadır ">, Descemet zarı soyma önemlidir. Bazı sığır gözünde, Descemet membranı soyulmuş Descemet membran üzerinde aşırı stromal doku lider, kornea stroma ile sıkı yapışma olabilir. Ek trypsinization yol açabilir hücre saflık etkiler ve bu nedenle deney sonuçları. bizim çalışmamızda, mikroskop altında dikkatle Descemet zarı soyulmuş kornea fibroblastlar, dönüşüyor. ayrıca hücre saflık sağlamak için stromal keratositlerin açıklaması, öncelikle bir 6 hasat hücreleri kültüre hücre birbirine karışana kadar cm tabak. hücrelerinin şekli altıgen olan sadece bu daha deneylerde kullanıldı.Ayrıca in vitro kültür modelinde sığır CEC kanıtlarının, biz önceki çalışmalarda 20,21 kabul sıçan kornea endotel cryoinjury modeli kullanıldı. cryoinjury sonra sıçan kurulları rejenerasyon, manife sırasında EnMT yapıldıWnt / β-katenin aktivasyonu CEC rejenerasyon sırasında türler arasında muhafaza edildiğini gösterir aktif β-katenin nükleer translokasyonu sted. Düşük CEC fonksiyonu belirgin kornea ödemi neden, çünkü ek olarak, bu model CDKÖ işlevini araştırmak yararlıdır. Böyle ultrason Biomikroskop, ön segment optik koherens tomografi ve konfokal mikroskopi gibi diğer ekipmanları ile kombine, kornea kalınlığı kantitatif değerlendirilir ve böylece CEC fonksiyonu yansıtır.
CECS yenilenmesini teşvik ve yara iyileşmesi sonrasında EnMT bastırmak için, biz marimastat enjeksiyon yoluyla takip bFGF intrakamaral enjeksiyonları uygulanabilir. Tedavi ölçüde kornea ödemi azalttığını göstermiştir. Önceki çalışmalar, Çentik önleyicisi 21,22 gibi ROCK inhibitörü ve EnMT bastırıcı maddeler olarak CEC büyüme uyarıcı maddeler, topikal uygulama kullandık. Ancak, MSK içine ilaç penetrasyonu yatıyorduER tedavinin etkinliğini 23 etkileyebilir kornea epitel ve stroma ile sınırlıdır. Topikal uygulama aksine, intrakamaral enjeksiyon doğrudan ön kamaraya uyuşturucu getirerek kornea endotel doğrudan erişim sağlar. Bu nedenle, kimyasal büyüme uyarıcı ve EnMT bastırıcı etkisi cryoinjury aşağıdaki tarafsız bir şekilde değerlendirilebilir. Bizim çalışmamızda, intrakamaral enjeksiyonundan önce göz içi basıncını düşürmek için ön kamara parasentez uygulandı. parasentez olmadan, göz içi basıncı ani bir artış kornea ödemi veya iğne yolu ile iris bile prolapsus neden olur. Yavaşça yara mühürleme ve göziçi enfeksiyonu önlemek iğne çekilme yardımları sırasında sisteme bası.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trypsin | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium | ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| human epidermal growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insulin, transferrin, selenium | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 111219 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anti-active beta-catenin antibody | Millpore | 05-665 | |
| anti-snail antibody | Santa cruz | sc28199 | |
| anti-slug antibody | Santa cruz | sc15391 | |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11001 | for staining of ABC of bovine CECs |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11003 | for staining of ABC of rat corneal endothelium |
| goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | for staining of snail and slug of bovine CECs |
| antibody diluent | Genemed Biotechnologies | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| laser scanning confocal microscope | ZEISS | LSM510 | |
| xylazine | Bayer | N/A | |
| tiletamine plus zolazepam | Virbac | N/A | veterinary drug |
| proparacaine hydrochloride ophthalmic solution | Alcon | N/A | veterinary drug |
| 0.1% atropine | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | clinical drug |
| 0.3% gentamicin sulfate | Sinphar Group | N/A | clinical drug |
| basic fibroblast growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | clinical drug |
References
- Maurice, D. M. The location of the fluid pump in the cornea. J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).
- Joyce, N.
- Morishige, N., Sonoda, K. H. Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies. Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).
- Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report. Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).
- Wilson, S. E., Lloyd, S. A. Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).
- Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).
- Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).
- Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. Growth of human corneal endothelial cells in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).
- Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview. Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).
- Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors. Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).
- Ko, M. K., Kay, E. P. Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).
- Lee, H. T., Kay, E. P. FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells. Mol Vis. 9, 624-634 (2003).
- Pipparelli, A., et al. ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells. PloS one. 8 (4), e62095 (2013).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Jakobiec, F. A., Bhat, P. Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins. Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).
- Okumura, N., et al. Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).
- Okumura, N., et al. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).
- Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions. J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).
- Ho, W. T., et al. Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).
- Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).
- Li, C., et al. Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).
- Okumura, N., et al. The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).
- Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics. Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).
