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Developmental Biology

प्रतियोगी प्रत्यारोपण hematopoietic स्टेम सेल स्वास्थ्य मूल्यांकन करने के लिए

Published: August 31, 2016 doi: 10.3791/54345
Automatic Translation
1, 1
1INRS-Institut Armand-Frappier, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique

Introduction

Hematopoiesis एक पुनर्योजी प्रक्रिया है कि रक्त कोशिकाओं है कि चोट, विकिरण और कोशिका मृत्यु के माध्यम से खो दिया है की भरपाई सुनिश्चित करता है। इस प्रक्रिया hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) कि मोटे तौर पर वयस्क अस्थि मज्जा में रहते द्वारा सुनिश्चित किया जाता है। इसके अलावा, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं autoimmune विकार, रक्त कैंसर और immunodeficiencies 1 में चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वहाँ इस तरह बेहतर तंत्र है कि एचएससी समारोह को विनियमित, उनके proliferative विस्तार और उनकी पहुंच और प्रत्यारोपण के बाद प्राप्तकर्ता अस्थि मज्जा टीका लगाना करने की क्षमता सहित समझने की जरूरत है। हालांकि हाल के अध्ययनों स्लैम परिवार के सदस्यों CD150 और CD48 सहित कई कोशिका की सतह मार्करों, भावी लगभग 50% शुद्धता 2-4 को वयस्क एचएससी और भ्रूण एचएससी संतुष्ट करने के लिए सूचित किया है, कार्यात्मक एचएससी के लिए स्वर्ण मानक मापने के लिए एक विवो repopulating परख बनी हुई है उनकी फिर से स्थापित करने के लिए रक्त ग क्षमता का निर्धारणएक विकिरणित मेजबान 5 में पक्ष उत्पादन।

इन विवो प्रतिरूप repopulating परख शुरू तक और McCulloch 6 से विकसित किया गया था और तब से परिष्कृत और विस्तारित किया गया है। मूल रूप में परिभाषित किया गया, एचएससी आत्म नवीकरण और भेदभाव के माध्यम से आजीवन रक्त कोशिका के उत्पादन किया जाता है। एक विकिरणित प्राप्तकर्ता में एचएससी के हस्तांतरण इस प्रकार हमें आकलन करने के लिए अनुमति देता है: उनके अलग अलग रक्त कोशिका प्रजातियों के विश्लेषण के माध्यम से अंतर करने के लिए (टी lymphocytes, बी लिम्फोसाइट, granulocytes, monocytes) और धारावाहिक प्रत्यारोपण के माध्यम से आत्म नवीकरण के लिए अपनी क्षमता की क्षमता। परख आमतौर पर कार्यक्षमता और / या एचएससी की दो आबादी की मात्रा की तुलना शामिल होगा, जैसे, अलग जीनोटाइप या कोशिकाओं के दो चूहों कि इलाज किया गया है या विभिन्न कारकों है कि रखरखाव या एचएससी के विस्तार को प्रभावित कर सकता है के साथ इलाज से आ रही कोशिकाओं संस्कृति में। डोनर काइमेरावाद, या स्थानांतरित कर दाता एचएससी टी का योगदानओ रक्त कोशिका के उत्पादन तो कोशिका की सतह मार्करों या अन्य तरीकों कि प्राप्तकर्ता, या मेजबान से दाता कोशिकाओं का उपयोग कर अलग होगा परिधीय रक्त में प्रवाह cytometry विश्लेषण और अस्थि मज्जा के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मार्करों निश्चित रूप से जीन Ptprc या CD45 ल्युकोसैट प्रतिजन 7 कि हम नीचे दिए गए उदाहरणों के लिए चुना है के लिए दो alleles हैं।

प्रतिरूप repopulation परख सकते हैं या तो प्रतियोगी या गैर-प्रतिस्पर्धी हो सकते हैं। एक गैर-प्रतिस्पर्धी माहौल में, नियंत्रण और परीक्षण एचएससी अलग प्राप्तकर्ता चूहों में स्थानांतरित कर रहे हैं और प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए परिणाम दूसरे से स्वतंत्र होगी। एक प्रतिस्पर्धी माहौल में, दोनों परीक्षण और नियंत्रण एचएससी के समारोह प्रतियोगी एचएससी की आबादी के खिलाफ मापा जाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्रतिस्पर्धी सेटिंग का उपयोग करता है, लेकिन यह भी गैर-प्रतिस्पर्धी स्थितियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। दोनों दृष्टिकोण के अपने फायदे और सीमाएं हैं, और हम में विस्तार से उनकी तुलना होगाचर्चा। हम यह भी प्रत्यारोपित एचएससी की संख्या में इक्विटी सुनिश्चित करने के लिए अलग अलग दृष्टिकोण का वर्णन है, कैसे कमजोर पड़ने परख (झील प्राधिकरण) को सीमित करके एचएससी की मात्रा का ठहराव के लिए परख के लिए अनुकूल है, और परिणाम की व्याख्या के लिए दोनों सफल और असफल प्रत्यारोपण का उदाहरण देते समझाओ।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं इस प्रोटोकॉल में वर्णित संस्थागत पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और पशु की देखभाल के दिशा-निर्देशों पर कनाडा परिषद का पालन करें।

नोट: बाँझ / विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त आवास की स्थिति बनाए रखने के लिए, एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट या एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर रहते चूहों के प्रत्यक्ष हैंडलिंग से जुड़े सभी प्रक्रियाओं का संचालन। स्वच्छ या बाँझ पिंजरों, निरोधक उपकरणों, आवास सामग्री, चाउ और पानी जानवरों को उचित रूप में उपलब्ध है। इंजेक्शन के लिए और रक्त नमूना लेने के लिए केवल बाँझ, डिस्पोजेबल सुई का प्रयोग करें। सड़न रोकनेवाला तकनीक भ्रष्टाचार की तैयारी के दौरान महत्वपूर्ण है।

1. प्राप्तकर्ता चूहों की तैयारी

  1. समय के साथ परिधीय रक्त और अस्थि मज्जा पुनर्गठन के व्यक्तिगत अनुवर्ती सक्षम करने के लिए कान डिग्री अधिक (या अन्य विधि स्थानीय पशु आचार समिति ने मंजूरी दे दी 8) के साथ प्राप्तकर्ता चूहों को पहचानें। बाद के प्रत्यारोपण के लिए अनुवर्ती चूहों वजन। हमेंई प्राप्तकर्ता चूहों कि 7 और 12 के बीच सप्ताह पुराने हैं (कम से कम 25 ग्राम)।
    नोट: दिए गए उदाहरण में, CD45.1 + CD45.2 + प्राप्तकर्ता चूहों congenic B6.SJL चूहों के साथ C57BL / 6 चूहों पार करके घर में पैदा हुए थे।
  2. 450 रेड की दो खुराक के साथ प्राप्तकर्ता चूहों चमकाना hematopoietic गतिविधि को नष्ट करने के लिए। पहली खुराक प्रत्यारोपण से पहले दिन और प्रत्यारोपण से पहले दूसरे 1-2 घंटा दें।
    नोट: एक्स-रे या गामा किरणों दोनों उचित सुविधाओं की उपलब्धता के आधार पर किया जा सकता है।

2. डोनर और प्रतियोगी अस्थि मज्जा की कोशिकाओं की तैयारी

  1. Euthanize दाता (परीक्षण और नियंत्रण, CD45.2 +) और प्रतियोगी (CD45.1 +; B6.SJL) सीओ 2 asphyxiation ग्रीवा अव्यवस्था या स्थानीय पशु आचार समिति ने मंजूरी दे दी तरीकों का उपयोग कर के बाद से चूहों।
  2. (काम की सतह को साफ रखने के लिए) उनकी पीठ, पैर पर चूहों की जगह खुली, एक खाली पेट्री डिश में या एक बाँझ धुंध पर मैंएक जैविक सुरक्षा कैबिनेट nside। त्वचा और 70% इथेनॉल / 30% एच के साथ फर गीले 2 ओ (वी / वी)।
  3. एक सर्जिकल ब्लेड या तेज कैंची से पैर काट दिया। पैर के साथ त्वचा को खोलने और त्वचा दाँतेदार संदंश का उपयोग कर दूर खींच कट। अतिरिक्त मांसपेशियों दूर कटौती।
  4. पैर की हड्डी पर खींच रहा है और एक काउंटर बल के रूप में श्रोणि हड्डियों के खिलाफ कैंची ब्लेड का उपयोग करके फीमर हटाना। टिबिअ को अलग करें और kneecap से फीमर और मांसपेशियों और tendons के शेष बिट्स को हटा दें। 2-3 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में हड्डियों 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में रखें।
  5. 5 मिलीलीटर के साथ हड्डियों निस्तब्धता बाँझ पीबीएस से अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को ले लीजिए।
    1. संदंश के साथ धीरे हड्डी पकड़ो और एक 25 जी सुई की हड्डी के एक छोर से एक भरा 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी डालें। सवार प्रेस और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा। जरूरत के रूप में जब तक हड्डी के केंद्र सफेद है दोहराएँ।
  6. सुई के माध्यम से गुजर दोहराया द्वारा कोशिकाओं को अलग कर देनाएक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करते हैं। बुलबुले और अतिरिक्त बल से बचें। नोट: इस कदम पर सेल व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए एक थोड़ा बड़ा सुई (22 जी) का प्रयोग करें।
  7. एक 70 माइक्रोन नायलॉन झरनी के माध्यम से कोशिकाओं से गुजरती वर्दी सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए और मलबे और झुरमुटों हटा दें।
  8. एक hemocytometer का उपयोग सेल गिनती के लिए एक विभाज्य निकालें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर शेष सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। सेल घनत्व मरम्मत के रूप में बाँझ पीबीएस (10 8 कोशिकाओं / एमएल) में की आवश्यकता है। बर्फ पर कोशिकाओं रखें।

3. दाता सेल एचएससी समकक्ष की स्थापना

  1. एक 5 मिलीलीटर दौर धुंधला प्रवाह cytometry के लिए नीचे polystyrene ट्यूब में 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं (30 μl) के बराबर स्थानांतरण। लेबल हटाया गया एंटीबॉडी के एक बराबर मात्रा (2.5 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए (पीबीएस 0.1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 1 मिमी EDTA के साथ पूरक) धुंधला बफर में पतला) गैर विशिष्ट धुंधला ब्लॉक करने के लिए CD16 / CD32 के खिलाफ जोड़े। आरटी पर 5 मिनट सेते।
  2. जोड़े 90 μl fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण धुंधला बफर में तैयार: biotinylated वंश कॉकटेल (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150। 30 मिनट, प्रकाश से सुरक्षित लिए बर्फ पर सेते हैं।
    नोट: उपयुक्त dilutions एंटीबॉडी के प्रत्येक बहुत कुछ के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में इस्तेमाल dilutions के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  3. 2 मिलीलीटर धुंधला बफर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं, भंवर और अपकेंद्रित्र में जोड़े अनबाउंड एंटीबॉडी हटाने के लिए। flicking द्वारा सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली छानना।
  4. 10 μl fluorochrome संयुग्मित streptavidin धुंधला बफर में पतला जोड़े (देखें सामग्री तालिका)। 20 मिनट, प्रकाश से सुरक्षित लिए बर्फ पर सेते हैं। 3.3 कदम के रूप में धो अपार streptavidin हटा दें।
  5. कम से कम छह डिटेक्टरों 9 के साथ एक प्रवाह cytometer का उपयोग करते हुए सेल के नमूने मोल। लिन की आवृत्ति निर्धारित - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 चित्रा 2 में दिखाया गया है और जैसा कि पहले 10,11 सूचना दी।
    नोट: यह है कि आबादी के भीतर कार्यात्मक एचएससी की आवृत्ति 1/3 और 1/5 2,12 के बीच अनुमान लगाया जा सकता है।
  6. सभी नमूनों 11 के लिए अनुमानित एचएससी समकक्ष स्थापित करना, एक नमूना (आमतौर पर, प्रतियोगी, इस उदाहरण में B6.SJL CD45.1 +) आधारभूत रूप में नीचे और चित्रा 2 में विस्तृत रूप में इस्तेमाल करते हैं।
    1. निम्न सूत्रों का उपयोग आवश्यक कोशिकाओं की संख्या की गणना:
      #transplanted एचएससी / प्राप्तकर्ता = 5 x 10 x 5 कोशिकाओं का अनुमान एचएससी आवृत्ति (आधारभूत नमूना के लिए निर्धारित के रूप में, यह नंबर wildtype C57BL / 6 चूहों के लिए आमतौर पर 75 के बीच और 125) 10-12।
      नोट: चित्रा 2 में, नमूना एक के लिए, परिणाम 139 एचएससी है।
      कुल # प्रत्यारोपित (अन्य नमूने के लिए, चित्रा 2 में जैसे नमूना बी) कोशिकाओं = ट्रांस #लगाए एचएससी / एचएससी आवृत्ति।
      नोट: चित्रा 2 में, नमूना बी के लिए, परिणाम 197,826 (या लगभग 2 x 10 5) कुल अस्थि मज्जा कोशिकाओं है।
  7. ऊपर प्राप्त परिणामों का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ता प्रति आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना।
    नोट: यह संख्या 5 x 10 5 आधारभूत नमूना (प्रतिद्वंद्वी) के लिए होना चाहिए।
    1. नंबर प्राप्तकर्ता चूहों की संख्या से कदम 3.7 से प्राप्त गुणा और सिरिंज में मृत मात्रा के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए कम से कम दो अतिरिक्त चूहों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं जोड़ें।
  8. प्रतियोगी (जैसे, CD45.1 +) और 1 में परीक्षण कोशिकाओं (CD45.2 +) मिक्स: 1 एचएससी बराबर अनुपात 3.6 कदम में गणना और बाँझ पीबीएस का उपयोग इंजेक्शन प्रति 200 μl के लिए अंतिम मात्रा को समायोजित करने के रूप में।
    नोट: पांच प्राप्तकर्ता चूहों के एक समूह ने सुझाव दिया की मात्रा इस प्रकार कम से कम 1.4 मिलीलीटर, 3.5 x 10 6 प्रतियोगी अस्थि मज्जा कोशिकाओं से युक्त हो सकता है (याचित्रा 2 में नमूना ए) के लिए 973 का अनुमान एचएससी, और परीक्षण कोशिकाओं के बराबर संख्या (चित्रा 2 में, नमूना बी के लिए बराबर 197,826 x 7 = 1384782 अस्थि मज्जा की कोशिकाओं) किया जाएगा।

4. अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण

  1. एक लाल गर्मी दीपक के साथ 1.2 चरण में विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों को गर्म रक्त वाहिकाओं के फैलाव सुनिश्चित करने के लिए और पार्श्व पूंछ अधिक दिखाई नसों बनाने के लिए।
  2. 1 मिलीलीटर ट्यूबरकुलीन एक 27 जी सुई (या छोटे) के साथ सुसज्जित सिरिंज तैयार करें। महाप्राण (3 प्राप्तकर्ता चूहों के लिए) तैयार सेल निलंबन के लगभग 750 μl। यकीन सिरिंज में कोई हवाई बुलबुले हैं सुनिश्चित करें।
  3. एक निरोधक डिवाइस में माउस डालें। पूंछ की जांच करने और पार्श्व पूंछ नसों कि पूंछ के दोनों किनारों पर स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए देखने के लिए। इथेनॉल के साथ इंजेक्शन साइट को साफ कर लें। ऊपर बेवल सुई डालें, त्वचा के समानांतर और धीरे सवार दबाएँ। इंजेक्शन आसान होना चाहिए। तो फिर बल हैकरनी, सुई नस में नहीं है।
    नोट: पुराने चूहों मोटा त्वचा, जो नस अधिक मुश्किल लग बना सकता है। सुई नस में नहीं है, तो प्रारंभिक इंजेक्शन साइट के लिए सुई समीपस्थ डालें।
  4. सुई निकालें और कुछ सेकंड के लिए बाँझ धुंध के साथ इंजेक्शन साइट प्रेस रक्तस्राव को रोकने के लिए। एक साफ पिंजरे में माउस स्थानांतरण।
    नोट: तीन इंजेक्शन, जिसके बाद सुई भी सुस्त हो सकता है के लिए एक ही सिरिंज और सुई का प्रयोग करें।
  5. बाद के प्रत्यारोपण के लिए अनुवर्ती, 1 मिलीलीटर पहले पांच दिनों के लिए चूहों rehydrate करने के लिए बाँझ पीबीएस subcutaneously इंजेक्षन। (; वैकल्पिक यदि आवश्यक हो) पीने के पानी के संक्रमण को रोकने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ें। पहले तीन सप्ताह के लिए हर दो से तीन दिन चूहों का वजन और चूहों कि अधिक से अधिक 15-20% उनके पूर्व प्रत्यारोपण शरीर के वजन खो दिया है (या के रूप में स्थानीय पशु आचार समिति द्वारा निर्धारित) euthanize।

5. परिधीय रक्त का विश्लेषण

  1. रक्त की एक बूंद लीजिए (एकpprox। 50-100 μl) EDTA ट्यूबों में।
    1. जबड़े नस से खून इकट्ठा करने के लिए, गंजा जबड़े की हड्डी के नीचे स्थित घटनास्थल के पास चेहरे की त्वचा पियर्स और एकत्रित ट्यूब जगह खून की बूंद 13 प्राप्त करने के लिए एक नुकीला या एक 22 जी सुई का उपयोग करें। प्रत्यारोपण के बाद 4, 8, 12 और 16 सप्ताह में खून ले लीजिए बहु-वंश पुनर्गठन का पालन करें।
  2. 1 मिलीलीटर हौसले से तैयार आरटी लाल रक्त कोशिका lysis बफर (9 भागों 0.16 एम एनएच 4 सीएल + 1 हिस्सा 0.17 एम Tris एचसीएल पीएच 7.65) चरण 5.1.1 में एकत्र रक्त की बूंद में जोड़े। से फ्लो के लिए उपयुक्त दौर नीचे polystyrene ट्यूब मिक्स और एक 5 मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण नमूना। आरटी पर 4 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
  3. ठंडा पीबीएस के 4 संस्करणों जोड़ें। अंत करने के लिए अंत मोड़ से मिलाएं और बर्फ पर तुरंत हस्तांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 200 XG पर अपकेंद्रित्र 10 मिनट।
  4. flicking द्वारा सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली छानना। सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट और लाल होना चाहिए। बफर और भंवर धुंधला हो संक्षेप में 2 मिलीलीटर जोड़ें। 200 XGA पर अपकेंद्रित्र 5 मिनटटी 4 डिग्री सेल्सियस।
  5. flicking द्वारा सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली छानना।
  6. CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1: सामान्य प्रोटोकॉल कदम 3.3 करने के लिए 3.1 में विस्तृत का उपयोग कर धुंधला प्रवाह cytometry और मास्टर मिश्रण के लिए निम्नलिखित एंटीबॉडी के साथ आगे बढ़ें।
  7. कम से कम छह डिटेक्टरों 9 के साथ एक प्रवाह cytometer का उपयोग करते हुए सेल के नमूने मोल। प्रत्येक वंश (CD19 + बी लिम्फोसाइट, CD3e + टी लिम्फोसाइटों, GR1 उज्ज्वल granulocytes) प्रत्येक नमूने में चित्रा 3 में प्रदान विश्लेषण टेम्पलेट का उपयोग कर के लिए और प्रकाशित 10,11 के रूप में दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं की आवृत्ति निर्धारित करते हैं।

6. अस्थि मज्जा पुनर्गठन का विश्लेषण

  1. के रूप में सामान्य प्रोटोकॉल कदम 3.3 करने के लिए 3.1 में विस्तृत का उपयोग कर प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए कोशिकाओं और मास्टर मिश्रण के लिए निम्नलिखित एंटीबॉडी में धारा 2 दाग विस्तृत अस्थि मज्जा की कोशिकाओं लीजिए: वंश कॉकटेल, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2। पता लगाने लिनEage कॉकटेल 3.4 कदम के रूप में वर्णित fluorochrome संयुग्मित streptavidin का उपयोग कर एंटीबॉडी।
  2. कम से कम आठ डिटेक्टरों 9 के साथ एक प्रवाह cytometer का उपयोग करते हुए सेल के नमूने मोल। अगर केवल छह उपलब्ध हैं, वंश पैनल के रूप में एक ही चैनल को जोड़ने के रूप में CD135 CD135 + कोशिकाओं बाहर रखा जाएगा। दाता व्युत्पन्न लिन की आवृत्ति निर्धारित - Sca1 + CD117 + CD135 - चित्रा 4 में प्रकाशित और 10 के रूप में प्रदान की जाती विश्लेषण टेम्पलेट का उपयोग कर प्रत्येक नमूने में CD150 + एचएससी।

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Representative Results

माध्यमिक प्रत्यारोपण (आगे नीचे) पर चर्चा सहित प्रतिस्पर्धी प्रत्यारोपण की स्थापना की एक सामान्य विवरण दोहरी का बहिष्कार पर चित्रा 1 में पाया जा सकता है। पूर्व प्रत्यारोपण अस्थि मज्जा एचएससी के लिए एक प्रतिनिधि विश्लेषण चित्रा 2 में पाया जा सकता है। अधिक विस्तृत जानकारी और मृत कोशिकाओं को कहीं और 9 पाया जा सकता है।

आंकड़े 3 और 4 क्रमशः, परिधीय रक्त और अस्थि मज्जा के लिए विश्लेषण टेम्पलेट्स प्रवाह cytometry का उदाहरण देते हैं। , के रूप में टी कोशिकाओं को और अधिक रेडियो के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, यह कुछ मेजबान टी lymphocytes पता लगाने के लिए सामान्य है (चित्रा 3 बी सभी टी कोशिकाओं में से 20% तक)। प्रतियोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं सभी तीन प्रजातियों में मौजूद होना चाहिए। सीमा का पता लगाने के विश्लेषण के लिए अधिग्रहीत की कुल कोशिकाओं की संख्या पर बहुत कुछ निर्भर करता है, लेकिन हमारे अनुभव में भीतर 20 हजार कोशिकाओं की कुलएकल ल्युकोसैट गेट आमतौर पर पर्याप्त है। 1% या 0.5% की एक मनमाना सीमा का उपयोग करना, यदि दाता कोशिकाओं किसी भी वंश में कटऑफ की तुलना में कम अनुपात (बी लसीकावत्, टी लसीकावत्, या माइलॉयड के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है) का प्रतिनिधित्व करते हैं, माउस multilineage पुनर्गठन के लिए सकारात्मक नहीं माना जाता है । इस अवधारणा को महत्वपूर्ण हो जाता है जब प्रतिस्पर्धी प्रत्यारोपण के रूप में चर्चा में समझाया दाता एचएससी यों तो एक सीमित कमजोर पड़ने परख के साथ संयुक्त कर रहे हैं। यह निश्चित रूप से है, उदाहरण के लिए, दाता व्युत्पन्न टी और बी लिम्फोसाइट लेकिन माइलॉयड कोशिकाओं है, जो आमतौर पर केवल क्षणिक पुनर्गठन का सुझाव जाएगा की क्रमिक नुकसान संभव है। लिम्फोसाइटों माइलॉयड कोशिकाओं की तुलना में लंबे समय तक आधा जीवन (विशेष रूप से Gr1hi SSChi granulocytes / न्यूट्रोफिल) है और यहां तक कि अस्थि मज्जा के अभाव एचएससी 10 में बच सकते हैं।

चित्रा 5 अलग अलग सीटू के तहत परिधीय रक्त काइमेरावाद के लिए प्रतिनिधि परिणाम दर्शाया गया हैations। दाता एचएससी कार्यात्मक प्रतियोगी कोशिकाओं के बराबर कर रहे हैं, दाता (CD45.2 +) और प्रतियोगी (CD45.1 +) के अनुपात के व्युत्पन्न कोशिकाओं समकक्ष (चित्रा 5 ए) कर रहे हैं। अवशिष्ट मेजबान कोशिकाओं (CD45.1 + CD45.2 +) चित्रा 5 ए और 5 ब में लगभग विशेष रूप से टी lymphocytes के रूप में वे अधिक रेडियो के लिए प्रतिरोधी रहे हैं। दाता कोशिकाओं परिधीय रक्त ल्यूकोसाइट्स (चित्रा 5 ब) की एक बहुत कम अनुपात मौजूद है जब, एचएससी समारोह के कुछ पहलुओं की संभावना खराब कर रहे हैं और चर्चा में वर्णित के रूप में आगे के अध्ययन की जरूरत है। प्रतियोगी कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करता है कि परख अच्छी तरह से काम किया है लेकिन दाता अस्थि मज्जा बस कम प्रभावी था। इस चित्रा 5C, जहां दोनों दाता और प्रतियोगी कोशिकाओं कम संख्या और मेजबान कोशिकाओं में मौजूद हैं परिधीय रक्त कोशिकाओं के बहुमत का प्रतिनिधित्व में प्रस्तुत परिणाम के विपरीत है। इस मामले में प्रत्यारोपण असफल रहा था औरटी दाता कोशिकाओं प्रतिद्वंद्वी बनाम के रिश्तेदार कार्यक्षमता के रूप में किसी भी निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए संभव नहीं है। अलग अलग समाधान के लिए आगे नीचे चर्चा कर रहे हैं।

आकृति 1
। चित्रा 1. प्रायोगिक डिजाइन (ए) एक प्रतिस्पर्धी प्रत्यारोपण के लिए, दाता चूहों से अस्थि मज्जा की कोशिकाओं (CD45.2 +; C57BL6 पृष्ठभूमि, नियंत्रण और परीक्षण) और congenic प्रतियोगी चूहों (CD45.1 +; B6.SJL) में मिश्रित कर रहे हैं एक 1: 1 के अनुपात और विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों की पूंछ नस में इंजेक्शन (CD45.1 + CD45.2 +; C57BL6 की F1 संतान x B6.SJL प्रजनन जोड़े)। अस्थि मज्जा पुनर्गठन की प्रभावकारिता 4, 8, 12 और 16 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण पर और 16 सप्ताह में अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद या बाद में परिधीय रक्त (पंजाब) में चुना गया है। (बी) के आगे प्रतिरोपित कोशिकाओं के आत्म नवीकरण का मूल्यांकन करने के लिए, बॉनई मज्जा 16 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं से बरामद कोशिकाओं विकिरणित माध्यमिक प्राप्तकर्ता चूहों में स्थानांतरित किया जा सकता है। एचएससी, hematopoietic स्टेम सेल; एमपीपी, multipotent पूर्वज सेल; LMPP, लसीकावत्-primed एमपीपी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. पूर्व प्रत्यारोपण अस्थि मज्जा एचएससी विश्लेषण टेम्पलेट। एकल कक्षों के भीतर, cKit (CD117) और वंश अभिव्यक्ति के अनुसार HSPCs का चयन करें। लिन मंद / भीतर - सेल की आबादी, cKit उज्ज्वल Sca1 + आबादी (LSK) का चयन करें। एचएससी - LSKs के भीतर, CD150 + CD135 का चयन करें। इस आबादी दोनों दीर्घकालिक और अल्पकालिक एचएससी (एक repopulating सेल की आवृत्ति repopulating इस आबादी के भीतर होना है शामिलबीच 1/3 और 1/5)। अस्थि मज्जा एचएससी की अनुमानित आवृत्ति एकल कक्ष के गेट में घटनाओं की संख्या से एचएससी गेट में घटनाओं की संख्या से विभाजित करके गणना की है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. पोस्ट-प्रत्यारोपण परिधीय रक्त विश्लेषण टेम्पलेट। (ए) एकल कक्षों के भीतर, प्रथम GR1 उज्ज्वल एसएससी हाय granulocytes का चयन करें। बी लिम्फोसाइटों और CD3e + CD19 - - टी लिम्फोसाइटों (बी) तब CD19 + CD3e का चयन करें। माउस परिधीय रक्त बी लिम्फोसाइट प्रमुख सेल प्रकार (लगभग 50% सभी परिधीय रक्त कोशिकाओं) होने के साथ, लिम्फोसाइट का एक बड़ा हिस्सा होता है। सीई) सीडी 4 के साथ प्रत्येक सबसेट के लिए भूखंडों cytometry 2 डी प्रवाह ड्राएक धुरी और दूसरे पर CD45.1 पर 5.2। के रूप में दिखाया दाता (CD45.2 +), मेजबान (CD45.1 + CD45.2 +) और प्रत्येक वंश के लिए प्रतियोगी कोशिकाओं (CD45.1 +) को पहचानें। यह पैनल के रूप में देखा विशेष रूप से टी लिम्फोसाइट आबादी में, कुछ शेष मेजबान कोशिकाओं होना सामान्य है ई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. पोस्ट-प्रत्यारोपण अस्थि मज्जा एचएससी विश्लेषण टेम्पलेट। एकल कक्षों का चयन करें HSPCs और LSKs रूप में चित्रा 2 LSKs के भीतर के लिए दिखाया भीतर, चुनिंदा CD150 + CD135- एचएससी, CD150- CD135- multipotent progenitors (या Mpps) और CD150- CD135 + लसीकावत् -primed Mpps (या LMPPs)। LMPPs के अनुपात में गैर विकिरणित चूहों की तुलना में प्रत्यारोपण के बाद कम है। ड्रा 2 डी प्रवाह गएक धुरी और CD45.1 दूसरे पर पर CD45.2 के साथ प्रत्येक सबसेट के लिए भूखंडों ytometry। के रूप में दिखाया प्रत्येक उप-जनसंख्या के लिए दाता, मेजबान और प्रतियोगी कोशिकाओं की पहचान। विकिरण और प्रत्यारोपण सफल रहे हैं, वहाँ बहुत कुछ शेष मेजबान HSPCs होना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. परिधीय रक्त काइमेरावाद के लिए प्रतिनिधि परिणाम है। (ए) सफल प्रत्यारोपण जहां दाता एचएससी कार्यात्मक प्रतियोगी कोशिकाओं के बराबर हैं। शेष मेजबान कोशिकाओं के विशाल बहुमत (CD45.1 + CD45.2 +) आम तौर पर टी lymphocytes है। (ख) सफल प्रत्यारोपण जहां दाता एचएससी शो समारोह में कमी प्रतियोगी कोशिकाओं की तुलना में। यह कमी आई है योगदान की वजह से हो सकता हैकई विभिन्न कारकों और आगे के विश्लेषण की जरूरत होगी (चर्चा देखने के लिए)। (सी) दोनों प्रतियोगी और दाता कोशिकाओं और शेष मेजबान कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा के कम आवृत्तियों के साथ असफल प्रत्यारोपण। परिणाम इस प्रकार का विकिरण की उम्मीद की खुराक की तुलना में कम चलता है, असफल इंजेक्शन (सेल व्यवहार्यता में कमी आई है, इंजेक्शन की मात्रा में कमी आई है, पूंछ नस के बाहर इंजेक्शन), या इनमें से एक संयोजन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल जाना जाता प्रतियोगी एचएससी के खिलाफ दाता (परीक्षण) एचएससी के रिश्तेदार फिटनेस का मूल्यांकन करने के लिए बनाया गया है। प्रतियोगिता की स्थिति रिश्तेदार परख की संवेदनशीलता (अधिक स्टेम सेल फिटनेस में मध्यम घटने का पता लगाने की संभावना है) बढ़ जाती है और विकिरण और इंजेक्शन की प्रभावकारिता के लिए एक आंतरिक तकनीकी नियंत्रण प्रदान करता है। हालांकि, यह एचएससी फिटनेस का एक निरपेक्ष उपाय के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए; प्रतिस्पर्धी पुनर्गठन में कमी स्वचालित रूप से इसका मतलब यह नहीं है कि एचएससी प्रतियोगिता के अभाव में अच्छा प्रदर्शन नहीं होगा। हालांकि यह तर्क दिया जा सकता है कि एक प्रतिस्पर्धी सेटिंग बेहतर प्रारंभिक बिंदु है, के रूप में प्रतियोगी कोशिकाओं दोषपूर्ण एचएससी समारोह और सभी प्राप्तकर्ता चूहों को बचाने बच जाएगा होगा, एक परिणामों की व्याख्या के साथ सावधान रहना चाहिए। एक गैर-प्रतिस्पर्धी सेटिंग में परिणामों की पुष्टि करते निष्कर्ष स्थिर करना होगा।

प्रयोगात्मक यहाँ प्रस्तुत डिजाइन एचएससी बराबर qu का उपयोग करता हैके बजाय कुल अस्थि मज्जा कोशिकाओं के antities -sorted एचएससी प्रवाह cytometry का शुद्ध आबादी। यह अध्ययन (विभिन्न दानदाताओं, प्रतियोगी) के तहत सभी आबादी में एचएससी की संख्या बराबर करने के लिए विभिन्न दानदाताओं के बीच परिवर्तनशीलता को खत्म करने और यह सुनिश्चित करें कि प्ररूपी एचएससी आवृत्ति में बदलाव एचएससी समारोह 14 में परिवर्तन के रूप में व्याख्या नहीं की जाएगी करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ दृष्टिकोण शुद्ध एचएससी के ऊपर वर्णित के लाभ हैं: सुधार सेल व्यवहार्यता छोटा प्रसंस्करण बार और छँटाई के दौरान बाहरी दबाव की कमी के कारण; और प्राप्तकर्ता अस्थि मज्जा में सुधार घर वापस आना (हल कोशिकाओं पर एंटीबॉडी की उपस्थिति अस्थि मज्जा 15 में उनकी engraftment के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं)। इसके विपरीत, मुख्य नुकसान प्रत्यारोपण परिणाम के लिए गैर-एचएससी आबादी के योगदान को, विशेष रूप से प्रत्यारोपण के बाद जल्दी समय बिंदुओं पर अल्पकालिक पूर्वज कोशिकाओं की भूमिका है। इसके अलावा, उपचार या आनुवंशिक संशोधन surfac की अभिव्यक्ति बदल यदिई एचएससी 16 के चयन के लिए इस्तेमाल किया मार्कर, वहाँ एचएससी की एक महत्वपूर्ण संख्या "भेस में" एक नमूने में नहीं बल्कि किसी अन्य रूप में हो सकता है, जो होगा पूर्वाग्रह का परिणाम है। हालांकि, एक ही समस्या भी जब शुद्ध एचएससी का उपयोग कर और प्रत्यारोपण परख के लिए निहित है हो सकता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त परिणामों आबादी के स्तर पर केवल गुणात्मक कर रहे हैं। दूसरे शब्दों में, प्रत्यारोपण के बाद दाता कोशिकाओं की एक कम योगदान की वजह से हो सकता है; शुरुआती आबादी में कार्यात्मक एचएससी की कम संख्या; अस्थि मज्जा में बसा है और पहले के दिनों और हफ्तों प्रत्यारोपण के बाद में विस्तार करने के लिए अलग-अलग एचएससी की एक कम क्षमता; या भेदभाव और परिपक्व कोशिकाओं है कि परिधि में पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है में विकास के साथ समस्याओं। इस प्रकार यह महत्वपूर्ण है अलगाव में एक प्रतिस्पर्धी प्रत्यारोपण से परिणाम का उपयोग नहीं करने के लिए, लेकिन उन्हें assays कि सेल प्रसार, अस्तित्व, और एच से भेदभाव उपाय करेंगे साथ पूरक करने के लिएरक्त कोशिका घूम करने के लिए अनुसूचित जाति। यह भी परिधीय रक्त (चित्रा 3) और अस्थि मज्जा (चित्रा 4) के बीच दाता सेल योगदान तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण है परिधीय रक्त में दाता कोशिकाओं के अभाव के साथ संयुक्त अस्थि मज्जा में दाता व्युत्पन्न एचएससी की उपस्थिति एक भेदभाव ब्लॉक का संकेत होगा । हालांकि उदाहरण में नहीं दिखाया गया है, यह भी Gpi1 17 के विभिन्न isoforms के आधार पर एर्य्थ्रोइद पुनर्गठन का आकलन करने के लिए संभव है। रक्त में मौजूद एरिथ्रोसाइट्स की बड़ी संख्या को देखते हुए, वे दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं है, जो विशेष रूप से उपयोगी है जब एचएससी की कम संख्या रोपाई या समय की लंबी अवधि में अपने उत्पादन के बाद हो सकता है के लिए पता लगाने के एक बेहद संवेदनशील विधि प्रतिनिधित्व करते हैं। स्पेक्ट्रम के दूसरे छोर पर, माइलॉयड कोशिकाओं अक्सर पहले वाले उनके छोटे आधा जीवन की वजह से परिधीय रक्त में और भाग में उनके कम आवृत्ति की वजह से भाग में, पता लगाया जा रहा विफल करने के लिए कर रहे हैं।

यह वीं अनुकूल करने के लिए संभव हैई प्रतिस्पर्धी repopulation परख सीमित कमजोर पड़ने परख (या झील प्राधिकरण) का उपयोग एचएससी की मात्रा का ठहराव की अनुमति है। दाता कोशिकाओं, या तो हल या जैसा कि ऊपर वर्णित अवर्गीकृत: यह कई अलग अलग समूहों जहां प्रत्येक समूह के प्रतियोगी का एक अलग अनुपात में विभाजित प्राप्त प्राप्तकर्ता चूहों की एक बहुत बड़ी संख्या की आवश्यकता होगी। दाता कोशिकाओं की संख्या कम हो जाती है, वहाँ अधिक चूहों जिसमें दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं के अनुपात में एक या कई प्रजातियों में पूर्व स्थापित दहलीज तक पहुँच नहीं है हो सकता है। यह तो "नकारात्मक" प्रत्यारोपित दाता कोशिकाओं की संख्या के खिलाफ समूह के प्रति चूहों की आवृत्ति साजिश और आगामी ग्राफ 18,19 से एचएससी की आवृत्ति निर्धारित करने के लिए संभव है।

बाद के प्रत्यारोपण के अनुवर्ती का सुझाव दिया अवधि साहित्य में बदलता है। वहाँ कुछ आम सहमति जहां प्रत्यारोपण के बाद 16 सप्ताह की अवधि के लिए लंबी अवधि के एचएससी के उत्पादन को प्रतिबिंबित करने के लिए पर्याप्त माना जाता था होना करने के लिए इस्तेमाल किया। हालांकि, मैं "की हाल की रिपोर्टntermediate "एचएससी जिसका समारोह में गिरावट आती है कुछ ही समय बाद 16 सप्ताह की आवश्यकता को रेखांकित किया है एचएससी समारोह 17 से भी अधिक कठोर मूल्यांकन के लिए। यह निश्चित रूप से पिछले 16 सप्ताह का समय बिंदु प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के अनुवर्ती का विस्तार करने के लिए इन चिंताओं को पूरा करने के लिए संभव है। एक वैकल्पिक विकल्प, एक यकीनन उच्च संवेदनशीलता के साथ एक बार फिर, माध्यमिक प्रत्यारोपण (चित्रा 1 बी), जहां अस्थि मज्जा की कोशिकाओं पहला प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं से बरामद किरणित माध्यमिक प्राप्तकर्ताओं में इंजेक्शन कर रहे हैं। दूसरी प्रत्यारोपण एचएससी पर अतिरिक्त proliferative दबाव डालता है, उनके बाहर निकलने के लिए मजबूर निद्रा से और उनके उत्पादन को बनाए रखने के लिए मजबूत आत्म नवीकरण के साथ ही कोशिकाओं की अनुमति है। यह कभी कभी हल दाता कोशिकाओं का उपयोग बेहतर माध्यमिक प्रत्यारोपण के लिए विभिन्न नमूनों के बीच एचएससी संख्या को समायोजित करने के लिए बेहतर है। वैकल्पिक रूप से, यह संभव दाता की अनुमानित अनुपात स्थापित करने के लिए है : प्राथमिक अस्थि मज्जा से प्रतियोगी एचएससी (जैसे, 10 प्रति 5-10 मिलियन कोशिकाओं की कुल इंजेक्षन करने के लिए सबसे अच्छा है।

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, वहाँ क्यों दाता एचएससी की दी आबादी दिखा सकते हैं के लिए कारणों की एक संख्या में कमी आई लंबी अवधि के पुनर्गठन के लिए क्षमता है। ऐसा ही एक कारण प्रत्यारोपण (भी बुलाया घर वापस आना) के बाद अस्थि मज्जा की ओर पलायन करने के लिए और खुद को अस्थि मज्जा आला में बसने एचएससी की क्षमता है। यह यहां प्रस्तुत अस्थि मज्जा घर वापस आना और छोटी अवधि के विस्तार की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूल करने के लिए संभव है। यह प्रतिरोपित कोशिकाओं की संख्या (के लिए 5,000-10,000 एचएससी के बराबर बढ़ाने के लिए आवश्यक हैघर वापस आना assays और प्रत्यारोपण के बाद पहले सप्ताह के भीतर विश्लेषण के लिए 1,000-2,000 एचएससी)। घर वापस आना परख में, प्राप्तकर्ता चूहों प्रत्यारोपण के बाद पहले 16-24 घंटा और है कि अस्थि मज्जा पर पहुंच गया है के रूप में उपस्थित प्रोटोकॉल में विस्तार से बताया चुना गया है दाता एचएससी की संख्या के भीतर euthanized हैं। के रूप में चित्रा 1 बी में समझाया आगे उनके कार्य का मूल्यांकन करने के लिए, अल्पकालिक प्राप्तकर्ताओं से बरामद अस्थि मज्जा की कोशिकाओं माध्यमिक प्राप्तकर्ताओं में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। माध्यमिक प्राप्तकर्ताओं में दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं का अनुपात तो विस्थापित और प्राप्तकर्ता अस्थि मज्जा में व्यवस्थित करने के लिए दाता एचएससी की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

प्रतियोगी अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के साथ प्रमुख समस्याओं विकिरण और इंजेक्शन से पैदा होती है और या तो वृद्धि हुई के बाद प्रत्यारोपण मृत्यु दर के रूप में खुद को पेश या पुनर्गठन दक्षता की कमी हुई। विभाजन खुराक विकिरण, के रूप में यहाँ प्रस्तुत है, आमतौर पर अधिक कुशल myeloablation साथ जुड़ा हुआ है औरकम विषाक्तता जब एक खुराक 20 की तुलना में। साथ खुराक यहाँ की सिफारिश की (दो बार 450 rads), माइलॉयड और बी लसीकावत् आबादी कुशलता से नष्ट हो जाती हैं, लेकिन अवशिष्ट टी lymphocytes रहने (चित्रा 3) से करते हैं। अगर वहाँ भ्रष्टाचार अस्वीकृति (विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि से दाता और प्राप्तकर्ता चूहों), विकिरण के एक उच्च खुराक (550-600 rads की दो खुराक) और दो खुराकों के बीच एक छोटी देरी (4 घंटा के बजाय अगले दिन संदेह के लिए कोई कारण नहीं है ) की मदद करनी चाहिए अवशिष्ट टी lymphocytes को खत्म करने और भ्रष्टाचार अस्वीकृति के कारण असफलता की संभावना कम होती है। गलत इंजेक्शन या उसकी जगह परिवाहकीय अंतरिक्ष पूंछ नस में इंजेक्शन, नमूना तैयार करने के दौरान देखभाल के अभाव में दाता सेल व्यवहार्यता, या दाता सेल संदूषण के साथ समस्याओं को भी भ्रष्टाचार की विफलता और बाद के प्रत्यारोपण की मृत्यु दर में वृद्धि होगी। अक्षम विकिरण (तकनीकी समस्याओं के कारण, उदाहरण के लिए) में कमी आई पुनर्गठन दक्षता में परिणाम होगा लेकिन मो वृद्धि नहीं करनी चाहिएrtality। इन स्थितियों के सभी में, परख में प्रतियोगी कोशिकाओं की उपस्थिति दाता एचएससी समारोह में एक सदाशयी कमी से (के रूप में यहाँ विस्तृत) के रूप में प्रतियोगी कोशिकाओं को हमेशा विकिरणित प्राप्तकर्ता पुनर्गठित करने में सक्षम होना चाहिए तकनीकी समस्याओं को अलग कर देना मदद करता है। Immunodeficient मेजबान भी उदाहरण के लिए, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विकिरण और / या भ्रष्टाचार अस्वीकृति के जोखिम के लिए जरूरत कम करने के लिए, और मानव एचएससी 21-23 के समारोह का मूल्यांकन करने के लिए।

अंत में, हम यहां एक प्रतिस्पर्धी प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल के रूप में विस्तृत चर्चा की है कि कई विभिन्न उपयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता उपस्थित थे। हमारा दृष्टिकोण एचएससी समकक्ष का उपयोग करता है, जो प्रसंस्करण बार कम हो जाती है और जब सेल छँटाई की तुलना में एक साथ भ्रष्टाचार में सेल व्यवहार्यता को बेहतर बनाता है। यह भी एक व्यावहारिक समाधान है जब एक सेल सॉर्टर के लिए उपयोग सीमित है, और कम चूहों की आवश्यकता है जब मात्रात्मक झील प्राधिकरण परख की तुलना में यह एचएससी समारोह के विश्लेषण के लिए एक आकर्षक प्रारंभिक बिंदु बना रही है। </ P>

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Acknowledgments

हम यह आंकड़ा डिजाइन और प्रक्रियाओं के प्रदर्शन के साथ सहायता के लिए Roxann Hétu-कुंज के आभारी हैं। प्रयोगशाला में अनुसंधान कोल फाउंडेशन से एक संक्रमण पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था, डिस्कवरी कोई अनुदान। प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा () NSERC के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल और अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन (CFI लीडर्स फंड अनुदान नहीं। 31377) से 419226-2012। Santé (FRQS) - KMH के लिए Fonds डे Recherche डु क्यूबेक एक Chercheur-BOURSIER जूनियर है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtainer tubes with K2EDTA BD Biosciences 365974
20 G needle BD Syringe For blood sampling from the mandibular vein
LabQuake Shaker rotisserie Thermo  Scientific C415110
Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) BD Biosciences 553142 2.50 μg/ml
Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) eBioscience 25-0031 0.25 μg/ml
PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) eBioscience 12-0193 0.25 μg/ml
APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) eBioscience 47-5931 0.25 μg/ml
FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) eBioscience 11-0453 2.50 μg/ml
eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) eBioscience 48-0454 1.00 μg/ml
Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) eBioscience 13-0452 1.25 μg/ml
Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) eBioscience 13-0031 1.25 μg/ml
Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 13-0112 1.25 μg/ml
Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) eBioscience 13-5931 1.25 μg/ml
Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) eBioscience 13-5921 0.625 μg/ml
V500 streptavidin BD Biosciences 56149 0.5 μg/ml
PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) BD Biosciences 553355 0.25 μg/ml
PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) BD Biosciences 558162 0.25 μg/ml
PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) eBioscience 46-1351 0.5 μg/ml
Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) Biolegend 115918 0.625 μg/ml BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone
1 ml tuberculin syringe with 27 G needle BD Syringe 309623
1 ml tuberculin syringe with 25 G needle BD Syringe 309626
70 μm cell strainer BD Falcon 352350

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विकास जीवविज्ञान अंक 114 hematopoietic स्टेम कोशिकाओं अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण कुल शरीर विकिरण cytometry रक्त संग्रह माउस मॉडल प्रतिस्पर्धी पुनर्गठन इकाई प्रवाह
प्रतियोगी प्रत्यारोपण hematopoietic स्टेम सेल स्वास्थ्य मूल्यांकन करने के लिए
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Kwarteng, E. O., Heinonen, K. M.… More

Kwarteng, E. O., Heinonen, K. M. Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness. J. Vis. Exp. (114), e54345, doi:10.3791/54345 (2016).

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