Introduction
Hematopoiesis er en regenerativ prosess som sikrer påfyll av blodceller som har gått tapt på grunn av skade, stråling og celledød. Denne prosessen er sikret av blodkreft stamceller (HSC) som i stor grad bor i voksen benmarg. I tillegg kan hematopoetiske stamceller kan brukes for terapeutiske formål i autoimmune forstyrrelser, hematologiske ondartede sykdommer og immunsvikt 1. Det er derfor et behov for å bedre forstå mekanismene som regulerer HSC funksjon, inkludert deres proliferative utvidelse og deres evne til å nå og innpode mottakeren benmarg etter transplantasjon. Selv om nyere studier har rapportert flere celleoverflatemarkører, inkludert SLAM familiemedlemmer CD150 og CD48, til prospektivt berike voksne HSCs og foster HSCs til omtrent 50% renhet 2-4, gull standard mål for funksjonell HSCs forblir en in vivo repopulating analyse for å bestemme deres evne til å reetablere blod cell produksjon i en bestrålt vert fem.
In vivo klonal repopulating analysen ble opprinnelig utviklet av Till og McCulloch 6 og har siden blitt videreutviklet og utvidet. Som opprinnelig definert, HSCs sikre livslang blodlegemer gjennom selvfornyelse og differensiering. Overføringen av HSCs inn i et bestrålt mottaker gjør det således mulig for oss å bedømme: deres evne til å differensiere ved analyse av de forskjellige blodcelle linjer (T-lymfocytter, B-lymfocytter, granulocytter, monocytter) og deres evne til selvfornyelse gjennom serietransplantasjon. Analysen vil vanligvis innebære sammenligning av funksjonaliteten og / eller kvantitet av to populasjoner av HSCs, for eksempel celler som kommer fra to mus med forskjellige genotyper eller celler som er blitt behandlet eller ubehandlet med ulike faktorer som kan påvirke den vedlikehold eller utvidelse av HSCs i kultur. Donor kimerisme, eller bidrag overført donor HSCs to blodceller kan deretter bli bestemt ved strømningscytometri-analyse i perifert blod og benmarg ved hjelp av celleoverflatemarkører eller andre metoder som vil skille donorceller fra mottakeren, eller vert. De mest brukte markører er sikkert de to alleler for genet Ptprc eller CD45 leukocytt antigen 7 at vi har valgt for eksemplene nedenfor.
Den klonal repopulation Analysen kan være enten konkurrerende eller ikke-konkurrerende. I en ikke-konkurrerende setting, blir kontroll- og test HSCs overført til separate resipientmus og resultatet for hver celletype vil være uavhengig av den andre. I et konkurranseutsatt miljø, er funksjonen av både test og kontroll HSCs målt mot en befolkning på konkurrent HSCs. Protokollen er beskrevet her bruker konkurranse innstillingen, men kan også tilpasses for ikke-konkurransesituasjon. Begge fremgangsmåter har sine fordeler og begrensninger, og vi sammenligner dem i detalj idiskusjon. Vi beskriver også ulike tilnærminger for å sikre egenkapitalen i antall transplanterte HSCs, forklare hvordan å tilpasse analysen for kvantifisering av HSCs ved å begrense fortynning analysen (LDA), og gi eksempler på både vellykkede og mislykkede transplantasjoner for tolkningen av resultatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen er godkjent av den institusjonelle dyreetikk komité og følge den kanadiske Rådet for dyrestell retningslinjer.
Merk: For å opprettholde sterile / patogenfrie boforhold, gjennomføre alle prosedyrer som involverer direkte håndtering av levende mus inne i et biologisk sikkerhetskabinett eller en laminær hette. Rengjør eller sterilisere bur, restraining enheter, bolig materialer, chow og vann gitt til dyrene på riktig måte. Bruk kun sterile engangsnåler for injeksjoner og for blodprøvetaking. Aseptisk teknikk er viktig under utarbeidelsen av pode.
1. Utarbeidelse av Mottaker Mus
- Identifiser mottaker mus med øret hakk (eller annen form godkjent av den lokale dyreetikk komité 8) for å muliggjøre individuell oppfølging av perifert blod og benmarg oppløsning over tid. Vei musene for post-transplantasjon oppfølging. Osse mottaker mus som er mellom 7 og 12 uker gamle (mindre enn 25 g).
Merk: I den medfølgende eksempel ble CD45.1 + CD45.2 + mottaker mus avlet i huset ved å krysse C57Bl / 6 mus med congenic B6.SJL mus. - Bestråle mottaker mus med to doser av 450 rad for å ødelegge blodkreft aktivitet. Gi den første dose dagen før transplantasjonen og den andre 1-2 timer før transplantasjon.
Merk: X-ray eller gammastråler kan både brukes avhengig av tilgjengeligheten av egnede fasiliteter.
2. Utarbeidelse av giver og Konkurrent benmargceller
- Avlive donor (test og kontroll, CD45.2 +) og konkurrent (CD45.1 +; B6.SJL) mus med CO 2 kvelning fulgt ved halshugging eller bruke metoder godkjent av det lokale dyreetikk komité.
- Plasser mus på ryggen, bena åpen bred, i en tom petriskål eller på en steril kompress (for å holde arbeidsflaten ren) inside et biologisk sikkerhetskabinett. Våt hud og pels med 70% etanol / 30% H2O (v / v).
- Klipp av foten med en kirurgisk kniv eller skarp saks. Skjær åpne huden langs benet og dra bort huden ved hjelp av taggete tang. Skjær vekk overflødig muskel.
- Forrykke femur ved å trekke i beinet beinet og bruke saksebladene mot bekkenbenet som en motkraft. Ta tibia og femur fra kneskålen og fjerne gjenværende biter av muskler og sener. Plasser bein i 2-3 ml steril fosfatbufret saltløsning (PBS) i en 6-brønners vevkulturplate.
- Samle benmargceller ved å spyle bein med 5 ml sterilt PBS.
- Holde benet forsiktig med pinsett og sette inn en 25 G nål festet til en fylt 1 ml sprøyte til den ene enden av benet. Trykk på stempelet og samle cellene i et 15 ml konisk rør. Gjenta etter behov til sentrum av benet er hvit.
- Dissosiere cellene ved gjentatt passering gjennom nålen tiloppnå en enkel cellesuspensjon. Unngå bobler og overflødig kraft. Merk: Bruk en litt større nål (22 G) for å forbedre celle levedyktighet på dette trinnet.
- Pass cellene gjennom en 70 mikrometer nylon sil for å sikre ensartet cellesuspensjon og for å fjerne rusk og klumper.
- Fjerne en alikvot for celletelling ved hjelp av et hemocytometer. Sentrifuger den gjenværende cellesuspensjonen ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Juster celletetthet som kreves i steril PBS (10 8 celler / ml). Hold cellene på is.
3. Etablering Donor Cell HSC Equivalents
- Overfør den tilsvarende 3 x 10 6-celler (30 pl) i en 5 ml rundbunnet polystyren-rør for flowcytometri farging. Legge til et like stort volum av umerket antistoff mot CD16 / CD32 for å blokkere ikke-spesifikk farging (fortynnet i farging buffer (PBS supplert med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) og 1 mM EDTA) til en sluttkonsentrasjon på 2,5 ug / ml). Inkuber 5 minutter ved romtemperatur.
- Legg 90 mL fluorokromkonjugerte antistoffet mester mix utarbeidet i flekker buffer: biotinylated Lineage cocktail (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. Inkuber på is i 30 min, beskyttet mot lys.
Merk: Passende fortynninger bør bestemmes for hvert parti av antistoff. Se tabell for material for fortynninger brukt i denne studien. - Tilsett 2 ml farging buffer til cellene, Vortex og sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C for å fjerne ubundet antistoff. Dekanter supernatanten og resuspender pellet ved å flikke.
- Tilsett 10 mL fluorokromkonjugerte konjugert streptavidin fortynnet i farging buffer (se Materialer tabell). Inkuber på is i 20 min, beskyttet mot lys. Vask som i trinn 3.3 for å fjerne ikke-bundet streptavidin.
- Erverve celleprøver ved hjelp av et flowcytometer med minst seks detektorer 9. Bestem frekvensen av Lin - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150
Merk: Hyppigheten av funksjonelle HSCs i populasjonen kan estimeres mellom 1/3 og 1/5 2,12. - Etablere estimerte HSC ekvivalenter for alle prøver 11, ved hjelp av en sample (vanligvis konkurrenten, B6.SJL CD45.1 + i dette eksempelet) som baseline som beskrevet nedenfor og i figur 2.
- Beregn antall celler kreves ved hjelp av følgende formler:
#transplanted HSCs / mottaker = 5 x 10 5 celler x anslått HSC frekvens (bestemt for baseline prøven, og dette tallet er vanligvis mellom 75 og 125 for villtype C57BL / 6 mus) 10-12.
Merk: I figur 2, for prøve A, er resultatet 139 HSCs.
Antall transplanterte celler (for andre prøver, f.eks prøve B i figur 2) = # transplantet HSCs / HSC frekvens.
Merk: I figur 2, for prøve B, er resultatet 197826 (eller ca. 2 x 10 5) totale benmargsceller.
- Beregn antall celler kreves ved hjelp av følgende formler:
- Beregn det totale antall celler som kreves per pode mottaker for hver prøve med de resultater som ble oppnådd ovenfor.
Merk: Dette nummeret skal være 5 x 10 5 til baseline prøven (konkurrent).- Multiplisere antall erholdt fra trinn 3.7 med antall resipientmus og tilsett nok celler i minst ytterligere to mus for å kompensere for dødvolumet i sprøyten.
- Bland konkurrent (f.eks CD45.1 +) og testcellene (CD45.2 +) i 1: 1 HSC ekvivalentforholdet som beregnet i trinn 3.6 og justere sluttvolumet til 200 ul per injeksjon under anvendelse av sterilt PBS.
Merk: For en gruppe på fem mottaker mus den foreslåtte volumet vil derfor være minst 1,4 ml inneholder 3,5 x 10 6 konkurrent benmargceller (eller973 estimerte HSCs for prøve A i figur 2), og det tilsvarende antall testceller (på figur 2, den tilsvarende for prøve B ville være 197 826 x 7 = 1,384,782 benmargsceller).
4. benmargstransplantasjon
- Varm opp mottaker musene bestrålt i trinn 1.2 med en rød varmelampe for å sikre utvidelse av blodårer, og for å gjøre den laterale halevenen mer synlig.
- Forbered en 1 ml tuberkulin sprøyte utstyrt med en 27 G nål (eller mindre). Aspirer omtrent 750 ul av den fremstilte cellesuspensjon (for 3 resipientmus). Pass på at det ikke er luftbobler i sprøyten.
- Sett musen til en holdeanordning. Undersøk halen og ser etter sidehalevenene som skal være godt synlig på begge sider av halen. Tørk av injeksjonsstedet med etanol. Sett nålen skrå opp, parallelt med huden og trykker stempelet forsiktig. Injeksjon skal være enkelt. Hvis kraften er revendig, er nålen ikke i venen.
Merk: Eldre mus har tykkere hud, noe som kan gjøre å finne en blodåre vanskeligere. Hvis nålen ikke er i venen, sett nålen proksimale til den opprinnelige injeksjonsstedet. - Fjern nålen og trykk på injeksjonsstedet med sterilt gasbind i noen sekunder for å stoppe blødningen. Overfør musen i et rent bur.
Merk: Bruk samme sprøyte og nål for tre injeksjoner, etter som nålen kan bli for kjedelig. - For etter transplantasjon oppfølging, injisere 1 ml steril PBS subkutant å rehydrere musene for de første fem dagene. Legg antibiotika i drikkevann for å forebygge infeksjoner (hvis nødvendig, tilleggsutstyr). Vei mus hver to til tre dager for de første tre ukene, og avlive mus som har mistet mer enn 15-20% sine pre-transplantasjon kroppsvekt (eller som bestemmes av den lokale dyreetikk komité).
5. Analyse av perifert blod
- Samle en dråpe blod (enpprox. 50-100 mL) i EDTA-rør.
- Å samle blod fra kjeve vene, kan du bruke en lansett eller en 22 G nål for å stikke hull på ansiktshuden nær hårløs flekk under kjevebenet og plasser oppsamlingsrøret for å få bloddråpen 13. Samle blod ved 4, 8, 12 og 16 uker etter transplantasjon å følge multi-avstamning tilberedning.
- Tilsett 1 ml nyfremstilt RT røde blodceller lyseringsbuffer (9 deler 0,16 M NH4CI + en del 0,17 M Tris-HCl, pH 7,65) til den dråpe blod oppsamlet i trinn 5.1.1. Bland og overføre prøven til en 5 ml rundbunnet polystyren rør egnet for strømningscytometri. La stå i 4 min ved RT.
- Tilsett 4 volumer av iskald PBS. Bland ved å dreie ende-til-ende og overfører straks på is. Sentrifuger i 10 minutter ved 200 xg ved 4 ° C.
- Dekanter supernatanten og resuspender pellet ved å flikke. Overstående skal være klar og rød. Tilsett 2 ml flekker buffer og vortex kort. Sentrifuge 5 min ved 200 xgat 4 ° C.
- Dekanter supernatanten og resuspender pellet ved å flikke.
- Fortsett med flowcytometri flekker ved hjelp av den generelle protokollen beskrevet i trinn 3.1 til 3.3 og følgende antistoffer for master mix: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1.
- Erverve celleprøver ved hjelp av et flowcytometer med minst seks detektorer 9. Bestemme frekvensen av donor-avledede celler for hver avstamning (CD19 + B-lymfocytter, CD3e + T-lymfocytter, granulocytter GR1 lyse) i hver prøve ved hjelp av analyse mal gitt i figur 3, og som er publisert 10,11.
6. Analyse av Bone Marrow Rekonstituering
- Samle benmargceller som beskrevet i kapittel 2. Beis cellene for flowcytometri analyse ved hjelp av generell protokoll beskrevet i trinn 3.1 til 3.3 og følgende antistoffer for master mix: Lineage cocktail, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. oppdage linEAGE cocktail antistoffer ved hjelp av fluorokromkonjugerte konjugert streptavidin som beskrevet i trinn 3.4.
- Acquire celleprøver ved hjelp av et flowcytometer med minst åtte detektorer 9. Hvis bare seks er tilgjengelig, legger CD135 på samme kanal som avstamning panel som CD135 + celler vil bli ekskludert. Bestem frekvensen av donor-avledet Lin - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + HSCs i hver prøve ved hjelp av analyse mal gitt i Figur 4 og som publisert 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En generell beskrivelse av konkurranse transplantasjon innstilling, herunder sekundær transplantasjoner (omtalt nærmere nedenfor) kan finnes i figur 1. En representant analyse for pre-transplantasjon benmarg HSCs kan finnes i figur 2. Mer detaljert informasjon om utelukkelse av dubletter og døde celler kan finnes andre steder ni.
Figurene 3 og 4 gir eksempler på flowcytometri analysedesign for perifert blod og benmarg, respektivt. Det er vanlig å detektere noen vert T-lymfocytter (opp til 20% av alle T-celler, figur 3B), som T-celler er mer radio-resistente. Konkurrent-deriverte celler bør være til stede i alle de tre linjene. Deteksjonsgrensen avhenger mye av det totale antallet celler ervervet for analyse, men vår erfaring totalt 20 tusen celler ienkelt leukocytter gate er vanligvis tilstrekkelig. Ved hjelp av en vilkårlig terskelverdi på 1% eller 0,5%, hvis donorceller representerer en lavere andel enn grenseverdien på hvilken som helst gitt avstamning (B lymfoid, T-lymfoid eller myeloid som vist i figur 3), blir mus ikke ansett positiv for multilineage rekonstituering . Dette konseptet blir viktig når de konkurrerende transplantasjoner er kombinert med en begrensende fortynningsanalyse for å kvantifisere donor HSCs som forklart i diskusjonen. Det er absolutt mulig å ha, for eksempel, donor-avledede T- og B-lymfocytter, men gradvis tap av myeloide celler, noe som vanligvis vil foreslå bare forbigående rekonstituering. Lymfocytter har lengre halveringstid enn myeloide celler (spesielt Gr1hi SSChi granulocytter / nøytrofiler) og kan vedvare selv i fravær av benmargen HSCs 10.
Figur 5 viser representative resultater for perifert blod kimerisme under forskjellige situsjoner. Når giver HSCs er funksjonelt likeverdig konkurrent celler, proporsjonene av donor (CD45.2 +) og konkurrent (CD45.1 +) avledede celler er tilsvarende (figur 5A). De gjenværende vertsceller (CD45.1 + CD45.2 +) i Figur 5A og 5B er nesten utelukkende T-lymfocytter som de er mer radio-resistente. Når donorceller presentere en mye lavere andel av perifere blodleukocytter (figur 5B), noen aspekter av HSC funksjon er sannsynlig defekt, og videre studier er nødvendig som beskrevet i diskusjonen. Tilstedeværelsen av konkurrent celler bekrefter at analysen fungerte bra, men giver benmarg var bare mindre effektiv. Dette er i motsetning til resultatet presentert i figur 5C, hvor både donor og konkurrent celler er til stede i lave tall og vertsceller som utgjør hoveddelen av perifere blodceller. I dette tilfellet transplantasjon var mislykket og jegt er ikke mulig å trekke noen slutninger om den relative funksjonaliteten donor versus konkurrent celler. Ulike løsninger er drøftet nærmere nedenfor.
. Figur 1. Eksperimentell design (A) For et konkurranse transplantasjon, benmargceller fra donor mus (CD45.2 +; C57BL6 bakgrunn, kontroll- og test) og congenic konkurrent mus (CD45.1 +; B6.SJL) blandes i et 1: 1 forhold og injisert i halevenen av bestrålte mottaker mus (CD45.1 + CD45.2 +; F1 avkom C57BL6 x B6.SJL hekkende par). Effekten av benmarg rekonstituering blir bestemt i perifert blod (PB) ved 4, 8, 12 og 16 uker etter transplantasjon og i beinmargen ved 16 uker etter transplantasjon eller senere. (B) For å ytterligere evaluere selvfornyelse av transplanterte celler, bone marg cellene utvinnes fra resipienter etter 16 uker kan overføres til bestrålte sekundære mottaker mus. HSC, stamcelle; MPP, multipotent stamcelle; LMPP, lymfoid-primet MPP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Pre-transplantasjon benmarg HSC analyse mal. Innenfor enkeltceller, velger HSPCs ifølge cKit (CD117) og Lineage uttrykk. Innenfor Lin dim / - cellepopulasjon, velg cKit lyse Sca1 + befolkningen (LSK). Innenfor LSKs velger CD150 + CD135 - HSCs. Denne populasjonen inneholder både langsiktig og kortsiktig repopulating HSCs (frekvensen for en repopulating celle i denne populasjonen er å værelom 1/3 og 1/5). Estimert hyppighet av benmarg HSCs beregnes ved å dele antall hendelser i HSC gate med antall hendelser i én celle gate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Post-transplantasjon perifert blod analyse mal. (A) Innenfor enkeltceller, velger første GR1 lyse SSC hi granulocytter. (B) Velg deretter CD19 + CD3e - B-lymfocytter og CD3e + CD19 - T-lymfocytter. Mus perifert blod inneholder en stor andel av lymfocytter, med B-lymfocytter som er den største celletype (ca. 50% alle perifere blodceller). CE) Tegn 2D flowcytometri tomter for hver undergruppe med CD45.2 på en akse og CD45.1 på den andre. Identifisere donor (CD45.2 +), vert (CD45.1 + CD45.2 +) og konkurrent celler (CD45.1 +) for hver avstamning som vist. Det er normalt å ha noen gjenværende vertsceller, spesielt i T-lymfocytt befolkningen sett i panelet E. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Post-transplantasjon benmarg HSC analyse mal. Innenfor enkeltceller, velger HSPCs og LSKs som vist for figur 2. Innenfor LSKs velger CD150 + CD135- HSCs, CD150- CD135- multipotente stamceller (eller MPP) og CD150- CD135 + lymfoid -primed MPP (eller LMPPs). Andelen LMPPs er lavere etter transplantasjon enn i ikke-bestrålte mus. Tegn 2D flyt cytometry plott for hvert delsett med CD45.2 på en akse og CD45.1 på den andre. Identifisere donor, vert og konkurrerende celler for hver undergruppe som vist. Hvis bestråling og transplantasjon er vellykket, bør det være svært få gjenværende verts HSPCs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Representative resultater for perifert blod kimerisme. (A) Vellykket transplantasjon der donor HSCs er funksjonelt likeverdig med konkurrenten celler. De aller fleste av de resterende vertsceller (CD45.1 + CD45.2 +) er vanligvis T-lymfocytter. (B) Vellykket transplantasjon hvor donor HSCs viser nedsatt funksjon i forhold til konkurrenten celler. Dette reduserte bidraget kan skyldesflere ulike faktorer og videre analyse vil være nødvendig (se diskusjon). (C) Mislykket transplantasjon med lave frekvenser av både konkurrerende og donorceller og en stor andel av de gjenværende vertsceller. Denne typen resultatet tyder på en lavere enn forventet dose av stråling, mislykket injeksjon (redusert celle levedyktighet, redusert volum av injeksjon, injeksjon utenfor halevenen), eller en kombinasjon av disse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet her er utformet for å evaluere den relative trenings av donor (test) HSCs mot kjente konkurrent HSCs. Situasjonen for konkurranse øker den relative følsomheten til analysen (større sannsynlighet for å detektere moderate reduksjoner i stamcelle kondisjon) og gir en intern kontroll for teknisk effekt av bestråling og injeksjon. Men det bør ikke brukes som et absolutt mål på HSC fitness; en nedgang i konkurranse oppløsning betyr ikke automatisk at HSCs ikke ville gjøre det bra i fravær av konkurranse. Selv om det kan hevdes at en konkurransedyktig innstillingen er bedre utgangspunkt, som konkurrenten cellene vil redde defekte HSC funksjon og alle mottaker mus vil overleve, bør man være forsiktig med tolkningen av resultatene. Bekrefte resultatene i en ikke-konkurrerende innstillingen vil stivne konklusjonene.
Den eksperimentelle designen presenteres her bruker HSC tilsvar quantities av totalt benmargceller i stedet for rene populasjoner av flowcytometri -sorted HSCs. Det er viktig å utjevne antall HSCs i alle populasjoner under studie (forskjellige donorer, konkurrent) for å eliminere variabiliteten mellom ulike givere og sørge for at variasjoner i fenotypisk HSC frekvens ikke vil bli tolket som endringer i HSC funksjon 14. Fordelene ved den metode som er beskrevet her over rensede HSCs er: forbedret cellelevedyktighet på grunn av kortere behandlingstider og mangel på utvendig trykk under sortering; og forbedret homing til mottakeren benmarg (tilstedeværelse av antistoffer på sorterte cellene kan forstyrre deres innpoding i benmargen 15). Omvendt er den viktigste ulempen bidraget fra ikke-HSC populasjoner til transplantasjon resultat, særlig rolle kortvarige progenitorceller ved tidlige tidspunkter etter transplantasjon. Videre, hvis behandling eller genetisk modifisering endrer ekspresjonen av surface markører som brukes for utvelgelse av HSCs 16, kan det være et betydelig antall HSCs "i forkledning" i en prøve, men ikke i en annen, noe som vil påvirke resultatene. Imidlertid kan det samme problemet også oppstå ved bruk av rensede HSCs og er iboende i transplantasjon analysen.
De oppnådde med dagens protokollen resultatene er bare kvalitative på befolkningsnivå. Med andre ord, kunne en redusert bidrag av donorceller etter transplantasjon være på grunn av; et lavere antall funksjonelle HSCs i start befolkningen; en redusert evne til de enkelte HSCs å bosette seg i benmargen og ekspandere i de første dagene og ukene etter transplantasjon; eller problemer med differensiering og vekst til modne celler som brukes for deteksjon i periferien. Det er derfor viktig å ikke bruke resultatene fra et konkurranse transplantasjon isolert, men å utfylle dem med analyser som vil måle celleproliferasjon, overlevelse og differensiering fra HSC på sirkulerende blodceller. Det er også viktig å sammenligne donorcelle bidrag mellom perifert blod (figur 3) og benmarg (figur 4) tilstedeværelse av donor-deriverte HSCs i benmargen kombinert med fravær av donorceller i perifert blod vil være en indikasjon på en differensiering blokk . Selv om det ikke er vist i eksempelet, er det også mulig å vurdere erytroid rekonstitusjon basert på ulike isoformer av Gpi1 17. Gitt det store antall erytrocytter til stede i blod, representerer de en meget følsom fremgangsmåte for påvisning av donor-avledede celler, noe som kan være spesielt nyttig når transplantasjonen lavt antall HSCs eller etter sin produksjon over lange tidsperioder. I den andre enden av spekteret, myeloide celler er ofte de første til å mislykkes som detekteres, delvis på grunn av deres lave frekvens i perifert blod, og delvis på grunn av deres korte halveringstid.
Det er mulig å tilpasse the konkurrerende repopulation assay for å tillate kvantifisering av HSCs ved hjelp av den begrensende fortynningsanalyse (eller LDA). Dette vil kreve en mye større antall mottaker mus delt inn i flere forskjellige grupper hvor hver gruppe mottar et annet forhold til konkurrenten: donorceller, enten sorterte eller usorterte som beskrevet ovenfor. Ettersom antallet av donorcellene reduseres, vil det være flere mus i hvilken andelen av donor-avledede celler ikke når den forhåndsbestemte terskelverdi i en eller flere linjer. Det er da mulig å plotte frekvensen av "negative" mus pr gruppe mot antall transplanterte donorceller og bestemme frekvensen av HSCs fra den påfølgende grafen 18,19.
Den foreslåtte varighet av post-transplantasjon oppfølging varierer i litteraturen. Det brukes for å være sikker på konsensus der periode på 16 uker etter transplantasjonen ble ansett å være tilstrekkelig for å reflektere utgangen fra langtids HSCs. Men nyere rapporter om "intermediate "HSCs hvis funksjon avtar kort tid etter 16 uker har understreket behovet for enda mer grundig evaluering av HSC funksjon 17. Det er sikkert mulig å forlenge oppfølging av resipienter forbi 16 uker tidspunkt for å tilfredsstille disse bekymringene. En alternativ, igjen med en kanskje høyere følsomhet, er den sekundære transplantasjon (figur 1B), hvor benmargceller utvinnes fra første resipienter blir injisert i bestrålt sekundære mottakere. den andre transplantasjon setter ekstra proliferativ press på HSCs, og tvinger sin exit fra dvalen og bare åpne celler med robust selvfornyelse for å opprettholde deres produksjon. det er noen ganger foretrukket å anvende sorterte donorceller for bedre å tilpasse HSC tall mellom forskjellige prøver for de sekundære transplantasjoner. Alternativt er det mulig å etablere en beregnet forholdet mellom donor : konkurrent HSCs fra primær benmargen (f.eks
Som nevnt ovenfor, er en rekke grunner for at en gitt populasjon av donor HSCs kan vise nedsatt kapasitet for langsiktig rekonstituering. En slik grunn er muligheten for HSCs å migrere til benmargen etter transplantasjon (også kalt homing) og bosette seg i beinmargen nisje. Det er mulig å tilpasse den protokoll som presenteres her for å undersøke benmarg homing og kortsiktig ekspansjon. Det er nødvendig å øke antallet av transplanterte celler (som tilsvarer 5000-10000 HSCs formålsøkende analyser og 1000-2000 HSCs for analyse innen den første uken etter transplantasjon). I homing analysen, blir mottaker mus avlivet i løpet av den første 16-24 timer etter transplantasjon og antallet donor HSCs som har nådd benmargen bestemmes som beskrevet i den foreliggende protokoll. For ytterligere å vurdere sin funksjon, kan benmargceller utvinnes fra de kortsiktige mottakere bli transplantert inn sekundære mottakere som forklart i Figur 1B. Andelen av donor-avledede celler i de sekundære mottakerne kan deretter brukes til å evaluere evnen til donor HSCs til å migrere og sette inn mottakeren benmargen.
oppstår store problemer med konkurransebenmargstransplantasjon fra bestråling og injeksjon og presentere seg selv som enten økt etter transplantasjonen dødelighet eller redusert oppløsning effektivitet. Split-dose stråling, som presenteres her, er vanligvis forbundet med mer effektiv myeloablasjon ogmindre toksisitet når sammenlignet med enkeltdose 20. Med dose anbefalt her (to ganger 450 rad), blir myeloide og B-lymfoide populasjoner effektivt slettet, men rest T-lymfocytter gjøre forbli (figur 3). Hvis det ikke er noen grunn til å mistenke transplantatawisning (giver- og mottaker mus fra forskjellige genetiske bakgrunner), en høyere dose av bestråling (to doser av 550-600 rad) og en kortere forsinkelse mellom de to dosene (4 timer i stedet for den påfølgende dagen ) skal bidra til å eliminere rester av T-lymfocytter og redusere muligheten for pode svikt på grunn av avvisning. Feil injeksjon eller injeksjon i perivaskulær plass i stedet for halevenen, vil problemer med donor celle levedyktighet, eller donor celle forurensning på grunn av mangel på omsorg i løpet av prøveopparbeidelse også øke graft svikt og etter transplantasjonen dødelighet. Ineffektiv bestråling (på grunn av tekniske problemer, for eksempel) vil resultere i redusert oppløsning effektivitet, men bør ikke øke mortality. I alle disse situasjonene, tilstedeværelse av konkurrerende celler i analysen bidrar til å distansere tekniske problemer (som beskrevet her) fra en bona fide nedgang i giver HSC funksjon som konkurrenten cellene skal alltid være i stand til å rekonstituere det bestrålte mottakeren. Immundefekte verter kan også anvendes, for eksempel, for å redusere behovet for bestråling og / eller risiko for avstøting, og for å evaluere funksjonen av human HSCs 21-23.
I konklusjonen, presenterer vi her et konkurranse transplantasjon protokoll som kan tilpasses flere forskjellige bruksområder som beskrevet i diskusjonen. Vår tilnærming benytter HSC ekvivalenter, noe som reduserer behandlingstiden og samtidig forbedrer cellelevedyktigheten i transplantatet sammenlignet med cellesortering. Det er også en praktisk løsning da adgang til en celle sorter er begrenset, og krever færre mus i forhold til den kvantitative analysen LDA, noe som gjør det til et attraktivt utgangspunkt for analyse av HSC funksjon. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Roxann Hetu-Arbour for å få hjelp med figuren design og demonstrasjon av prosedyrene. Forskning i laboratoriet ble støttet av en overgang pris fra Cole Foundation, Discovery gi no. 419226-2012 fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC) og Canada Foundation for innovasjon (CFI Leaders Fund gi no. 31377). KMH er en Chercheur-Boursier Junior for Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| 20 G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | |
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μg/ml |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μg/ml |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μg/ml |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μg/ml |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μg/ml |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μg/ml |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 56149 | 0.5 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0.25 μg/ml |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 558162 | 0.25 μg/ml |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μg/ml |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0.625 μg/ml BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1 ml tuberculin syringe with 27 G needle | BD Syringe | 309623 | |
| 1 ml tuberculin syringe with 25 G needle | BD Syringe | 309626 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 |
References
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
