Introduction
Кровотворение представляет собой регенеративный процесс, который обеспечивает пополнение клеток крови, которые были утрачены из-за травмы, радиации и гибели клеток. Этот процесс обеспечивается гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), которые в значительной степени проживают в костном мозге взрослого. Кроме того, гемопоэтические стволовые клетки могут быть использованы в терапевтических целях при аутоиммунных расстройств, гематологических злокачественных заболеваний и иммунодефицитных состояний 1. Существует, таким образом, необходимо, чтобы лучше понять механизмы, которые регулируют функцию HSC, включая их расширение пролиферативной и их способности достигать и прижился костный мозг получателя после пересадки. Хотя недавние исследования сообщали о нескольких маркеров клеточной поверхности, в том числе членов семьи SLAM CD150 и CD48, чтобы перспективно обогащают взрослых ГСК и плода ГСК до приблизительно 50% чистоты 2-4, золотой стандарт мера для функционального ГСК остается в естественных условиях заселив анализа на определить их способность восстановить крови грпроизводство ELL в облученном хозяина 5.
Клональная анализ заселив в естественных условиях изначально был разработан Till и McCulloch 6 и с тех пор была усовершенствована и расширена. Как первоначально определено, ГСК обеспечить пожизненную производство клеток крови через самообновлению и дифференцировке. Передача ГСК в облученного реципиента, таким образом, позволяет оценить: их способность дифференцировать на основе анализа различных линий клеток крови (Т-лимфоциты, В-лимфоциты, гранулоциты, моноциты) и их способности к самообновлению путем последовательной трансплантации. Анализ, как правило , предполагают сравнение функциональных и / или количества двух популяций ГСК, например, клетки , поступающие из двух мышей разных генотипов или клеток , которые были обработаны или необработанными с различными факторами , которые могут повлиять на сохранение или расширение ГСК в культуре. Донор химеризмом, или вклад переданы доноров ГСК тO производства клеток крови, то может быть определено с помощью проточной цитометрии в периферической крови и костного мозга с использованием маркеров клеточной поверхности или другие методы, которые отличит донорские клетки от реципиента, или хозяина. Наиболее широко используются маркеры, безусловно , два аллеля гена Ptprc или CD45 лейкоцитарного антигена 7 , которую мы выбрали для примеров , приведенных ниже.
Клональная анализ репопуляция может быть конкурентным или неконкурентным. В неконкурентной обстановке, управления и испытаний HSC, передаются на отдельные мышей-реципиентов, и результаты для каждого типа клеток будет независим от другого. В условиях конкурентной борьбы, функции и тестирования и управления ГСК измеряется против населения конкурента ГСК. Протокол, описанный здесь, использует конкурентной борьбы, но также могут быть адаптированы для неконкурентных ситуаций. Оба подхода имеют свои преимущества и недостатки, и мы сравним их подробно вобсуждение. Мы также описывают различные подходы к обеспечению справедливости в отношении количества пересаженных ГСК, объяснить, каким образом адаптировать анализ для количественного определения ГСК путем ограничения разбавления анализа (LDA), и привести примеры как успешных, так и неудачных трансплантаций для интерпретации результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, описанные в этом протоколе были одобрены институциональным комитетом по этике животных и следовать Канадский совет по руководящим принципам ухода за животными.
Примечание: Для поддержания стерильных / конкретного патогена жилищных условий, проводить все процедуры, связанные с прямой обработки живых мышей в кабинете биологической безопасности или ламинарный. Очистите или стерилизовать клетки, удерживающие устройства, жилищные материалы, чау и воды при условии, животным соответствующим образом. Используйте только стерильные одноразовые иглы для инъекций и забора крови. Техника Aseptic имеет решающее значение в процессе подготовки трансплантата.
1. Подготовка мышей-реципиентов
- Определить мышей - реципиентов с ушными выемками (или другим способом , утвержденным местным этическим комитетом животных 8) для того, чтобы отдельные РАЗВЕЙТЕ периферической крови и костного мозга восстановления в течение долгого времени. Взвесьте мышей для постпересадки наблюдения. НасМыши-реципиенты е, которые от 7 до 12 недель (менее 25 г).
Примечание: В указанном примере мышей CD45.1 + CD45.2 + реципиенты были разведены в доме путем скрещивания мышей C57BL / 6 с конгенных мышей B6.SJL. - Облучают мышей-реципиентов двумя дозами 450 рад, чтобы уничтожить гемопоэтической активности. Дайте первая доза за день до трансплантации и второй 1-2 ч перед трансплантацией.
Примечание: рентгеновские или гамма-лучи могут быть использованы и в зависимости от наличия соответствующих объектов.
2. Подготовка доноров и Конкурент клеток костного мозга
- Эвтаназии доноров (испытание и контроль; CD45.2 +) и конкурент (CD45.1 +; B6.SJL) мышей СО 2 удушья с последующим смещением шейных позвонков или с использованием методов , одобренных местным комитетом по этике животных.
- Место мышей на их спине, ноги широко открыты, в пустой чашке Петри или на стерильную марлю (чтобы держать рабочую поверхность чистой) ЯNside кабинете биологической безопасности. Влажная кожа и мех с 70% этанола / 30% H 2 O (v / v).
- Отрезать ногу с хирургическим скальпелем или острыми ножницами. Разрежьте кожу вдоль ноги и отодвигать кожу с помощью пинцета с зубчатыми. Срежьте лишнюю мышечную массу.
- Вывихнуть бедренной кости, потянув на кости ноги и с помощью ножниц лезвий против тазовых костей в качестве противодействующей силы. Отделить берцовой и бедренной костями от коленной чашечки и удалите оставшиеся кусочки мышц и сухожилий. Поместите кости в 2-3 мл стерильного забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) в 6-луночный планшет для тканевых культур с.
- Сбор клеток костного мозга путем промывки кости с 5 мл стерильной PBS.
- Удерживая кость осторожно пинцетом и вставить 25 G иглу, присоединенную к заполненной 1 мл шприца в один конец кости. Нажмите на поршень и сбора клеток в 15 мл коническую пробирку. Повторите по мере необходимости, пока центр кости не является белым.
- Диссоциировать клетки путем многократного прохождения через иглу вполучения суспензии отдельных клеток. Избегайте пузырьков и избыток силы. Примечание: Используйте немного большую иглу (22 G), чтобы улучшить жизнеспособность клеток на этом этапе.
- Проходят клетки через 70 мкм нейлоновый сетчатый фильтр для обеспечения однородной суспензии клеток и для удаления мусора и комков.
- Удалить аликвоту для подсчета клеток с использованием гемоцитометра. Центрифуга оставшуюся суспензию клеток при 200 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Отрегулировать плотность клеток в соответствии с требованиями в стерильном PBS (10 8 клеток / мл). Держите клетки на льду.
3. Создание донорских клеток HSC Эквиваленты
- Перенести эквивалент 3 - х 10 6 клеток (30 мкл) в 5 мл с круглым дном полистирола трубки для проточной цитометрии окрашивания. Добавить равный объем немеченых антител против CD16 / CD32, чтобы блокировать неспецифическую окрашивание (разбавленного окрашивающего буфера (PBS с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 1 мМ ЭДТА) для конечной концентрации 2,5 мкг / мл). Выдержите 5 минут при комнатной температуре,
- Добавить 90 мкл Флуорохром-конъюгированные антитела основной смеси, полученной в буфере окрашивания: биотинилированный Lineage коктейль (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), СЦА1, CD117, CD135, CD150. Инкубировать на льду в течение 30 мин, защищенном от света месте.
Примечание: соответствующие разбавлени должны быть определены для каждой партии антител. Таблицу материалов для разведений, используемых в данном исследовании. - Добавляют 2 мл окрашивающего буфера к клеткам, вихря и центрифугировать при 200g в течение 5 мин при 4 ° С для удаления несвязанного антитела. Слейте супернатант и ресуспендируют осадок Смахивающее.
- Добавьте 10 мкл Флуорохром-конъюгированного стрептавидина , разбавленного окрашивающего буфера (см Материалы таблицу). Инкубируют на льду в течение 20 мин, защищенном от света месте. Вымойте как в шаге 3.3 для удаления несвязанного стрептавидин.
- Acquire клеточных образцов с использованием проточного цитометра, по крайней мере , шесть детекторов 9. Определить частоту Lin - СЦА1 + CD117 + CD135 - CD150
Примечание: Частота функциональных ГСК в пределах этой популяции может быть оценена между 1/3 и 1/5 2,12. - Установить оценочные эквиваленты HSC для всех образцов 11, используя один образец ( как правило, конкурент, B6.SJL CD45.1 + в данном примере) в качестве базового уровня , как описано ниже и на рисунке 2.
- Подсчитайте количество клеток, необходимых с использованием следующих формул:
#transplanted ГСК / реципиент = 5 × 10 5 клеток х расчетная частота ГСК (как определено для базового образца; это число обычно составляет от 75 до 125 для дикого типа C57BL / 6) , 10-12.
Примечание: На рисунке 2, для образца А, результат 139 ГСК.
Всего # трансплантированных клеток (для других образцов, например : Образец B на рисунке 2) = # транспосажено частота ГСК / HSC.
Примечание: На рисунке 2, для образца В, то результат будет 197826 (или приблизительно 2 х 10 5) Общее количество клеток костного мозга.
- Подсчитайте количество клеток, необходимых с использованием следующих формул:
- Подсчитайте общее количество клеток, необходимых для каждого получателя трансплантата для каждого образца, используя результаты, полученные выше.
Примечание: Это число должно быть не менее 5 × 10 5 для базового образца (конкурента).- Умножить число, полученного на стадии 3.7 по количеству мышей-реципиентов и добавить достаточное количество клеток, по крайней мере, два дополнительных мышей для компенсации мертвого объема в шприце.
- Смешайте конкурента (например, CD45.1 +) и тест - клетки (CD45.2 +) в соотношении 1: 1 эквивалентном соотношении HSC, рассчитанный на шаге 3.6 и настроить конечный объем для 200 мкл на инъекцию с использованием стерильной PBS.
Примечание: Для группы из пяти мышей - реципиентов предлагаемый объем будет , таким образом, по меньшей мере , 1,4 мл, содержащего 3,5 х 10 6 конкурентов клеток костного мозга (или973 оценкам ГСК для образца А на рисунке 2), и эквивалентное число тестируемых клеток (на рисунке 2, эквивалент для образца B будет 197826 х 7 = 1,384,782 клетки костного мозга).
4. Трансплантация костного мозга
- Разогреть мышей-реципиентов, облученный в шаге 1.2 с красной лампой тепло, чтобы обеспечить расширение кровеносных сосудов и сделать боковой хвостовой вены более заметными.
- Подготовка к туберкулину шприц 1 мл, снабженный иглой 27 G (или меньше). Отберите приблизительно 750 мкл приготовленной суспензии клеток (для мышей 3-реципиентов). Убедитесь, что нет воздушных пузырьков в шприце.
- Вставьте мышь в удерживающей устройство. Осмотрите хвост и искать боковые вены хвоста, которые должны быть хорошо видны с обеих сторон хвоста. Протрите место инъекции этанола. Вставьте иглу скосом вверх, параллельно коже и осторожно нажмите на поршень. Инъекции должно быть легко. Если сила повторнопотребовавшие, игла не в вене.
Примечание: Более старые мыши имеют более толстую кожу, что может сделать найти вену более трудным. Если игла не в вене, повторно вставить иглу проксимальнее исходного места инъекции. - Удалите иглу и нажать на место инъекции стерильной марлей в течение нескольких секунд, чтобы остановить кровотечение. Перенесите мышь в чистую клетку.
Примечание: Используйте один и тот же шприц и иглу для трех инъекций, после чего игла может стать слишком унылым. - Для постпересадки наблюдения, вводят 1 мл стерильной PBS подкожно регидрировать мышей в течение первых пяти дней. Добавить антибиотики в питьевой воде, для профилактики инфекций (если это требуется; по желанию). Взвесьте мышей через каждые два-три дня в течение первых трех недель и усыпить мышей, которые потеряли более 15-20% их предтрансплантационной массы тела (или, как это определено местным комитетом по этике животных).
5. Анализ периферической крови
- Собрать каплю крови (pprox. 50-100 мкл) в EDTA пробирки.
- Для сбора крови из вены нижней челюсти, используйте ланцет или 22 G иглой прокалывают кожу лица возле голую пятна , расположенного под челюстью и место сбора трубки получить каплю крови 13. Собрать кровь на 4, 8, 12 и 16 недель после пересадки следовать несколько клонов восстановления.
- Добавить 1 мл свежеприготовленной RT красных кровяных клеток лизис буфера (9 частей 0,16 М NH 4 Cl + 1 часть 0,17 М Трис-HCl рН 7,65) до капли крови , собранной на этапе 5.1.1. Смешайте и передачи образца до 5 мл с круглым дном полистирола трубки, пригодного для проточной цитометрии. Дайте постоять в течение 4 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 4 объемов охлажденного льдом PBS. Смешайте поворотом конца в конец и передавать сразу на льду. Центрифуга 10 мин при 200g при температуре 4 ° С.
- Слейте супернатант и ресуспендируют осадок Смахивающее. Супернатант должны быть четкими и красный. Добавляют 2 мл окрашивающего буфера и вихрь кратко. Центрифуга 5 мин при 200 XGAт 4 ° C.
- Слейте супернатант и ресуспендируют осадок Смахивающее.
- Продолжайте проточной цитометрии окрашивания с использованием общего протокола, подробно описанную в шагах 3.1 до 3.3 и следующих антител для мастер-микс: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, Ш1.
- Acquire клеточных образцов с использованием проточного цитометра, по крайней мере , шесть детекторов 9. Определить частоту донорских клеток , полученных для каждой линии (CD19 + В - лимфоцитов, CD3e + Т - лимфоциты, GR1 яркие гранулоцитов) в каждом образце с использованием шаблона анализа , представленного на рисунке 3 , и как опубликованные 10,11.
6. Анализ костного мозга восстанавливающей
- Сбор клеток костного мозга, как описано в разделе 2. Пятно клетки для анализа потока цитометрии с использованием общего протокола, подробно описанную в шагах 3.1 до 3.3 и следующие антитела для мастер-микс: Lineage коктейль, СЦА1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. Обнаружение линEAGE коктейль антител с использованием Флуорохром-конъюгированного стрептавидина, как описано в шаге 3.4.
- Acquire образцы клетки с использованием проточного цитометра, по меньшей мере восемь детекторов 9. Если только шесть доступны, добавьте CD135 к тому же каналу, клонального панели , как CD135 + клетки будут исключены. Определить частоту донорского происхождения Lin - СЦА1 + CD117 + CD135 - CD150 + ГСК в каждом образце с использованием шаблона анализа , представленного на рисунке 4 и опубликованной 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общее описание конкурентной борьбы трансплантата, в том числе вторичных трансплантатов (обсуждается ниже) можно найти на рисунке 1. Представитель анализа для предварительной трансплантации костного мозга ГСК можно найти на рисунке 2. Более подробную информацию об исключении дублетов и мертвые клетки могут быть найдены в других местах 9.
На рисунках 3 и 4 приведены примеры проточной цитометрии шаблонов анализа для периферической крови и костного мозга, соответственно. Это нормально , чтобы обнаружить некоторые хозяина Т - лимфоциты (до 20% от всех Т - клеток; фигура 3В), а Т - клетки являются более радио устойчивостью. Конкурент полученные клетки должны присутствовать во всех трех родах. Предел обнаружения во многом зависит от количества общего числа клеток, полученных для анализа, но в нашем опыте в общей сложности 20 тысяч клеток водного лейкоцитарной ворот обычно бывает достаточно. Используя произвольный порог в 1% или 0,5%, если донорские клетки представляют собой меньшую долю , чем обрезание в любой заданной линии (B лимфоидной, Т - лимфоидных или миелоидных , как показано на рисунке 3), мышь не считается положительным для мультилинейной восстановления , Эта концепция становится важным, когда конкурентные трансплантаты в сочетании с предельным анализом разбавления для количественного определения ГСК доноров, как описано в обсуждении. Это, конечно, можно иметь, например, доноров, полученных Т и В-лимфоцитов, но постепенную потерю миелоидных клеток, которые, как правило, лишь предполагают переходную восстановления. Лимфоциты имеют более длительный период полураспада , чем миелоидных клеток ( в частности Gr1hi SSChi гранулоциты / нейтрофилы) и могут сохраняться даже при отсутствии костного мозга гемопоэтических 10.
На рисунке 5 показаны репрезентативные результаты для периферической химеризма крови при различных местеations. Когда гемопоэтические стволовые клетки - доноры функционально эквивалентны конкурирующими клеток, пропорции донора (CD45.2 +) и конкурента (CD45.1 +) -derived клетки эквивалентны (Фиг.5А). Остаточные клетки - хозяева (CD45.1 + CD45.2 +) на рисунке 5А и 5В почти исключительно Т - лимфоциты , поскольку они более устойчивы радио. Когда донорские клетки представляют собой гораздо меньшую долю лейкоцитов периферической крови (рис 5б), некоторые аспекты функции HSC, вероятно , неисправна и необходимы дальнейшие исследования , как описано в обсуждении. Наличие конкурирующих клеток подтверждает, что анализ работала хорошо, но донор костного мозга был просто менее эффективным. Это в отличие от результата , представленного на рисунке 5С, где доноров и конкурирующие клетки присутствуют в небольших количествах и клетки - хозяева представляют собой большинство клеток периферической крови. В этом случае пересадка была неудачной, и ят не представляется возможным сделать какие-либо выводы об относительной функциональности донора по сравнению с конкурирующими клеток. Различные решения обсуждаются ниже.
. Рисунок 1. Экспериментальный дизайн (A) Для конкурентной трансплантации, клетки костного мозга от мышей - доноров (CD45.2 +; C57BL6 фона, контроль и испытания) и конгенных конкурент мышей (CD45.1 +; B6.SJL) смешивают в в соотношении 1: 1 и вводят в хвостовую вену облученных мышей - реципиентов (CD45.1 + CD45.2 +; F1 потомство C57BL6 х B6.SJL гнездящихся пар). Эффективность восстановления костного мозга определяется в периферической крови (РВ) на 4, 8, 12 и 16 недель после трансплантации и в костном мозге через 16 недель после трансплантации или более поздних версий. (B) Для дальнейшей оценки самообновление трансплантированных клеток, бонклетки костного мозга е оправился от реципиентов после 16 недель могут быть переданы в облученных мышей вторичных получателей помощи. ГСК, гемопоэтические стволовые клетки; MPP, мультипотентны клеток-предшественников; LMPP, лимфоидной загрунтованных MPP. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Предварительная трансплантация ГСК костного мозга шаблон анализа. В отдельных ячеек, выберите HSPCs согласно cKit (CD117) и выражения Lineage. В тусклом / Lin - клеточной популяции, выберите cKit яркие СЦА1 + населения (ЛСК). В LSKs выберите CD150 + CD135 - ГСК. Эта популяция содержит как долгосрочные и краткосрочные заселив ГСК (частоту в пределах ячейки заселив эта популяция будеттвин 1/3 и 1/5). Расчётная частота ГСК костного мозга рассчитывается путем деления числа событий в воротах HSC по количеству событий в одном ворота клетки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. постпересадки шаблон анализа периферической крови. (А) В одиночных камерах, выберите первые GR1 яркие SSC привет гранулоциты. (B) Затем выберите CD19 + CD3e - В - лимфоциты и CD3e + CD19 - Т - лимфоциты. Мышь периферической крови содержит большую долю лимфоцитов, В-лимфоциты с будучи основным типом клеток (примерно 50% всех клеток периферической крови). CE) Нарисуйте 2D проточной цитометрии участков для каждого подмножества с CD45.2 на одной оси и CD45.1 с другой стороны. Определение донора (CD45.2 +), хост (CD45.1 + CD45.2 +) и конкурент клетки (CD45.1 +) для каждой линии , как показано на рисунке. Это нормально , чтобы иметь некоторые оставшиеся клетки - хозяева, особенно в популяции лимфоцитов Т , как показано на панели E. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. постпересадки шаблон анализа HSC костного мозга. В отдельных клеток, выберите HSPCs и LSKs , как показано на рисунке 2. В пределах LSKs выберите CD150 + CD135- ГСК, CD150- CD135- мультипотентных клетки - предшественники (или MPPs) и CD150- CD135 + лимфоидной -primed MPPs (или LMPPs). Доля LMPPs ниже, чем после пересадки в необлученных мышей. Нарисуйте 2D Flow Cytometry участков для каждого подмножества с CD45.2 на одной оси и CD45.1 с другой стороны. Выявление доноров, хозяина и конкурентов клеток для каждой субпопуляции, как показано на рисунке. Если облучение и трансплантация успешно, должна быть очень немногих оставшихся HSPCs хоста. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Представитель результаты периферической крови химеризма. (А) успешной трансплантации , когда донор ГСК функционально эквивалентны конкуренту клеток. Подавляющее большинство остальных клеток - хозяев (CD45.1 + CD45.2 +), как правило , Т - лимфоциты. (B) Успешная трансплантация , где донор ГСК показывают снижение функции по сравнению с конкурирующими клетками. Это привело к уменьшению вклада может быть обусловленопотребуется несколько различных факторов, и дальнейший анализ (обсуждение см). (C) Неудачная пересадка с низкими частотами как конкурента и донорских клеток и значительная часть оставшихся клеток - хозяев. Этот тип результата предполагает ниже ожидаемой дозы облучения, неудачными инъекции (снижение жизнеспособности клеток, снижение объема инъекции, инъекции за пределы хвостовой вены), или их комбинации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, предназначен для оценки относительной пригодности доноров (тест) ГСК от известных конкурента ГСК. Ситуация конкуренции увеличивает относительную чувствительность анализа (что более вероятно обнаружить умеренное снижение в стволовых клеток пригодности) и обеспечивает внутренний технический контроль за эффективностью облучения и инъекции. Тем не менее, это не следует использовать в качестве абсолютной мерой HSC пригодности; снижение конкурентного восстановления автоматически не означает, что ГСК не будет хорошо работать в условиях отсутствия конкуренции. Хотя можно утверждать, что конкурентная установка является лучшей отправной точкой, как конкурент клетки будут спасать дефектный функцию HSC и всех мышей-реципиентов будет выжить, нужно быть осторожным с интерпретацией результатов. Подтверждая результаты в неконкурентной обстановке будет затвердевать выводы.
Экспериментальный дизайн, представленный здесь использует HSC эквивалент Quantities от общего числа клеток костного мозга вместо чистых популяций проточной цитометрии -sorted ГСК. Важно , чтобы уравнять количество ГСК во всех группах населения в рамках исследования (различные доноры, конкурента) , чтобы устранить изменчивость между различными донорами и обеспечить , чтобы изменения фенотипического частоты HSC не будет интерпретироваться как изменения в функции HSC 14. Преимущества подхода, описанного здесь более очищенных ГСК являются: улучшение жизнеспособности клеток из-за укороченных время обработки и отсутствие внешнего давления при сортировке; и улучшенное наведение в костном мозге реципиент (наличие антител на отсортированных клеток может помешать их приживления в костном мозге 15). С другой стороны, основным недостатком является вкладом без HSC населения к исходу трансплантата, в частности, роль короткоживущих клеток-предшественников в ранние моменты времени после трансплантации. Кроме того, если обработка или генетическая модификация изменяет экспрессию Surfacе маркеры , используемые для выбора ГСК 16, может быть значительное количество ГСК "замаскированным" в одном образце , но не в другом, который будет исказить результаты. Тем не менее, та же проблема может также возникнуть при использовании очищенных ГСК и свойственен анализа трансплантата.
Результаты, полученные с использованием данного протокола являются качественными только на уровне населения. Другими словами, уменьшенный вклад донорских клеток после трансплантации может быть из-за; меньшее количество функциональных ГСК в исходной популяции; уменьшенная способность отдельных ГСК селиться в костный мозг и расширяться в первые дни и недели после трансплантации; или проблемы с дифференциацией и ростом в зрелые клетки, которые используются для обнаружения на периферии. Таким образом, важно, чтобы не использовать результаты от конкурентной пересадки в изоляции, а дополнять их с анализами, которые измеряют пролиферацию клеток, выживание и дифференцирование от HSC циркулирующих клеток крови. Важно также , чтобы сравнить вклад донорских клеток между периферической крови (Рисунок 3) и костного мозга (рисунок 4) Присутствие доноров полученных ГСК в костном мозге в сочетании с отсутствием донорских клеток в периферической крови будет свидетельствовать о дифференциации блока , Хотя это и не показано в примере, можно также оценить эритроидного воссоздание на основе различных изоформ GPI1 17. С учетом большого количества эритроцитов, присутствующих в крови, они представляют собой высокочувствительный метод обнаружения для донора клеток, которые могут быть особенно полезны, когда трансплантировать низкое количество ГСК или после их выхода в течение длительного периода времени. На другом конце спектра, миелоидные клетки часто первыми терпят неудачу обнаружения, частично из-за их низкой частоты в периферической крови и частично из-за их короткого периода полураспада.
Можно приспособить юе конкурентное репопуляция анализ, чтобы количественно оценить ГСК с использованием предельного анализа разбавления (или LDA). Это потребует гораздо большего числа мышей-реципиентов разделены на несколько групп, где каждая группа получает различное соотношение конкурента: клетки донора, либо сортированные или несортированные, как описано выше. По мере того как число донорских клеток уменьшается, будет больше мышей, в которых доля донорских клеток, полученных не достигает заранее установленного порогового значения в одном или нескольких линий. Затем можно построить частоту "отрицательного" мышей в группе по сравнению с количеством пересаженных клеток донора и определяют частоту ГСК из последующего графа 18,19.
Предлагаемый срок после трансплантации наблюдения варьируется в литературе. Там раньше определенного консенсуса, где был рассмотрен период 16 недель после пересадки, чтобы быть достаточным, чтобы отразить выход долгосрочной ГСК. Однако недавние сообщения о "Яntermediate "ГСК функция, снижается вскоре после 16 недель подчеркнули необходимость еще более строгой оценки функции HSC 17. Это, конечно , возможно продлить последующую деятельность получателей трансплантата мимо момент времени 16 недель , чтобы удовлетворить эти проблемы. альтернативный вариант, еще раз с возможно более высокой чувствительностью, является вторичным трансплантат (рис 1B), где клетки костного мозга выделяют из получателей первой пересадки вводят в облучаемых вторичных получателей. Вторая пересадка оказывает дополнительное пролиферативный давление на ГСК, заставляя их выход от дремоты и позволяя только клетки с робастной самообновления для поддержания их производства. иногда предпочтительно использовать отсортированные клетки-доноры более эффективно регулировать количество HSC между различными образцами для вторичных трансплантатов. в качестве альтернативы можно установить предполагаемое отношение донора : конкурент ГСК из первичного костного мозга (например,
Как уже упоминалось выше, существует целый ряд причин, почему данный популяция доноров ГСК может понижается мощность для долгосрочного восстановления. Одной из таких причин является способность ГСК мигрировать в костный мозг после трансплантации (также называемые самонаведения) и оседают себя в нише костного мозга. Можно адаптировать протокол, представленный здесь, чтобы исследовать костного мозга самонаведения и краткосрочный рост. Необходимо увеличивать количество трансплантированных клеток (эквивалент 5000-10000 ГСК длясамонаводящиеся анализы и 1000-2000 ГСК для анализа в течение первой недели после пересадки). В анализе возврата в исходное положение, мышей-реципиентов умерщвляют в течение первых 16-24 ч после трансплантации, и количество доноров ГСК, которые достигли костного мозга определяется, как описано в настоящем протоколе. Для дальнейшей оценки их функции, клетки костного мозга , извлеченные из краткосрочных получателей могут быть пересажены во вторичные реципиентов , как описано на рисунке 1В. Доля донорских клеток, полученных во вторичных получателей затем могут быть использованы для оценки способности доноров ГСК мигрировать и освоиться в костном мозге реципиент.
Основные проблемы, связанные с конкурентной трансплантаций костного мозга возникают в результате облучения и инъекции и представить себя в качестве либо повышенной смертности после трансплантации или снижение эффективности восстановления. Сплит-доза облучения, как представлено здесь, как правило, связаны с более эффективным и myeloablationменьше токсичность по сравнению с однократной дозой 20. С доза рекомендуется здесь (два раза 450 РАУ), популяции лимфоидных миелоидной и B эффективно удаляются , но остаточные Т - лимфоциты делать остаются (Рисунок 3). Если есть какие-либо основания подозревать, отторжения трансплантата (донора и реципиента мышей от различных генетических фонов), более высокую дозу облучения (две дозы 550-600 радах) и более короткую задержку между двумя дозами (4 ч вместо на следующий день ) должны помочь устранить остаточные Т-лимфоциты и уменьшить вероятность отторжения трансплантата из-за отторжения. Неправильное инъекции или инъекции в периваскулярной пространство вместо хвостовой вены, проблемы с жизнеспособности донорских клеток, или контаминации донорских клеток из-за отсутствия медицинской помощи во время подготовки пробы также увеличит отказ трансплантата и постпересадки смертности. Неэффективное облучение (из-за технических проблем, к примеру) приведет к снижению эффективности восстанавливающей, но не следует увеличивать моrtality. Во всех этих ситуациях, наличие конкурирующих клеток в анализе помогает диссоциировать технические проблемы (как подробно описано здесь) с добросовестной уменьшением донорской функции HSC как конкурент клетки всегда должны быть в состоянии восстановить облученный получателя. Иммунодефицитом хозяева могут быть также использованы, например, чтобы уменьшить потребность в облучении и / или риск отторжения трансплантата, а также для оценки функции человеческого ГСК 21-23.
В заключение мы приведем здесь конкурентную протокол трансплантата, который может быть адаптирован для различных применений, как описано в обсуждении. Наш подход использует HSC эквиваленты, что уменьшает время обработки и одновременно повышает жизнеспособность клеток в трансплантате по сравнению с сортировкой клеток. Кроме того, практическое решение, когда доступ к мобильному сортировщика ограничен, и требует меньшего количества мышей по сравнению с количественным анализом LDA, что делает его привлекательным отправной точкой для анализа функции HSC. </ Р>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарны Roxann хету-Арбор за помощь в разработке фигуры и демонстрации процедур. Исследования, проведенные в лаборатории была поддержана Transition награду от Cole Foundation, Discovery грант №. 419226-2012 от естественных наук и инженерного исследовательского совета Канады (NSERC) и Канада Фонд инноваций (CFI Лидеры фонда грант №. 31377). KMH является Chercheur-Boursier Младший для Fonds де Recherche дю Квебек - Santé (FRQS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| 20 G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | |
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μg/ml |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μg/ml |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μg/ml |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μg/ml |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μg/ml |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μg/ml |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 56149 | 0.5 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0.25 μg/ml |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 558162 | 0.25 μg/ml |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μg/ml |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0.625 μg/ml BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1 ml tuberculin syringe with 27 G needle | BD Syringe | 309623 | |
| 1 ml tuberculin syringe with 25 G needle | BD Syringe | 309626 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 |
References
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
