Introduction
Hematopoes är en regenerativ process som säkerställer påfyllning av blodkroppar som har gått förlorade på grund av skada, strålning och celldöd. Denna process säkerställs genom hematopoetiska stamceller (HSC) som till stor del bor i den vuxna benmärgen. Dessutom kan hematopoietiska stamceller användas för terapeutiska ändamål i autoimmuna sjukdomar, hematologiska maligniteter och immunbrister 1. Det finns således ett behov av att bättre förstå de mekanismer som reglerar HSC funktion, inklusive deras proliferativa expansion och deras förmåga att nå och ympas mottagaren benmärg efter transplantation. Även nyare studier har rapporterat flera cellytmarkörer, inklusive SLAM familjemedlemmar CD150 och CD48, att prospektivt berika vuxna HSCs och foster HSCs till ca 50% renhet 2-4, guldstandardmått för funktionell HSCs fortfarande ett in vivo återinplantering analys för att bestämma deras förmåga att återupprätta blod cell produktion i en bestrålad värd 5.
In vivo klonåterpopulation analys utvecklades ursprungligen av Till och McCulloch 6 och har sedan dess förfinats och utökats. Ursprungligen angiven, HSCs säkerställa produktionen livslångt blodkroppar genom självförnyelse och differentiering. Överföringen av HSC: er i en bestrålad mottagare kan alltså oss att bedöma deras förmåga att differentiera genom analys av de olika blodcellinjer (T-lymfocyter, B-lymfocyter, granulocyter, monocyter) och deras förmåga till självförnyelse via seriell transplantation. Analysen skulle vanligtvis innebära en jämförelse av funktionaliteten och / eller kvantitet av två populationer av HSC: er, t ex celler som kommer från två möss av olika genotyper eller celler som har behandlats eller inte behandlats med olika faktorer som kan påverka underhåll eller expansion av HSC: er i kultur. Donator chimerismen eller bidrag överförd donator HSCs to blodkroppar kan sedan bestämmas genom flödescytometrianalys i det perifera blodet och benmärgen med hjälp av markörer på cellytan eller andra metoder som kommer att skilja donatorceller från mottagaren, eller värd. De mest använda markörerna är säkerligen två alleler för genen Ptprc eller CD45 leukocytantigen 7 som vi har valt för exemplen nedan.
Den klonala återinsättning analysen kan vara antingen konkurrerande eller icke-konkurrenskraftiga. I en icke-konkurrenskraftig miljö, är kontroll- och test HSCs överförs till separata mottagande möss och utfallet för varje celltyp kommer att vara oberoende av den andra. På en konkurrensutsatt miljö, är funktionen av både test- och kontroll HSCs mätt mot en population av konkurrent HSCs. Protokollet som beskrivs här använder konkurrenskraftig miljö men kan också anpassas för icke-konkurrenssituationer. Båda tillvägagångssätten har sina fördelar och begränsningar, och vi kommer att jämföra dem i detalj idiskussion. Vi beskriver också olika metoder för att säkerställa rättvisa i antalet transplanterade HSCs, förklarar hur man anpassar analysen för kvantifiering av HSC: er genom begränsande utspädning analys (LDA), och ger exempel på både lyckade och misslyckade transplantationer för tolkning av resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som beskrivs i detta protokoll har godkänts av Institutional Animal etiska kommittén och följa den kanadensiska rådet om Animal Care riktlinjer.
OBS: För att bibehålla sterila / specifika patogenfria bostadsförhållanden, genomföra alla förfaranden som rör direkt hantering av levande möss i ett biologiskt säkerhetsskåp eller ett laminärt flöde huva. Rengör eller sterilisera burar, fasthållningsanordningar, bostäder material, chow och vatten ges till djuren på lämpligt sätt. Använd endast sterila engångsnålar för injektioner och blodprovstagning. Aseptisk teknik är avgörande under framställning av transplantatet.
1. Framställning av mottagarmöss
- Identifiera mottagande möss med öron skåror (eller annan metod som godkänts av den lokala djuretik kommittén 8) för att möjliggöra individuell uppföljning av perifert blod och benmärg beredning över tiden. Väg mössen för post-transplantation uppföljning. Osse mottagande möss som är mellan 7 och 12 veckor gamla (mindre än 25 g).
Obs: I den medföljande exempel var CD45.1 + CD45.2 + mottagande möss uppfödda i huset genom att korsa C57BL / 6 möss med kongena B6.SJL möss. - Bestråla mottagande möss med två doser av 450 rad för att förstöra hematopoetisk aktivitet. Ge den första dosen dagen före transplantationen och den andra 2/1 h före transplantation.
Obs: X-ray eller gammastrålar kan både användas beroende på tillgången på lämpliga anläggningar.
2. Beredning av givare och Konkurrent benmärgsceller
- Avliva donator (prov och kontroll, CD45.2 +) och konkurrent (CD45.1 +; B6.SJL) möss genom CO 2 kvävning följt av halsdislokation eller använda metoder som godkänts av den lokala djuretisk kommitté.
- Placera möss på rygg, ben vidöppna, i en tom petriskål eller på en steril gasväv (för att hålla arbetsytan ren) inside ett biologiskt säkerhetsskåp. Väta huden och pälsen med 70% etanol / 30% H2O (volym / volym).
- Skär av foten med ett kirurgiskt blad eller vass sax. Skära upp huden längs benet och dra bort huden med sågtandade pincett. Klipp bort överflödigt muskler.
- Rubba lårbenet genom att dra benet ben och användning av skärbladen mot bäckenet som en motkraft. Lossa skenbenet och lårbenet från knäskålen och avlägsna återstående bitarna av muskler och senor. Placera benen i 2-3 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta.
- Samla benmärgsceller genom att spola benen med 5 ml steril PBS.
- Hålla benet försiktigt med pincett och sätt i en 25 G-nål fäst vid en fylld 1 ml spruta till en ände av benet. Tryck på kolven och samla upp cellerna i en 15 ml koniska rör. Upprepa efter behov tills mitten av benet är vit.
- Dissociera cellerna genom upprepad passage genom nålen tillerhålla en enkelcellsuspension. Undvika bubblor och överdriven kraft. Obs: Använd en något större nål (22 G) för att förbättra cellviabilitet i detta steg.
- Passera cellerna genom en 70 pm nylon sil för att säkerställa en enhetlig cellsuspension och för att avlägsna skräp och klumpar.
- Ta en portion för cellräkning med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera den återstående cellsuspensionen vid 200 xg under 5 min vid 4 ° C. Justera celltäthet som krävs i steril PBS (10 8 celler / ml). Hålla cellerna på is.
3. Upprättande donatorcell HSC ekvivalenter
- Överföra motsvarande 3 x 10 6 celler (30 | il) i en 5 ml rundbottnad polystyrenrör för flödescytometri färgning. Tillsätt en lika volym av omärkt antikropp mot CD16 / CD32 för att blockera icke-specifik färgning (utspädd i färgningsbuffert (PBS kompletterat med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) och 1 mM EDTA) för en slutkoncentration av 2,5 | ig / ml). Inkubera 5 min vid RT.
- Lägg 90 l fluorokromkonjugerade antikropp Master Mix upprättats i färgning buffert: biotinylerad Lineage cocktail (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. Inkubera på is i 30 minuter, skyddade från ljus.
Obs: Lämpliga späd bör bestämmas för varje parti antikropp. Se tabell över material för späd används i denna studie. - Tillsätt 2 ml färgningsbuffert till cellerna, virvel och centrifugera vid 200 xg under 5 min vid 4 ° C för att avlägsna obunden antikropp. Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten genom att slå.
- Tillsätt 10 | il fluorokrom-konjugerad streptavidin utspätt i färgningsbuffert (se material tabell). Inkubera på is i 20 minuter, skyddade från ljus. Tvätta som i steg 3,3 för att avlägsna obundet streptavidin.
- Förvärva cellprover med hjälp av en flödescytometer med minst sex detektorer 9. Bestämma frekvensen av Lin - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150
Obs: Frekvensen av funktionella HSCs inom denna population kan uppskattas till mellan 1/3 och 1/5 2,12. - Fastställa uppskattade HSC motsvarigheter för alla prover 11, med hjälp av ett prov (typiskt konkurrenten, B6.SJL CD45.1 + i detta exempel) som baslinje som beskrivs nedan och i figur 2.
- Beräkna antalet celler som krävs med hjälp av följande formler:
#transplanted HSCs / mottagare = 5 x 10 5 celler x beräknas HSC frekvens (som fastställts för baslinjen prov, detta nummer är vanligtvis mellan 75 och 125 för vildtyp C57BL / 6 möss) 10-12.
Notera: I fig 2, för Prov A, är resultatet 139 HSCs.
Totalt transplanterade celler (för andra prover, t.ex. prov B i figur 2) = # transplanterade HSCs / HSC frekvens.
Notera: I fig 2, för prov B, är resultatet 197826 (eller approximativt 2 x 10 5) totala benmärgsceller.
- Beräkna antalet celler som krävs med hjälp av följande formler:
- Beräkna det totala antalet celler som krävs per transplantat mottagare för varje prov med hjälp av de resultat som erhållits ovan.
Obs: Det här numret bör vara 5 x 10 5 för provet baslinjen (konkurrent).- Multiplicera det värde som erhålls från steg 3,7 med antalet mottagande möss och lägga tillräckligt med celler för ytterligare minst två möss för att kompensera för de döda volymen i sprutan.
- Blanda konkurrent (t.ex. CD45.1 +) och testceller (CD45.2 +) i 1: 1 HSC motsvarande förhållande som beräknats i steg 3,6 och justera den slutliga volymen till 200 ul per injektion med steril PBS.
Notera: För en grupp av fem mottagarmöss den föreslagna volymen skulle således vara minst 1,4 ml, innehållande 3,5 x 10 6 konkurrentbenmärgsceller (eller973 beräknade HSCs för prov A i figur 2), och motsvarande antal testceller (i figur 2, skulle motsvarande för prov B vara 197.826 x 7 = 1,384,782 benmärgsceller).
4. benmärgstransplantat
- Värm upp de mottagande mössen bestrålade i steg 1,2 med en röd värmelampa för att garantera utvidgning av blodkärlen och att den laterala svansvenerna mer synliga.
- Förbered en tuberkulinspruta en ml utrustad med en 27 G nål (eller mindre). Aspirera ungefär 750 l av det beredda cellsuspensionen (för tre mottagande möss). Se till att det inte finns några luftbubblor i sprutan.
- Sätt musen i en återhållande anordning. Undersök svansen och leta efter sido venerna svans som ska vara väl synlig på båda sidor av svansen. Torka av injektionsstället med etanol. Stick in nålen fasa upp, parallellt med huden och tryck försiktigt kolven. Injektion ska vara enkelt. Om kraft är reDRAS är nålen inte i venen.
Obs: Äldre möss har tjockare hud, vilket kan göra att hitta venen svårare. Om nålen inte är i venen, sätt tillbaka nålen proximalt till det initiala injektionsstället. - Ta bort nålen och tryck på injektionsstället med steril gasbinda för några sekunder för att stoppa blödning. Överför musen i en ren bur.
Obs! Använd samma spruta och nål för tre injektioner, varefter nålen kan bli alltför tråkig. - För efter transplantation uppföljning injicera 1 ml steril PBS subkutant att rehydrera mössen under de första fem dagarna. Lägg till antibiotika i dricksvattnet för att förhindra infektioner (om så krävs, tillval). Väg möss var två till tre dagar för de första tre veckorna och avliva möss som har förlorat mer än 15-20% deras pre-transplantation kroppsvikt (eller som bestäms av den lokala djuretisk kommitté).
5. Analys av perifert blod
- Samla in en droppe blod (enpprox. 50-100 | j, l) in i EDTA-rör.
- För att samla blod från underkäken ven, använda en lansett eller en 22 G nål för att tränga igenom huden i ansiktet nära den hårlösa plats finns under käkbenet och placera uppsamlingsröret för att ta emot bloddroppen 13. Samla blod vid 4, 8, 12 och 16 veckor efter transplantation för att följa flera härstamning beredning.
- Tillsätt 1 ml nygjord RT röda blodkroppar lysbuffert (9 delar 0,16 M NH4CI + 1 del 0,17 M Tris-HCI pH 7,65) till droppe blod uppsamlat i steg 5.1.1. Blanda och överföra provet till en 5 ml rundbottnad polystyrenrör lämplig för flödescytometri. Låt stå i 4 min vid RT.
- Tillsätt 4 volymer av iskall PBS. Blanda genom att vända ände mot ände och överför omedelbart på is. Centrifugera 10 min vid 200 xg vid 4 ° C.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten genom att slå. Supernatant bör vara tydliga och rött. Tillsätt 2 ml färgning buffert och skaka kort. Centrifugera 5 min vid 200 xgat 4 ° C.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten genom att slå.
- Fortsätt med flödescytometri färgning med hjälp av det allmänna protokollet som beskrivs i steg 3,1 till 3,3 och följande antikroppar för Master Mix: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1.
- Förvärva cellprover med hjälp av en flödescytometer med minst sex detektorer 9. Bestämma frekvensen av givarhärledda celler för varje härstamning (CD19 + B-lymfocyter, CD3e + T-lymfocyter, GR1 ljusa granulocyter) i varje prov med hjälp av analys mallen i figur 3 och som publiceras 10,11.
6. Analys av benmärg Rekonstitution
- Samla benmärgsceller som beskrivs i avsnitt 2. Stain cellerna för flödescytometri analys med hjälp av allmänna protokollet beskrivs i steg 3.1 till 3.3 och följande antikroppar för Master Mix: Lineage cocktail, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. detektera linEage cocktail antikroppar med användning av fluorokrom-konjugerad streptavidin såsom beskrivs i steg 3,4.
- Förvärva cellprover med hjälp av en flödescytometer med åtminstone åtta detektorer 9. Om bara sex finns, lägg CD135 på samma kanal som härstamning panel som CD135 + celler kommer att uteslutas. Bestämma frekvensen av donator-härledd Lin - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + HSCs i varje prov med hjälp av analys mallen i figur 4 och som publicerats 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En allmän beskrivning av konkurrenstransplantations inställningen, inklusive sekundära transplantat (diskuteras vidare nedan) kan hittas i figur 1. En representativ analys för pre-transplantation benmärg HSCs kan hittas i figur 2. Mer detaljerad information om uteslutning av dubbletter och döda celler kan hittas någon annanstans 9.
Figurerna 3 och 4 ger exempel på flödescytometri analysmallar för perifert blod och benmärg, respektive. Det är normalt att detektera vissa värd T-lymfocyter (upp till 20% av alla T-celler; figur 3B), såsom T-celler är mer radioresistenta. Konkurrenthärledda celler bör vara närvarande i alla tre linjerna. Detektionsgränsen beror mycket på det totala antalet celler som förvärvats för analys, men vår erfarenhet totalt 20 tusen celler ienda leukocyter grind är vanligen tillräcklig. Använda en godtycklig tröskel på 1% eller 0,5%, om givarceller utgör en lägre andel än cutoff i en viss härstamning (B lymfatisk T lymfatisk eller myeloisk som visas i figur 3), är musen inte vara positivt för multilineage beredning . Detta koncept blir viktigt när konkurrens transplantationer kombineras med en begränsande utspädningsanalys för att kvantifiera givar HSCs som förklaras i diskussionen. Det är säkert möjligt att ha, till exempel, donatorhärledda T- och B-lymfocyter men gradvis förlust av myeloida celler, som normalt skulle tyda endast övergående beredning. Lymfocyter har längre halveringstider än myeloidceller (särskilt Gr1hi SSChi granulocyter / neutrofiler) och kan kvarstå även i frånvaro av benmärgen HSCs 10.
Figur 5 visar representativa resultat för perifert blod chimerism under olika situheten. När givar HSCs är funktionellt likvärdig med konkurrerande celler, proportionerna av givare (CD45.2 +) och konkurrent (CD45.1 +) härledda celler är likvärdiga (Figur 5A). De kvarvarande värdceller (CD45.1 + CD45.2 +) i figur 5A och 5B är nästan uteslutande T-lymfocyter eftersom de är mer radioresistenta. När givarceller presenterar en mycket lägre andel av perifera blodleukocyter (Figur 5B), vissa aspekter av HSC funktion troligen defekt och ytterligare studier behövs som beskrivs i diskussionen. Förekomsten av konkurrerande celler bekräftar att analysen fungerade bra men donator benmärg var helt enkelt mindre effektiva. Detta står i kontrast till det resultat som presenteras i figur 5C, där både donator- och konkurrent celler är närvarande i lågt antal och värdceller utgör majoriteten av perifera blodceller. I detta fall transplantationen misslyckades och jagt går inte att dra några slutsatser om den relativa funktionalitet donator mot konkurrerande celler. Olika lösningar diskuteras vidare nedan.
. Figur 1. Experimentell design (A) För en konkurrenskraftig transplantation, benmärgsceller från donatormöss (CD45.2 +, C57BL6 bakgrund, kontroll och test) och kongena konkurrent möss (CD45.1 +; B6.SJL) blandas i en 1: 1-förhållande och injicerades i svansvenen av bestrålade mottagarmöss (CD45.1 + CD45.2 +; F1 avkomman av C57BL6 x B6.SJL avelspar). Effektiviteten av benmärgs rekonstitution bestäms i perifert blod (PB) vid 4, 8, 12 och 16 veckor efter transplantation och i benmärgen vid 16 veckor efter transplantationen eller senare. (B) För att ytterligare utvärdera självförnyelse av transplanterade celler, bone benmärgsceller som återvunnits från mottagare av transplantat efter 16 veckor kan överföras till bestrålade sekundära mottagande möss. HSC, hematopoetisk stamcellstransplantation; MPP, multi stamcellstransplantation; LMPP, lymfoid-primas MPP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. före transplantationen benmärgs HSC analys mall. Inom enskilda celler väljer HSPCs enligt ckit (CD117) och Lineage uttryck. Inom Lin dim / - cellpopulationen, väljer ckit ljusa Sca1 + befolkning (LSK). Inom LSKs väljer CD150 + CD135 - HSCs. Denna population innehåller både lång- och kortsiktiga återinplantering HSCs (frekvensen av en återpopulation cell i denna patientgrupp är varatween 1/3 och 1/5). Den beräknade frekvensen av benmärgs HSCs beräknas genom att dividera antalet händelser i HSC gate av antalet händelser i en enda cell grinden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Post-transplantation perifera blodanalys mall. (A) Inom enskilda celler markerar första GR1 ljusa SSC hi granulocyter. (B) Välj sedan CD19 + CD3e - B-lymfocyter och CD3e + CD19 - T-lymfocyter. Mus perifert blod innehåller en stor andel av lymfocyter, med B-lymfocyter är den huvudsakliga celltypen som (ca 50% alla perifera blodceller). CE) Rita 2D flödescytometri tomter för varje delmängd med CD45,2 på en axel och CD45.1 på den andra. Identifiera donator (CD45.2 +), värd (CD45.1 + CD45.2 +) och konkurrent celler (CD45.1 +) för varje härstamning som visas. Det är normalt att ha några kvarvarande värdceller, särskilt i T-lymfocyter befolkningen ses i panel E. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Post-transplantation benmärg HSC analys mall. Inom enskilda celler väljer HSPCs och LSKs som visas för figur 2. Inom LSKs väljer CD150 + CD135- HSCs, CD150- CD135- multi stamceller (eller program för mikroprojekt) och CD150- CD135 + lymfatisk -primed MPPs (eller LMPPs). Andelen LMPPs är lägre efter transplantation än i icke-bestrålade möss. Rita 2D flödes cytometry tomter för varje delmängd med CD45.2 på en axel och CD45.1 på den andra. Identifiera donator, värd och konkurrent celler för varje subpopulation som visas. Om bestrålning och transplantation är framgångsrika, bör det finnas mycket få kvarvarande värd HSPCs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Representativa resultat för perifert blod chimerism. (A) Framgångsrik transplantation där donator HSCs är funktionellt likvärdiga med de konkurrerande celler. De allra flesta av de återstående värdceller (CD45.1 + CD45.2 +) är vanligtvis T-lymfocyter. (B) Framgångsrik transplantation där donator HSCs visa minskad funktion i jämförelse med konkurrerande celler. Detta minskade bidrag kan bero påflera olika faktorer och ytterligare analys kommer att behövas (se diskussion). (C) Misslyckad transplantation med låga frekvenser av både tävlande och givarceller och en stor andel av kvarvarande värdceller. Denna typ av resultat tyder på en lägre än väntat dos av strålning, misslyckade injektion (minskad celllivsduglighet, minskad volym av injektion, injektion utanför svansvenen), eller en kombination av dessa. Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här är utformad för att utvärdera den relativa lämplighet donator (test) HSCs mot kända konkurrenten HSCs. Den konkurrenssituation ökar den relativa känsligheten hos analysen (mer sannolikt att upptäcka måttliga sänkningar av stamcells kondition) och ger en intern teknisk kontroll för effekten av strålning och injektion. Det bör dock inte användas som ett absolut mått på HSC kondition, en minskning av konkurrens beredning innebär inte automatiskt att HSCs inte skulle klara sig bra i avsaknad av konkurrens. Även om det kan hävdas att en konkurrenskraftig miljö är bättre utgångspunkt, eftersom konkurrerande celler rädda defekt HSC funktion och alla mottagande möss kommer att överleva, bör man vara försiktig med tolkningen av resultaten. Bekräfta resulterar i en icke-konkurrenskraftig miljö stelnar slutsatserna.
Den experimentella designen presenteras här använder HSC motsvarande quantities av den totala benmärgsceller i stället för rena populationer av flödescytometri -sorted HSCs. Det är viktigt att utjämna antalet HSCs i alla populationer som studeras (olika givare, konkurrent) för att eliminera variationen mellan olika givare och se till att variationer i fenotypisk HSC frekvens inte tolkas som förändringar i HSC funktion 14. Fördelarna med den metod som beskrivs här över renade HSCs är: förbättrad cellviabilitet på grund av kortare handläggningstider och brist på yttre tryck under sortering; och förbättrad homing till mottagaren benmärg (närvaron av antikroppar på sorterade celler kan störa deras inympning i benmärgen 15). Omvänt är den största nackdelen bidraget från icke-HSC populationer till transplantationen resultatet, särskilt rollen av kortlivade progenitorceller vid tidiga tidpunkter efter transplantation. Om vidare behandling eller genetisk modifiering förändrar uttrycket av surface markörer som används för val av HSC: er 16, kan det finnas ett betydande antal HSC: er "i förklädnad" i ett prov men inte i en annan, vilket partiskhet resultaten. Emellertid kan samma problem även uppstå vid användning av renade HSCs och är kännetecknande för transplantation analysen.
De erhållna resultaten med hjälp av det nuvarande protokollet är endast kvalitativa på populationsnivå. Med andra ord kan en minskad bidraget av givarceller efter transplantation bero på; ett lägre antal funktionella HSCs i start befolkningen; en minskad förmåga av de enskilda HSC: er för att bosätta sig i benmärgen och expandera under de första dagarna och veckorna efter transplantation; eller problem med differentiering och tillväxt i mogna celler som används för detektion i periferin. Det är därför viktigt att inte använda resultaten från en konkurrenskraftig transplantation isolerat utan att komplettera dem med analyser som mäter celltillväxt, överlevnad och differentiering från HSC till cirkulerande blodkroppar. Det är också viktigt att jämföra donatorcellen bidrag mellan perifert blod (Figur 3) och benmärg (Figur 4) Närvaro av donatorhärledda HSCs i benmärgen i kombination med avsaknad av donatorceller i perifert blod skulle vara ett tecken på ett differentieringsblocket . Även om det inte visas i exemplet, är det även möjligt att bedöma erytroid rekonstituering baserade på olika isoformer av Gpi1 17. Med tanke på det stora antalet erytrocyter som förekommer i blodet, de utgör en mycket känslig metod för detektion för donatorhärledda celler, som kan vara särskilt användbart när omplantering lågt antal HSCs eller efter sin produktion under långa tidsperioder. I andra änden av spektrumet, myeloidceller är ofta de första att misslyckas detekteras, delvis på grund av deras låga frekvens i perifert blod och delvis på grund av deras korta halveringstid.
Det är möjligt att anpassa the konkurrenskraftig återinsättning analys för att möjliggöra kvantifiering av HSC: er med hjälp av begränsande utspädning analysen (eller LDA). Detta kommer att kräva en mycket större antal mottagande möss delas upp i flera olika grupper där varje grupp får ett annat förhållande av konkurrent: donatorceller, antingen sorterade eller osorterade som beskrivits ovan. Som antalet givarceller minskar, kommer det att finnas fler möss i vilka proportionen av donatorhärledda celler inte når den förutbestämda tröskeln i en eller flera härstamningar. Det är sedan möjligt att plotta frekvensen av "negativa" möss per grupp mot antalet transplanterade givarceller och bestämma frekvensen av HSC: er från den efterföljande graf 18,19.
Den föreslagna varaktigheten av post-transplantation uppföljning varierar i litteraturen. Det brukade vara säker konsensus där period av 16 veckor efter transplantation ansågs vara tillräcklig för att återspegla produktionen av långsiktiga HSCs. Den senaste tidens rapporter om "intermediate "HSCs vars funktion avtar strax efter 16 veckor har understrukit behovet av ännu mer noggrann utvärdering av HSC funktion 17. Det är visserligen möjligt att utvidga uppföljningen av transplantationsmottagare förbi 16 vecka tidpunkt för att tillfredsställa dessa problem. En alternativ, återigen med en utan tvekan högre känslighet, är den sekundära transplantation (Figur 1B), där benmärgsceller återhämtat sig från första transplanterade patienter injiceras bestrålade sekundära mottagare. den andra transplantation sätter ytterligare proliferativ press på HSCs, tvingar sin utgång från dvala och tillåter endast celler med robust självförnyelse att upprätthålla sin produktion. det är ibland fördelaktigt att använda sorterade givarceller för att bättre anpassa HSC nummer mellan olika prover för de sekundära transplantat. Alternativt är det möjligt att fastställa en bedömd förhållandet mellan givare : konkurrent HSCs från den primära benmärgs (t.ex.
Som nämnts ovan, det finns ett antal skäl till varför en viss population av donator HSCs kan visa minskad kapacitet för långsiktig beredning. Ett sådant skäl är möjligheten för HSC: er att migrera till benmärgen efter transplantationen (även kallad målsökande) och bosätta sig i benmärgen nisch. Det är möjligt att anpassa Protokollet presenteras här för att undersöka benmärgsmålsökande och kortsiktiga expansion. Det är nödvändigt att öka antalet transplanterade celler (motsvarande 5,000-10,000 HSCs förmålsökande analyser och 1,000-2,000 HSCs för analys inom den första veckan efter transplantation). I målsökande analysen är mottagande möss avlivas inom de första 16-24 h efter transplantation och antalet givare HSCs som har nått benmärgen bestäms enligt beskrivningen i det nuvarande protokollet. För att ytterligare utvärdera deras funktion, kan benmärgsceller som återvunnits från de kortsiktiga mottagare transplanteras till sekundära mottagare som förklaras i figur 1B. Andelen av givarhärledda celler i de sekundära mottagarna kan sedan användas för att utvärdera förmågan hos givaren HSCs att migrera och bosätta sig i den mottagande benmärgen.
De största problemen med konkurrensbenmärgstransplantation uppstår från strålning och injektion och presentera sig som antingen ökade efter transplantation dödlighet eller minskad upplösning effektivitet. Avdelade doser strålning, som presenteras här, vanligtvis förknippas med effektivare myeloablation ochmindre toxicitet jämfört med singeldos 20. Med den rekommenderade dosen här (två gånger 450 rad), är myeloid och B lymfoida populationer effektivt bort men resterande T-lymfocyter göra kvar (Figur 3). Om det finns någon anledning att misstänka avstötning av transplantat (givare och mottagare möss från olika genetisk bakgrund), en högre dos av strålning (två doser av 550-600 rad) och en kortare fördröjning mellan de två doserna (4 tim i stället för följande dag ) bör bidra till att undanröja kvarvarande T-lymfocyter och minska risken för graft fel på grund av avslag. Felaktig injektion eller injektion i perivaskulära utrymmet i stället för svansvenen, kommer problem med donator cellviabilitet eller förorening donatorcellen på grund av bristande omsorg under provberedning också öka misslyckande transplantat och efter transplantation dödlighet. Ineffektiv strålning (på grund av tekniska problem, till exempel) kommer att resultera i minskad upplösning effektivitet, men bör inte öka mortality. I alla dessa situationer, förekomsten av konkurrerande celler i analysen bidrar till att dissociera tekniska problem (som beskrivs här) från en bona fide minskning av givare HSC funktion som konkurrerande celler bör alltid kunna återskapa det bestrålade mottagare. Immundefekta värdar kan också användas, till exempel för att minska behovet av strålning och / eller risk för avstötning, och utvärdera funktionen av humant HSCs 21-23.
Avslutningsvis presenterar vi här en konkurrenskraftig transplantation protokoll som kan anpassas för flera olika användningsområden som beskrivs i diskussionen. Vår strategi använder HSC motsvarigheter, vilket minskar handläggningstider och samtidigt förbättrar cellviabiliteten i transplantatet jämfört med cellsortering. Det är också en praktisk lösning när tillgång till en cellsorterare är begränsad, och kräver färre möss jämfört med den kvantitativa LDA analysen, vilket gör det till en attraktiv utgångspunkt för analys av HSC funktion. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Roxann Hetu-Arbour för att få hjälp med siffran utformning och demonstration av förfarandena. Forskning i labbet stöddes av en övergångs utmärkelse från Cole Foundation, Discovery bevilja nr. 419226-2012 från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) och Kanada Foundation for Innovation (CFI ledare fonden bevilja nr. 31377). KMH är en Chercheur-Boursier Junior för Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| 20 G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | |
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μg/ml |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μg/ml |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μg/ml |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μg/ml |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μg/ml |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μg/ml |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 56149 | 0.5 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0.25 μg/ml |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 558162 | 0.25 μg/ml |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μg/ml |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0.625 μg/ml BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1 ml tuberculin syringe with 27 G needle | BD Syringe | 309623 | |
| 1 ml tuberculin syringe with 25 G needle | BD Syringe | 309626 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 |
References
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
