Introduction
Hæmatopoiese er en regenerativ proces, der sikrer påfyldning af blodlegemer, der er gået tabt gennem skade, stråling og celledød. Denne proces sikres ved hæmatopoietiske stamceller (HSC), der stort set er bosiddende i den voksne knoglemarven. Desuden kan hæmatopoietiske stamceller anvendes til terapeutiske formål i autoimmune sygdomme, hæmatologiske maligniteter og immundefekter 1. Der er derfor behov for bedre at forstå de mekanismer, der regulerer HSC funktion, herunder deres proliferative ekspansion og deres evne til at nå og indpode modtageren knoglemarv efter transplantation. Selv om de seneste undersøgelser har rapporteret adskillige celleoverflademarkører, herunder SLAM familiemedlemmer CD150 og CD48, til fremadrettet berige voksne HSC'er og føtale HSC'er til ca. 50% renhed 2-4, guldstandarden foranstaltning til funktionel HSC'er forbliver et in vivo repopulating assay til bestemme deres evne til at genetablere blod cell produktion i en bestrålet vært fem.
In vivo klonal repopulation assay blev oprindeligt udviklet af Till og McCulloch 6 og er siden blevet forfinet og udvidet. Som oprindeligt defineret, HSC'er sikre produktionen livslang blodlegemer gennem selvstændig fornyelse og differentiering. Overførslen af HSC'er i en bestrålet recipient tillader således os at vurdere: deres evne til at differentiere gennem en analyse af de forskellige blodcellelinjer (T-lymfocytter, B-lymfocytter, granulocytter, monocytter) og deres evne til selvfornyelse via seriel transplantation. Analysen vil normalt indebære en sammenligning af funktionalitet og / eller mængden af to populationer af HSC'er, fx celler, der kommer fra to mus af forskellige genotyper eller celler, der er blevet behandlet eller ubehandlet med forskellige faktorer, der kan påvirke vedligeholdelse eller udvidelse af HSC'er i kultur. Donorkimærisme, eller bidrag overført donor HSC'er to blodlegemer kan derefter bestemmes ved hjælp af flowcytometri analyse i det perifere blod og knoglemarv under anvendelse celleoverflademarkører eller andre metoder, der vil skelne donorceller fra modtageren, eller vært. De mest anvendte markører er helt klart de to alleler for det gen Ptprc eller CD45 leukocyt antigen 7, som vi har valgt til eksempler nedenfor.
Den klonale repopulation analysen kan enten være konkurrencedygtige eller ikke-konkurrencedygtige. I en ikke-kompetitiv indstilling, er kontrol- og test- HSC'er overført til separate recipientmus og resultaterne for hver celletype vil være uafhængigt af den anden. I en konkurrencepræget indstilling, er funktionen af både test og kontrol HSC'er målt mod en befolkning på konkurrent HSC'er. Den her beskrevne protokollen bruger den konkurrencemæssige indstilling, men kan også tilpasses til ikke-konkurrencesituationer. Begge metoder har deres fordele og begrænsninger, og vi vil sammenligne dem i detaljer idiskussion. Vi beskriver også forskellige strategier for at sikre lighed i antallet af transplanterede HSC'er, forklare, hvordan at tilpasse analysen til kvantificering af HSC'er ved at begrænse fortynding assay (LDA), og give eksempler på både vellykkede og mislykkede transplantationer for fortolkning af resultaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der er beskrevet i denne protokol er blevet godkendt af den institutionelle dyreetik udvalg og følger den canadiske Rådet om Animal Care retningslinjer.
Bemærk: For at opretholde sterile / specifikke patogenfrie boligforhold, udføre alle procedurer, der involverer direkte håndtering af levende mus inde i et biologisk sikkerhedsskab eller en laminar flow hætte. Rens eller sterilisere bure, fastholdelsesanordninger, boliger materialer, chow og vand leveres til dyrene korrekt. Brug kun sterile, engangsnåle til injektioner og blodprøvetagning. Aseptisk teknik er afgørende under fremstillingen af implantatet.
1. Udarbejdelse af Modtager Mus
- Identificer modtagende mus med øre hak (eller anden metode, der er godkendt af den lokale dyreetik komité 8) for at aktivere individuel opfølgning af perifert blod og knoglemarv rekonstituering over tid. Afvejes musene for post-transplantation opfølgning. Ose modtagende mus, der er mellem 7 og 12 uger gamle (mindre end 25 g).
Bemærk: I den medfølgende eksempel blev CD45,1 + CD45,2 + modtagende mus avlet i hus ved at krydse C57BL / 6 mus med kongene B6.SJL mus. - Bestråle recipientmus med to doser på 450 rad for at ødelægge hæmatopoietisk aktivitet. Giv den første dosis dagen før transplantationen og den anden 1-2 timer før transplantationen.
Bemærk: X-ray eller gammastråler kan både bruges afhængigt af tilgængeligheden af egnede faciliteter.
2. Udarbejdelse af Donor og Konkurrent knoglemarvsceller
- Afliv donor (test og kontrol CD45,2 +) og konkurrent (CD45,1 +; B6.SJL) mus ved CO 2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation eller ved hjælp af metoder, der er godkendt af den lokale dyreetik udvalg.
- Placer mus på deres ryg, ben åbne bred, i en tom petriskål eller på en steril gaze (for at holde bordpladen ren) iNside et biologisk sikkerhedsskab. Våd hud og pels med 70% ethanol / 30% H2O (v / v).
- Skær foden med en kirurgisk kniv eller skarpe saks. Skær åbne huden langs benet og trække væk huden ved hjælp af savtakkede pincet. Skåret væk overskydende muskel.
- Forrykke femur ved at trække på benet knogle og under anvendelse sakseblade mod bækkenknoglerne som modkraft. Frigør skinneben og lårben fra knæskallen og fjerne de resterende stumper af muskler og sener. Placer knoglerne i 2-3 ml steril phosphatbufret saltvand (PBS) i en 6-brønds vævskulturplade.
- Indsamle knoglemarvsceller ved at skylle knoglerne med 5 ml sterilt PBS.
- Hold knoglen forsigtigt med pincet og indsætte en 25 G nål fastgjort til en fyldt 1 ml sprøjte til den ene ende af knoglen. Tryk på stemplet og indsamle cellerne i et 15 ml konisk rør. Gentag om nødvendigt, indtil midten af knoglen er hvid.
- Dissociere cellerne ved gentagen passage gennem nålen tilopnåelse af en enkelt cellesuspension. Undgå bobler og overskydende kraft. Bemærk: Anvend en lidt større nål (22 g) for at forbedre cellernes levedygtighed på dette trin.
- Passere cellerne gennem et 70 um nylon si for at sikre ensartet cellesuspension og at fjerne snavs og klumper.
- Fjern en portion til celletælling ved hjælp af et hæmocytometer. Centrifugeres den resterende cellesuspension ved 200 xg i 5 min ved 4 ° C. Genjuster celledensitet som krævet i sterilt PBS (10 8 celler / ml). Hold cellerne på is.
3. Etablering af Donor Cell HSC ækvivalenter
- Overfør der svarer til 3 x 10 6 celler (30 pi) i en 5 ml rundbundet polystyrenrør til flowcytometri farvning. Tilsættes samme mængde af umærket antistof mod CD16 / CD32 at blokere ikke-specifik farvning (fortyndet i farvning puffer (PBS suppleret med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) og 1 mM EDTA) til en slutkoncentration på 2,5 ug / ml). Inkuber 5 min ved stuetemperatur.
- Tilføj 90 pi fluorokromkonjugerede antistof mester mix forberedt i farvning buffer: biotinyleret Lineage cocktail (B220, CD3e, CD11, GR1, TER119), Sca1, CD117, CD135, CD150. Der inkuberes på is i 30 minutter, beskyttet mod lys.
Bemærk: Der bør fastlægges passende fortyndinger for hvert parti af antistof. Se tabel af materialer til fortyndinger anvendt i denne undersøgelse. - Der tilsættes 2 ml farvning buffer til cellerne, vortex og centrifugeres ved 200 xg i 5 min ved 4 ° C for at fjerne ubundet antistof. Dekanteres supernatanten og resuspender pellet ved at tænde.
- Tilsæt 10 pi fluorokromkonjugerede streptavidin fortyndet i farvning puffer (se Materialer tabel). Der inkuberes på is i 20 minutter, beskyttet mod lys. Vask som i trin 3.3 for at fjerne ubundet streptavidin.
- Erhverve celleprøver bruger flowcytometer med mindst seks detektorer 9. Bestem frekvensen af Lin - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150
Bemærk: Hyppigheden af funktionelle HSC'er inden for denne befolkning kan estimeres mellem 1/3 og 1/5 2,12. - Etablere anslåede HSC ækvivalenter for alle prøver 11, ved hjælp af en prøve (typisk, konkurrenten, B6.SJL CD45,1 + i dette eksempel) som baseline som beskrevet nedenfor og i figur 2.
- Beregn antallet af celler, der kræves ved følgende formler:
#transplanted HSC'er / modtager = 5 x 10 5 celler x estimeret HSC frekvens (som bestemt for baseline prøve, dette tal er normalt mellem 75 og 125 for vildtype C57BL / 6 mus) 10-12.
Bemærk: I figur 2 for prøve A, er resultatet 139 HSC'er.
samlet antal transplanterede celler (for andre prøver; fx prøve B i figur 2) = # transplantet HSC'er / HSC frekvens.
Bemærk: I figur 2 for prøve B, er resultatet 197.826 (eller ca. 2 x 10 5) totale knoglemarvsceller.
- Beregn antallet af celler, der kræves ved følgende formler:
- Beregn det samlede antal celler, der kræves pr graft recipient for hver prøve ved anvendelse af de opnåede resultater ovenfor.
Bemærk: Dette tal skal være 5 x 10 5 til baseline prøve (konkurrent).- Gange antallet opnået fra trin 3.7 med antallet af recipientmus og tilføje nok celler i mindst to yderligere mus for at kompensere for den døde volumen i sprøjten.
- Bland konkurrent (fx CD45,1 +) og testceller (CD45,2 +) i 1: 1 HSC ækvivalentforhold som beregnet i trin 3.6 og det endelige rumfang justeres til 200 pi per injektion under anvendelse af sterilt PBS.
Bemærk: Til en gruppe på fem recipientmus den foreslåede volumen ville således være mindst 1,4 ml, indeholdende 3,5 x 10 6 konkurrerende knoglemarvsceller (eller973 estimerede HSC'er for prøve A i figur 2), og det tilsvarende antal testceller (i figur 2, vil den tilsvarende for Sample B være 197.826 x 7 = 1,384,782 knoglemarvsceller).
4. Bone Marrow Transplantation
- Varm op de modtagende mus bestrålet i trin 1.2 med en rød varmelampe at sikre udvidelse af blodkarrene og for at gøre den laterale hale vener mere synlig.
- Forbered en 1 ml tuberkulin sprøjte udstyret med en 27 G nål (eller mindre). Aspirer omkring 750 pi af den fremstillede cellesuspension (for 3 recipientmus). Sørg for at der ikke er luftbobler i sprøjten.
- Sæt musen i en fastholdende anordning. Undersøg halen og se efter de laterale halevenerne, der bør være klart synlig på begge sider af halen. Tør injektionsstedet med ethanol. Indsæt nåleaffasningen op, parallelt med huden og tryk forsigtigt stemplet. Injektion bør være let. Hvis kraften er rePÅKRÆVET, nålen er ikke i venen.
Bemærk: Ældre mus har tykkere hud, hvilket kan gøre at finde venen vanskeligere. Hvis nålen ikke er i venen, genindsætte nålen proximalt til den oprindelige injektionsstedet. - Fjern nålen og tryk på injektionsstedet med gaze i et par sekunder for at stoppe blødningen. Overfør musen i en ren bur.
Bemærk: Brug den samme sprøjte og kanyle til tre injektioner, hvorefter nålen kan blive for kedelige. - For efter transplantationen opfølgning, injicere 1 ml sterilt PBS subkutant at rehydrere musene i de første fem dage. Tilføj antibiotika i drikkevand for at undgå infektioner (hvis påkrævet ekstraudstyr). Afvej mus hver to til tre dage for de første tre uger, og aflive mus, der har mistet mere end 15-20% af deres pre-transplantation kropsvægt (eller som fastsat af den lokale dyreetik komité).
5. Analyse af perifert blod
- Saml en dråbe blod (approx. 50-100 pi) i EDTA-rør.
- At indsamle blod fra mandibular vene, bruge en lancet eller en 22 G nål til at stikke ansigtshuden nær den hårløse stedet placeret under kæbebenet og placer indsamling røret for at modtage bloddråben 13. Indsamle blod ved 4, 8, 12 og 16 uger efter transplantation for at følge multi-slægt rekonstitution.
- Der tilsættes 1 ml frisk fremstillet RT røde blodlegemer lysepuffer (9 dele 0,16 M NH4Cl + 1 del 0,17 M Tris-HCI pH 7,65) til dråbe blod opsamlet i trin 5.1.1. Bland og overførsel prøven til en 5 ml rundbundet polystyrenrør egnet til flowcytometri. Lad det stå i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsættes 4 volumener iskold PBS. Bland ved at dreje ende-til-ende og overføre straks på is. Centrifugen 10 minutter ved 200 xg ved 4 ° C.
- Dekanteres supernatanten og resuspender pellet ved at tænde. Supernatant skal være klar og rød. Tilsæt 2 ml farvning buffer og vortex kortvarigt. Centrifuger i 5 minutter ved 200 XGAt 4 ° C.
- Dekanteres supernatanten og resuspender pellet ved at tænde.
- Fortsæt med flowcytometri farvning ved hjælp af generelle protokol beskrevet i trin 3.1 til 3.3, og de følgende antistoffer for master mix: CD45,1, CD45,2, CD3e, CD19, GR1.
- Erhverve celleprøver bruger flowcytometer med mindst seks detektorer 9. Bestem frekvensen af donor-afledte celler for hver linie (CD19 + B-lymfocytter, CD3e + T-lymfocytter, GR1 lyse granulocytter) i hver prøve ved hjælp af analysen skabelon tilvejebragt i figur 3 og som offentliggjort 10,11.
6. Analyse af Bone Marrow Rekonstituering
- Saml knoglemarvsceller som beskrevet i afsnit 2. Stain cellerne til flowcytometri analyse ved hjælp af den generelle protokol beskrevet i trin 3.1 til 3.3 og følgende antistoffer til master mix: Lineage cocktail, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45,1 , CD45,2. Detect linEAGE cocktail antistoffer ved anvendelse fluorochrom-konjugeret streptavidin som beskrevet i trin 3.4.
- Erhverve celleprøver bruger flowcytometer med mindst otte detektorer 9. Hvis der kun seks er til rådighed, tilføje CD135 til den samme kanal som afstamning panel som CD135 + celler vil blive udelukket. Bestem frekvensen af donor-afledte Lin - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + HSC'er i hver prøve ved hjælp af analysen skabelon tilvejebragt i figur 4 og som offentliggjort 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En generel beskrivelse af den konkurrencemæssige transplantation indstilling, herunder sekundære transplantationer (diskuteret yderligere nedenfor) kan findes i figur 1. Kan findes en repræsentativ analyse for pre-transplantation knoglemarv HSC'er i figur 2. Mere detaljerede oplysninger om udelukkelse af dubletter og døde celler kan findes andre steder 9.
Figur 3 og 4 giver eksempler på flowcytometrianalyse skabeloner til perifert blod og knoglemarv henholdsvis. Det er normalt at detektere nogle host T-lymfocytter (op til 20% af alle T-celler, figur 3B), som T-celler er mere radio-resistente. Konkurrent-afledte celler bør være til stede i alle tre cellelinier. Detektionsgrænsen afhænger meget af det samlede antal celler erhvervet til analyse, men i vores erfaring i alt 20 tusind celler ienkelt leukocyt gate er normalt tilstrækkeligt. Ved anvendelse af en vilkårlig tærskelværdi på 1% eller 0,5%, hvis donorceller repræsenterer en lavere andel end cutoff i en given slægt (B lymfoid, T lymfoid eller myeloid som vist i figur 3), er musen ikke positiv for multilineage rekonstitution . Dette koncept bliver vigtig, når de konkurrencemæssige transplantationer er kombineret med en begrænsende fortynding assay til at kvantificere donor HSC'er som forklaret i diskussionen. Det er bestemt muligt at have, for eksempel, donor-afledte T og B-lymfocytter, men gradvist tab af myeloide celler, som normalt vil foreslå kun forbigående rekonstituering. Lymfocytter har længere halveringstider end myeloide celler (især Gr1hi SSChi granulocytter / neutrofiler) og kan vare ved, selv i fravær af knoglemarven HSC'er 10.
Figur 5 afbilder repræsentative resultater for perifert blod kimærisme under forskellige situtioner. Når donor HSC'er er funktionelt svarer til konkurrenternes celler, andelen af donor (CD45,2 +) og konkurrent (CD45,1 +)-afledte celler er ækvivalente (figur 5A). De resterende værtsceller (CD45,1 + CD45,2 +) i figur 5A og 5B er næsten udelukkende T-lymfocytter, som de er mere radio-resistente. Når donorceller præsentere en langt lavere andel af perifere blodleukocytter (figur 5B), nogle aspekter af HSC funktion sandsynligvis defekt og er behov for yderligere undersøgelser, som beskrevet i diskussionen. Tilstedeværelsen af konkurrerende celler bekræfter, at assayet fungerede godt, men donorknoglemarv var simpelthen mindre effektiv. Dette er i modsætning til resultatet vist i figur 5C, hvor både donor- og konkurrerende celler er til stede i lavt antal og værtsceller udgør størstedelen af perifere blodceller. I dette tilfælde transplantationen mislykkedes og jegt er ikke muligt at drage konklusioner med hensyn til den relative funktionalitet donor versus konkurrerende celler. Forskellige løsninger diskuteres yderligere nedenfor.
. Figur 1. Eksperimentel design (A) For en konkurrencedygtig transplantation, knoglemarvsceller fra donor mus (CD45,2 +; C57BL6 baggrund, kontrol og test) og kongene konkurrerende mus (CD45,1 +; B6.SJL) blandes i en 1: 1-forhold og injiceret i halevenen af bestrålede recipientmus (CD45,1 + CD45,2 +; F1 afkom af C57BL6 x B6.SJL ynglende par). Effekten af knoglemarv rekonstituering bestemmes i perifert blod (PB) ved 4, 8, 12 og 16 uger efter transplantation og i knoglemarven ved 16 uger efter transplantation eller senere. (B) For yderligere at evaluere selv-fornyelse af transplanterede celler, bone marv celler udvundet fra transplanterede patienter efter 16 uger kan overføres til bestrålede sekundære modtagende mus. HSC, hæmatopoietisk stamcelle; MPP, multipotent progenitorcelle; LMPP, lymfoid-primet MPP. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Pre-transplantation knoglemarv HSC analyse skabelon. Inden enkelte celler, skal du vælge HSPCs ifølge cKit (CD117) og Lineage udtryk. Inden for Lin dim / - celle population, skal du vælge cKit lyse Sca1 + population (LSK). Inden LSKs Vælg CD150 + CD135 - HSC'er. Denne population indeholder både langsigtede og kortsigtede genbefolkning HSC'er (frekvensen af en repopulation celle inden for denne population er væreTween 1/3 og 1/5). Den anslåede hyppighed af knoglemarv HSC'er beregnes ved at dividere antallet af begivenheder i HSC gate med antallet af hændelser i den enkelte celle gate. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Post-transplantation blodanalyse perifer skabelon. (A) Inden enkelte celler, skal du vælge første GR1 lyse SSC hi granulocytter. (B) Vælg derefter CD19 + CD3e - B-lymfocytter og CD3e + CD19 - T-lymfocytter. Mus perifert blod indeholder en stor andel af lymfocytter, med B-lymfocytter er den største celletype (ca. 50% alle perifere blodlegemer). CE) Tegn 2D flowcytometri plots for hver delmængde med CD45.2 på den ene akse og CD45,1 på den anden. Identificer donor (CD45,2 +), vært (CD45,1 + CD45,2 +) og konkurrerende celler (CD45,1 +) for hver linie som vist. Det er normalt at have nogle resterende værtsceller, især i T-lymfocyt befolkning, som ses i panelet E. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Post-transplantation knoglemarv HSC analyse skabelon. Indenfor enkelte celler, skal du vælge HSPCs og LSKs som vist for figur 2. Inden LSKs Vælg CD150 + CD135- HSC'er, CD150- CD135- multipotente stamfædre (eller MPP'erne) og CD150- CD135 + lymfoide -primet MPP'erne (eller LMPPs). Andelen af LMPPs er lavere efter transplantation end i ikke-bestrålede mus. Tegn 2D flow cytometry plots for hver delmængde med CD45,2 på en akse og CD45,1 på den anden. Identificer donor, vært og konkurrerende celler til hver delpopulation som vist. Hvis bestråling og transplantation er en succes, bør der være meget få tilbageværende vært HSPCs. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Repræsentative resultater for perifert blod kimærisme. (A) Vellykket transplantation, hvor donor HSC'er er funktionelt ækvivalente med konkurrerende celler. Langt størstedelen af resterende værtsceller (CD45,1 + CD45,2 +) er normalt T-lymfocytter. (B) Vellykket transplantation, hvor donor HSC'er viser nedsat funktion i sammenligning med konkurrerende celler. Denne nedsatte bidrag kan skyldesflere forskellige faktorer og yderligere analyse vil være nødvendig (se diskussionen). (C) Mislykket transplantation med lave frekvenser af både konkurrent og donorceller og en stor del af de resterende værtsceller. Denne type af resultat tyder på en lavere end forventet dosis bestråling, mislykket injektion (nedsat levedygtighed celle, nedsat volumen af injektion, uden af halen vene), eller en kombination af disse. Klik her for at se en større version af dette tal .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne protokollen er designet til at evaluere den relative egnethed af donor (test) HSC'er mod kendt konkurrent HSC'er. Situationen for konkurrence øger den relative sensitivitet (mere tilbøjelige til at opdage moderate fald i stamceller fitness) og giver en intern teknisk kontrol for effekten af bestråling og injektion. Det bør dog ikke anvendes som et absolut mål for HSC fitness; et fald i konkurrencemæssig rekonstituering betyder ikke automatisk, at HSC'er ikke ville klare sig godt i den manglende konkurrence. Selv om det kan hævdes, at en konkurrencedygtig indstilling er det bedre udgangspunkt, som de konkurrerende celler vil redde defekte HSC funktion og alle modtagende mus vil overleve, skal man være forsigtig med fortolkningen af resultaterne. Bekræftelse resultaterne i en ikke-konkurrencepræget indstilling vil størkne konklusionerne.
Det eksperimentelle design præsenteres her bruger HSC tilsvarende quantities af totale knoglemarvsceller i stedet for rene populationer af flowcytometri -sorterede HSC'er. Det er vigtigt at udligne antallet af HSC'er i alle populationer, der undersøges (forskellige donorer, konkurrent) for at udelukke variabilitet mellem forskellige donorer og at variationerne i fænotypisk HSC frekvens ikke vil blive fortolket som ændringer i HSC funktion 14. Fordelene ved den fremgangsmåde, der er beskrevet her over oprensede HSC'er er: forbedret cellelevedygtighed grundet kortere sagsbehandlingstider og manglende ydre tryk under sortering; og forbedret homing til modtageren knoglemarv (tilstedeværelsen af antistoffer på sorterede celler kan forstyrre deres indpodning i knoglemarven 15). Omvendt er den største ulempe er bidrag fra ikke-HSC populationer til transplantationen udfald, navnlig rollen som kortlivede progenitorceller på tidlige tidspunkter efter transplantation. Desuden, hvis behandling eller genetiske modifikation ændrer ekspressionen af overfladeaktivee markører, der anvendes til udvælgelse af HSC'er 16, kan der være et betydeligt antal HSC'er "i forklædning" i én prøve, men ikke i en anden, som vil skævhed resultaterne. Dog kan det samme problem også opstå, når du bruger oprensede HSC'er og er uløseligt forbundet med transplantation analysen.
De opnåede ved hjælp af den nuværende protokol resultater er kun kvalitative på populationsniveau. Med andre ord kan et fald i bidraget af donorceller efter transplantation skyldes; et lavere antal funktionelle HSC'er i start befolkning; en formindsket evne af de enkelte HSC'er at bosætte sig i knoglemarven og ekspandere i de første dage og uger efter transplantation; eller problemer med differentiering og vækst til modne celler, der anvendes til påvisning i periferien. Det er derfor vigtigt ikke at bruge resultaterne fra en konkurrencemæssig transplantation i isolation, men at supplere dem med analyser, der vil måle celleproliferation, overlevelse og differentiering fra HSC til cirkulerende blodceller. Det er også vigtigt at sammenligne donorcelle bidrag mellem perifert blod (figur 3) og knoglemarv (figur 4) Tilstedeværelse af donorafledte HSC'er i knoglemarven kombineret med fraværet af donorceller i perifert blod ville være tegn på en differentieringsblokaden . Selvom det ikke er vist i eksemplet, er det også muligt at vurdere erythroid rekonstituering baseret på forskellige isoformer af Gpi1 17. I betragtning af det store antal erythrocytter stede i blod, de repræsenterer en meget følsom metode til påvisning til donor-afledte celler, der kan være særlig nyttig, når transplantere lave antal af HSC'er eller efter deres produktion over lange perioder. I den anden ende af spektret, myeloide celler er ofte de første til at mislykkes at blive opdaget, dels på grund af deres lave frekvens i perifert blod og dels på grund af deres korte halveringstid.
Det er muligt at tilpasse the konkurrencedygtig repopulation assay for at tillade kvantificering af HSC'er hjælp af begrænsende fortynding assay (eller LDA). Dette vil kræve et langt større antal modtagende mus opdelt i flere forskellige grupper, hvor hver gruppe modtager et anderledes forhold mellem konkurrent: donorceller, enten sorterede eller usorterede som beskrevet ovenfor. Da antallet af donor celler falder, vil der være flere mus, hvor andelen af donor-afledte celler ikke når den forud fastsat tærskel i en eller flere afstamninger. Det er da muligt at plotte frekvensen af "negative" mus pr gruppe i forhold til antallet af transplanterede donorceller og bestemme frekvensen af HSC'er af den følgende graf 18,19.
Den foreslåede varighed af post-transplantation opfølgning varierer i litteraturen. Der plejede at være sikker på konsensus, hvor periode på 16 uger efter transplantation blev anset for at være tilstrækkelig til at afspejle produktionen af langsigtede HSC'er. De seneste rapporter om "intermediate "HSC'er hvis funktion aftager kort efter 16 uger har understreget behovet for endnu mere stringent vurdering af HSC-funktion 17. Det er bestemt muligt at udvide opfølgningen af de transplanterede patienter forbi 16 uger tidspunkt at tilfredsstille disse bekymringer. En alternativ mulighed, endnu en gang med en velsagtens højere følsomhed, er den sekundære transplantation (figur 1B), hvor knoglemarvsceller udvundet fra første transplanterede patienter injiceres i bestrålede sekundære recipienter. den anden transplantation sætter ekstra proliferativ pres på HSC'er, tvinger deres exit fra hviletilstand og tillader kun celler med robust selvfornyelse at opretholde deres produktion. det er nogle gange foretrukket at anvende sorterede donorceller bedre at justere HSC tal mellem forskellige prøver for de sekundære transplantater. Alternativt er det muligt at etablere en anslået forhold mellem donor : konkurrerende HSC'er fra den primære knoglemarv (f.eks
Som nævnt ovenfor er der en række årsager til, hvorfor en given population af donor HSC'er kan udvise nedsat kapacitet til langsigtet rekonstitution. En sådan årsag er evnen af HSC'er til at vandre til knoglemarven efter transplantation (også kaldet homing) og afregne sig i knoglemarven niche. Det er muligt at tilpasse den protokol præsenteres her at undersøge knoglemarven homing og kortsigtet ekspansion. Det er nødvendigt at øge antallet af transplanterede celler (svarende til 5.000-10.000 HSC'er formålsøgende assays og 1000-2000 HSC'er til analyse inden for den første uge efter transplantation). I målsøgende assay modtagende mus aflives inden for de første 16-24 timer efter transplantation, og antallet af donor HSC'er der har nået knoglemarven bestemmes som forklaret i denne protokol. For yderligere at evaluere deres funktion, kan knoglemarvsceller udvundet fra de kortsigtede modtagere transplanteres til sekundære modtagere som forklaret i figur 1B. Andelen af donor-afledte celler i de sekundære modtagere kan derefter anvendes til at evaluere evnen hos donor HSC'er at migrere og løse i recipienten knoglemarven.
De store problemer med de konkurrencedygtige knoglemarvstransplantationer skyldes bestråling og injektion og præsentere sig selv som enten øget dødelighed efter transplantationen eller nedsat rekonstituering effektivitet. Split-dosis bestråling, som præsenteres her, er normalt forbundet med en mere effektiv myeloablation ogmindre toksicitet sammenlignet med enkeltdosis 20. Med dosen anbefales her (to gange 450 rad) skal myeloide og B-lymfoide populationer effektivt slettet, men resterende T-lymfocytter do forblive (figur 3). Hvis der er nogen grund til at formode transplantatafstødning (donor- og modtagerlande mus fra forskellige genetiske baggrunde), en højere dosis af bestråling (to doser af 550-600 rad) og en kortere forsinkelse mellem de to doser (4 t i stedet for den følgende dag ), bør afhjælpe resterende T-lymfocytter og mindske muligheden for graft svigt som følge af afvisning. Forkert injektion eller injektion i perivaskulær rum i stedet for halevenen, vil problemer med donor cellelevedygtighed eller forurening donor celle på grund af manglende omhu under forberedelse prøve også øge graft svigt og efter transplantationen dødelighed. Ineffektiv bestråling (på grund af tekniske problemer, for eksempel), vil resultere i nedsat rekonstituering effektivitet, men bør ikke øge mortality. I alle disse situationer, tilstedeværelsen af konkurrerende celler i assayet hjælper til at dissociere tekniske problemer (som beskrevet her) fra en bona fide fald i donor HSC funktion som konkurrerende celler altid bør kunne rekonstruere den bestrålede modtager. Immundefekte værter kan også anvendes, for eksempel til at reducere behovet for bestråling og / eller risiko for transplantatafstødning, og at evaluere funktionen af humant HSC'er 21-23.
Afslutningsvis præsenterer vi her en konkurrencedygtig transplantation protokol, som kan tilpasses til flere forskellige anvendelser som beskrevet i diskussionen. Vores tilgang benytter HSC ækvivalenter, hvilket nedsætter procestider og samtidig forbedrer cellernes levedygtighed i implantatet i forhold til cellesortering. Det er også en praktisk løsning, når adgang til en cellesorterer er begrænset og kræver færre mus sammenlignet med den kvantitative LDA assayet, hvilket gør det til et attraktivt udgangspunkt for analyse af HSC funktion. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Roxann Hetu-Arbour for hjælp med figuren design og demonstration af procedurerne. Forskning i laboratoriet blev understøttet af en Transition pris fra Cole Foundation, Discovery give no. 419226-2012 fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd of Canada (NSERC) og Canada Foundation for Innovation (CFI Leaders Fund give nr. 31377). KMH er en chercheur-Boursier Junior til Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| 20 G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | |
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μg/ml |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μg/ml |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μg/ml |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μg/ml |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μg/ml |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μg/ml |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 56149 | 0.5 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0.25 μg/ml |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 558162 | 0.25 μg/ml |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μg/ml |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0.625 μg/ml BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1 ml tuberculin syringe with 27 G needle | BD Syringe | 309623 | |
| 1 ml tuberculin syringe with 25 G needle | BD Syringe | 309626 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 |
References
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
