Introduction
조혈 부상 방사선 및 세포 사멸을 통해 손실 된 혈액 세포의 보충을 보장하는 재생 방법이다. 이 과정은 주로 성인 골수에있는 조혈 줄기 세포 (HSC)에 의해 보장된다. 또한, 조혈 줄기 세포는자가 면역 질환, 혈액 학적 악성 종양과 immunodeficiencies 1 치료 목적을 위해 사용될 수있다. 더 잘 증식 팽창 도달 이식 후 수신자 골수 생착 할 수있는 능력을 포함하여, HSC 기능을 조절하는 메카니즘을 이해하기위한 요구가있다. 최근의 연구는 전향 적으로 약 50 % 순도 2-4로 성인 조혈 모세포와 태아의 조혈 모세포를 풍부하게 할 수있는 SLAM의 가족 CD150과 CD48 등 여러 가지 세포 표면 마커를보고 있지만, 기능 조혈 모세포의 황금 표준 측정에 대한 생체 다시 채우기 분석 유지 혈액 C를 재 구축하는 능력을 결정조사 된 호스트 (5)의 엘 생산.
생체 내 클론을 다시 채우는 분석은 처음 틸과 맥 컬록 (6)에 의해 개발 된 이후 세련되고 확장되었습니다. 원래 정의 된 조혈 모세포는자가 재생과 분화를 통해 평생 혈액 세포의 생산을 보장합니다. 조사 된받는 사람에 조혈 모세포의 전송 따라서 우리가 평가할 수 있습니다 : 다른 혈액 세포 계통의 분석을 통해 (T 림프구, B 림프구, 과립구, 단구) 및 직렬 이식을 통해 자기 갱신 능력을 차별화 할 수있는 능력. 상기 분석은 일반적으로 조혈 두 집단의 기능 및 / 또는 양의 비교를 포함하는 것, 예를 들어, 치료 또는 조혈 모세포의 유지 또는 확장에 영향을 줄 수있는 다른 요인들과 미처리 된 다른 유전자형 또는 셀 개의 마우스로부터 오는 세포 문화입니다. 기증자 키메라, 또는 전송 기증자의 조혈 모세포의 t의 기여O 혈액 세포 생산 후 세포 표면 마커 또는 수신자 또는 호스트에서 공여 세포를 구별 할 다른 방법을 이용하여 말초 혈액의 유동 세포 계측법 분석 골수에 의해 결정될 수있다. 가장 널리 사용되는 마커는 확실히 우리가 아래의 예에 대해 선택한 유전자 Ptprc 또는 CD45 백혈구 항원 (7)의 두 대립 유전자이다.
클론 다시 채우기 분석은 경쟁 또는 비 경쟁이 될 수 있습니다. 비경쟁 설정에서, 제어 및 테스트 조혈 별도받는 마우스에 전달되고, 각각의 셀 유형의 결과는 서로 독립적 일 것이다. 경쟁 설정에서 테스트 및 제어 모두 조혈 모세포의 기능은 경쟁 조혈 모세포의 인구에 대해 측정된다. 여기에 설명 된 프로토콜 경쟁 설정을 사용뿐만 아니라 비경쟁 상황에 적응 될 수있다. 두 방법은 자신의 장점과 한계를 가지고, 우리는에서 자세히를 비교합니다토론. 우리는 또한 이식 된 조혈 모세포의 수의 주식을 보장하기 위해 다른 방법을 설명, 희석 분석 (LDA)을 제한함으로써 조혈 모세포의 정량 분석을 적용, 결과의 해석에 대한 성공 및 실패 이식 모두의 예제를 제공하는 방법에 대해 설명합니다.
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Protocol
이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 기관의 동물 윤리위원회의 승인 및 동물 관리 지침에 캐나다 협의회를 수행하고있다.
주 : 멸균 / 무균 하우징 상태를 유지하기 위해 생물학적 안전 캐비넷 또는 층류 후드 안쪽 살아있는 쥐의 직접 처리를 포함하는 모든 절차를 수행. 청소 또는 소독 케이지, 억제 장치, 주택 자재, 적절하게 동물에 제공 차우와 물. 주사를위한 혈액 채취에 대해서만 멸균, 일회용 바늘을 사용합니다. 무균 기법 그래프트의 제조시 매우 중요하다.
받는 사람 마우스 1. 준비
- 시간이 지남에 말초 혈액 및 골수 재구성의 개별 추시 수 있도록 귀 노치 (또는 지역 동물 윤리위원회 (8)에 의해 승인 된 다른 방법)와받는 사람 마우스를 식별합니다. 이식 후 추적 관찰을 위해 마우스의 무게를. 우리(이하 25g) 7 내지 12 주 오래 된 전자받는 사람 마우스.
참고 : 제공된 예에서, CD45.1 + CD45.2 +받는 사람 마우스 congenic B6.SJL 마우스와 C57BL / 6 마우스를 건너 집에서 사육 하였다. - 조혈 활동을 파괴하는 450 방사선의 두 가지 용량으로받는 사람 쥐를 조사. 첫 번째 투여 량을 이식 전날과 이식 전에 두 번째 1-2 시간을 제공합니다.
주 : X 선 또는 감마선 모두 해당 시설의 이용에 따라 이용 될 수있다.
도너와 경쟁 골수 세포의 제조 2
- 기증자 (테스트 및 제어, CD45.2의 +) 안락사와 경쟁 (CD45.1 +; B6.SJL) 자궁 경부 전위 또는 로컬 동물 윤리위원회의 승인 방법을 사용하여 다음 CO 2 질식하여 마우스.
- 빈 페트리 접시 또는 멸균 거즈에 활짝 열려 그 뒤로, 다리에 마우스를 놓고 난 (청소 작업 표면을 유지)생물 안전 캐비닛을 nside. 70 % 에탄올 / 30 % H와 모피 젖은 2 O (v / v)로.
- 수술 날 또는 날카로운 가위로 발을 잘라. 다리를 따라 피부를 열고 톱니 모양의 집게를 사용하여 피부를 멀리 당겨 잘라. 여분의 근육을 버려야.
- 다리 뼈 당기고 반력와 골반 뼈에 대해 가위의 블레이드를 이용하여 대퇴골 탈구. 경골을 분리하고, 슬개골에서 대퇴골과 근육과 힘줄의 나머지 비트를 제거합니다. 6 웰 조직 배양 플레이트에 2-3 ml의 무균 인산염 완충 식염수 (PBS)에 뼈를 놓는다.
- 멸균 PBS 5 mL로 세척하여 뼈 골수 세포를 수집한다.
- 집게로 부드럽게 뼈를 잡고 뼈의 한쪽 끝으로 채워진 1 ML의 주사기에 부착 된 25 G 바늘을 삽입합니다. 플런저를 누르고 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 수집합니다. 뼈의 중심이 흰색이 될 때까지 필요에 따라 반복합니다.
- 바늘로 통과 반복하여 세포를 해리단일 세포 현탁액을 얻었다. 거품과 과잉 힘을 피하십시오. 참고 :이 단계에서 세포 생존을 개선하기 위해 약간 더 큰 바늘 (22 G)를 사용합니다.
- 균일 한 세포 현탁액을 보장하고 파편과 덩어리를 제거하기 위해 70 μm의 나일론 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다.
- 혈구를 사용하여 세포 계수에 대한 나누어지는을 제거합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 200 XG에서 나머지 세포 현탁액을 원심 분리기. 멸균 PBS (108 세포 / ml)에 필요한 세포 밀도를 재조정. 얼음에 세포를 유지합니다.
3. 기증자 세포 HSC의 등가물 구축
- 염색 유동 세포 계측법에 대한 바닥 폴리스티렌 튜브 라운드 5 ml의에 3 × 10 6 세포 (30 μL)의 등가을 전송합니다. (2.5 μg / ML의 최종 농도를 위해 (PBS, 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 1 mM의 EDTA로 보충) 염색 완충액에 희석), 비특이적 염색을 차단 CD16 / CD32에 대해 표지 된 항체의 동일 부피를 추가한다. RT에서 5 분을 품어.
- 염색 버퍼에 준비 90 μL의 형광 색소 - 복합 항체 마스터 믹스를 추가 바이오틴 리니지 칵테일 (B220, CD3e, CD11b를, GR1, Ter119), SCA1, CD117, CD135, CD150. 빛으로부터 보호 된 30 분 동안 빙상에서 인큐베이션.
참고 : 적절한 희석 항체의 각 로트에 대해 결정해야한다. 본 연구에 사용 된 희석에 대한 재료의 표를 참조하십시오. - 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 200 XG에서 세포, 소용돌이와 원심 분리기에 2 ml의 얼룩 버퍼를 추가합니다. 쓸어 넘겨 뜨는에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다.
- 염색 버퍼에 희석하여 10 μL의 형광 색소 접합 된 스트렙 타비 딘 추가 (재료 표 참조). 빛으로부터 보호 된 20 분 동안 빙상에서 인큐베이션. 언 바운드 스트렙 타비 딘을 제거하는 단계 3.3로 씻으십시오.
- 적어도 6 검출기 (9) 플로우 사이토 미터를 이용하여 세포 샘플을 수집. 린의 주파수를 결정 - SCA1 + CD117 + CD135 - CD150
그림 2와 같이 이전에 10, 11를보고했다.
참고 : 그 인구 내에서 기능 조혈 모세포의 주파수가 1/3과 1/5 2,12 사이에서 추정 할 수있다. - (일반적으로,이 예에서 경쟁, B6.SJL CD45.1 +) 기준으로 아래의 그림 2에 설명 된대로 하나의 샘플을 사용하여, 모든 샘플 (11)에 대해 추정 HSC 등가물을 설정합니다.
- 다음 식을 사용하여 필요한 세포의 수를 계산한다 :
#transplanted 조혈 모세포 /받는 사람 = 5 × 10 5 세포의 X 추정 HSC 주파수 (기준 샘플의 결정에 따라,이 수는 야생형 C57BL / 6 마우스에 대해 일반적으로 75 내지 125이다) 10-12.
참고 :도 2에서, 샘플 A의 결과는 조혈 모세포 (139)이다.
(다른 샘플도 2의 예를 들어 샘플 B) 총 # 이식 된 세포 = # 트랜스심은 조혈 모세포 / HSC 주파수.
참고 :도 2에서의 샘플 B에 대해, 결과는 197,826 (또는 대략 2 × 10 5) 전체 골수 세포이다.
- 다음 식을 사용하여 필요한 세포의 수를 계산한다 :
- 상기에서 얻어진 결과를 사용하여 각 시료에 대하여 그래프트 수신자 당 필요한 세포의 총 수를 계산한다.
참고 :이 숫자는 기준 시료 (경쟁) 5 × 10 5해야한다.- 받는 사람 마우스의 숫자로 단계 3.7에서 얻은 수를 곱과 주사기에 죽은 볼륨을 보상하기 위해 적어도 두 개의 추가 마우스에 대한 충분한 세포를 추가합니다.
- 단계 3.6에서 계산 및 멸균 PBS를 사용하여 주입 당 200 μL의 최종 볼륨을 조정으로 1 HSC 동등한 비율 (예를 들어, CD45.1 +) 선수와 1 시험 셀 (CD45.2의 +)를 섞는다.
주 : 다섯받는 마우스의 그룹 제안 볼륨 따라서 3.5 × 106 경쟁 골수 세포를 포함하는 적어도 1.4 ㎖, 수 (또는 것이기도 2의 973 샘플 A)에 대한 추정 된 조혈 모세포 및 시험 셀의 등가 수는 (도 2에서의 샘플 B에 대한 당량) 197826 365 = 1,384,782 골수 세포 일 것이다.
4. 골수 이식
- 혈관의 팽창을 보장하고 측면 꼬리 정맥 자세히 볼 수 있도록 적색 가열 램프와 단계 1.2 조사받는 마우스 워밍업.
- 27 G 바늘 (이하)가 장착 된 1 ML의 투베르쿨린 주사기를 준비합니다. 대기음 (3받는 마우스 대) 준비한 세포 현탁액 750 μL. 주사기에 기포가 없는지 확인합니다.
- 금지 장치에 마우스를 넣습니다. 꼬리를 검사하고 꼬리의 양쪽에 명확하게 볼 수 있어야 측면 꼬리 정맥을 찾습니다. 에탄올 주사 부위를 닦아주십시오. 최대 베벨 바늘을 삽입 피부에 평행 부드럽게 플런저를 누릅니다. 주입이 용이해야한다. 힘 재이면quired는, 바늘이 혈관에 있지 않습니다.
참고 : 이전 마우스는 정맥을 더욱 어렵게 발견 할 수 있습니다 두꺼운 피부를 가지고있다. 바늘이 혈관에없는 경우, 초기 주입 부위에 바늘을 다시 삽입 근위. - 바늘을 제거하고 출혈을 멈추게하기 위해 몇 초간 멸균 거즈로 주사 부위를 누르십시오. 깨끗한 케이지에 마우스를 전송합니다.
참고 : 바늘이 너무 무딘 될 수있는 후 3 주사, 동일한 주사기와 바늘을 사용합니다. - 이식 후 후속 처리를 위해, 제 5 일 동안 마우스를 재수 멸균 PBS 1 ml를 피하 주사. (; 옵션 필요한 경우) 감염을 방지하기 위해 마시는 물에 항생제를 추가합니다. 제 3 주 동안 매 2 ~ 3 일 마우스 체중 이상 15~20% 그들의 미리 이식 체중 손실 (또는 로컬 동물 윤리위원회에 의해 결정) 한 마우스를 안락사.
주변 혈액 5. 분석
- 혈액 한 방울을 수집 (Approx. EDTA 튜브에 50 ~ 100 μL).
- 하악 정맥에서 혈액을 수집하려면, 턱뼈 아래에있는 털이 지점 근처에 얼굴 피부를 관통하고 피 (13)의 드롭을받을 수집 관을 배치 란셋 또는 22 G 바늘을 사용합니다. 멀티 혈통의 재구성을 따라 이식 후 4, 8, 12, 16 주에 혈액을 수집합니다.
- 단계 5.1.1에서 수집 된 혈액의 드롭에 1 ml의 갓 준비 RT 적혈구 용해 버퍼 (9 부 0.16 M NH 4 CL + 1 일부 0.17 M 트리스 - 염산의 pH 7.65)를 추가합니다. 5 ml의 유동 세포 계측법에 적합한 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브를 혼합 및 전송 샘플. 실온에서 4 분 동안 서 보자.
- 얼음처럼 차가운 PBS의 4 볼륨을 추가합니다. 엔드 - 투 - 엔드를 돌려 혼합하고 얼음에 즉시 전송합니다. 4 ° C에서 200 XG에 원심 분리기 10 분.
- 쓸어 넘겨 뜨는에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다. 상층 액을 명확하고 빨간색이어야한다. 간단히 버퍼와 소용돌이를 염색 2 ML을 추가합니다. 200 XGA 원심 분리기 5 분t 4 ° C를.
- 쓸어 넘겨 뜨는에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다.
- CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1 : 단계 3.3-3.1에 설명 된 일반 프로토콜을 사용하여 염색 유동 세포 계측법 다음과 같은 마스터 믹스에 대한 항체를 진행합니다.
- 적어도 6 검출기 (9) 플로우 사이토 미터를 이용하여 세포 샘플을 수집. 그림 3에서 제공하는 분석 템플릿을 사용하여 각 샘플의 각 계통 (CD19 + B 림프구, CD3e + T 림프구, GR1 밝은 과립구) 및 10, 11을 발표 같은 기증자 유래 세포의 주파수를 결정합니다.
골수에서 재구성 6. 분석
- 섹션 2. 얼룩의 마스터 믹스 단계 3.3-3.1에 설명 된 일반 프로토콜을 사용하여 유동 세포 계측법 분석을위한 세포 다음과 같은 항체를 설명하는대로 골수 세포를 수집 리니지 칵테일, SCA1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. 린 감지단계 3.4에 기술 된 바와 같이, 형광 접합 된 스트렙 타비 딘을 사용하여 eage 칵테일 항체.
- 적어도 8 검출기 (9) 플로우 사이토 미터를 이용하여 세포 샘플을 수집. 여섯 명 밖에 사용할 수있는 경우 CD135 + 세포가 제외되는 바와 같이, 혈통 패널과 동일한 채널에 CD135을 추가합니다. 기증자 파생 린의 주파수를 결정 - SCA1 + CD117 + CD135 - 그림 4와 10을 발표 제공 분석 템플릿을 사용하여 각 샘플에서 CD150 + 조혈 모세포.
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Representative Results
(이하에서 논의 됨) 이차 이식을 포함하는 경쟁 이식 환경의 일반적인 설명은도 1에서 볼 수있다. 이식 전 골수 조혈하는 대표적인 분석은도 2에서 확인할 수있다.보다 상세한 정보를 이중선의 배제와 죽은 세포는 다른 9 찾을 수있다.
도 3 및도 4는 각각의 말초 혈액 및 골수 분석 유세포 템플릿의 예를 제공하는 도면. 이는 일부 호스트 T 림프구를 검출하는 정상 (모든 T 세포의 20 %까지,도 3b), T 세포가 다수의 무선 내성 같다. 경쟁자 유래 세포는 세 가지 계통에 존재해야한다. 검출 한계는 분석 취득한 총 셀의 개수에 많이 의존하지만 내 20,000 세포의 경험에서 총하나의 백혈구 게이트는 일반적으로 충분합니다. (도 3에 도시 한 바와 같이 B의 림프구, T의 림프계 나 골수) 도너 세포가 특정 계보의 컷오프보다 낮은 비율을 나타내는 경우, 마우스가 multilineage 재구성 양성으로 간주되지 않으며, 1 % 또는 0.5 %의 임의의 임계 값을 사용하여 . 경쟁 이식이 토론에서 설명한 바와 같이 기증자의 조혈 모세포를 정량화하기 위해 제한 희석 분석과 결합 될 때이 개념은 중요합니다. 예를 들어, 공여체 유래의 T 및 B 림프구하지만 보통 일시적 재구성을 제안 골수 세포의 점진적인 손실을 갖도록 확실히 가능하다. 림프구는 골수 세포보다 긴 반감기 (특히 Gr1hi SSChi의 과립구 / 호중구)가 심지어 골수의 부재 조혈 모세포 (10)에 유지할 수 있습니다.
그림 5는 다른 현장에서 말초 혈액 키메라에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다관리 포인트. 기증자의 조혈 모세포가 경쟁 세포에 기능적으로 동일 경우, 기증자 (CD45.2의 +)과 경쟁 (CD45.1의 +)의 비율 유래 세포는 등가 (그림 5A)입니다. 그들은 더 전파 저항성으로도 5a 및도 5b의 잔류 숙주 세포 (CD45.1 + CD45.2 +)은 거의 독점적으로 T 림프구이다. 공여 세포는 말초 혈 백혈구 (도 5b)의 더 낮은 비율을 제시 할 때, HSC 함수의 몇몇 양태는 결함 가능성 상기 논의 된 바와 같이 더 많은 연구가 필요하다. 경쟁 세포의 존재는 분석이 잘 작동하지만 공여자 골수 단순히 덜 효과적임을 확인한다. 이것은 모두 도너와 경쟁 세포 수 및 숙주 세포 로우에 존재하는 말초 혈액 세포의 대부분을 나타내는도 5c에 제시된 결과와 대조된다. 이 경우 이식 실패하고 난이었다t는 경쟁 세포에 비해 기증자의 상대적 기능에 대한 어떠한 결론을 도출 할 수 없습니다. 다른 솔루션은 더 아래에 설명되어 있습니다.
. 공여 마우스의 그림 1. 실험 설계 경쟁 이식 (A), 골수 세포 (CD45.2 +; C57BL6 배경, 제어 및 시험) 및 경쟁 congenic 마우스 (CD45.1 +; B6.SJL)을 혼합한다 1 : 1 비를 조사받는 마우스의 꼬리 정맥에 주입은 (+ CD45.1 CD45.2 +는, C57BL6의 자손은 F1 B6.SJL 번식 쌍 X). 골수 재구성의 효능은 4, 8, 12, 16주에 이식 후 16 주째 골수 이식 후 또는 그 이후에 말초 혈 (PB)에서 결정된다. (B) 또한 이식 된 세포의자가 재생을 평가하기 위해, 봉16주 후 이식에서 회복 전자 골수 세포를 조사 보조받는 사람 마우스로 전송할 수 있습니다. HSC, 조혈 줄기 세포; MPP, 다 능성 전구 세포; LMPP, 림프-준비하는 MPP는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 사전 이식 골수 HSC 분석 템플릿. 단일 세포 내에서 cKit (CD117)와 리니지 식에 따라 HSPCs 선택합니다. 린 희미 / 내 - 세포 인구의 cKit 밝은 SCA1 + 인구 (LSK)을 선택합니다. 조혈 모세포 - LSKs 내에서 CD150 + CD135을 선택합니다. 이 인구 집단이 될 것이다 내의 조혈 모세포 (a 다시 채우는 셀의 주파수를 다시 채우기 장단기 모두 포함트윈 1/3 및 1/5). 골수 조혈 모세포의 추정 주파수는 단일 세포 게이트 사건의 수에 의해 HSC 게이트에서 이벤트의 수를 나누어 계산한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 이식 후 말초 혈액 분석 템플릿입니다. (A) 단일 세포 내에서 먼저 GR1 밝은 SSC 안녕하세요 과립구를 선택합니다. B 림프구와 CD3e + CD19 - - T 림프구 (B) 다음 CD19 + CD3e을 선택합니다. 마우스 말초 혈액 B 림프구의 주요 세포 종류 (약 50 %의 모든 말초 혈액 세포) 인 상태 림프구의 큰 비율을 포함한다. CE) CD4 각 부분 집합에 대한 플롯 세포 계측법 2D 흐름을 그리기다른 하나 축과 CD45.1 5.2. 그림과 같이 기증자 (CD45.2의 +), 호스트 (CD45.1 + CD45.2 +) 및 각 계통에 대한 경쟁 세포 (CD45.1의 +)를 식별합니다. 이 패널에서 볼 수 있듯이 특히 T 림프구 인구에 일부 남아있는 숙주 세포를 가지고 정상 E. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 이식 후 골수 HSC 분석 템플릿입니다. LSKs 내 그림 2에 대한 그림과 같이 하나의 셀을 선택 HSPCs 및 LSKs 내에서 선택 CD150 + CD135- 조혈 모세포, CD150- CD135- 다 능성 전구 세포 (또는 MPP들) 및 CD150- CD135 + 림프 -primed MPP들 (또는 LMPPs). LMPPs의 비율은 비 조사 생쥐보다 이식 후 낮다. 2D 흐름 C 그리기다른 하나 축과 CD45.1에 CD45.2 각 부분 집합에 대한 플롯을 ytometry. 그림과 같이 각각의 하위 집단에 대한 기증자, 호스트 및 경쟁 세포를 식별합니다. 조사 및 이식이 성공하면 거의 남아있는 호스트 HSPCs이 있어야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
말초 혈액 키메라 그림 5. 대표 결과. (A) 성공적인 이식 기증자의 조혈 모세포가 기능적으로 경쟁 세포에 해당합니다. 잔여 숙주 세포의 대부분 (+ CD45.1 CD45.2 +)이 주로 T 림프구이다. (B) 경쟁 세포에 비해 공여자 조혈 쇼 기능을 감소 성공적인 이식. 이 감소 기여에 기인 할 수있다여러 가지 요인과 추가 분석은 (설명 참조) 필요합니다. (C)과 경쟁 도너 세포 잔여 숙주 세포의 큰 비율을 모두 저주파수로 이식 실패. 따라서이 유형의 실패 주입 (꼬리 정맥 외부에서 주입, 세포 생존을 감소 주입 부피 감소) 조사 예상 투여 량보다 낮은 제안 또는 이들의 조합을 포함한다. 이 도면의 확대를 보려면 여기를 클릭하세요 .
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 알려진 경쟁 조혈 모세포에 대한 기증자 (테스트) 조혈 모세포의 상대적 적합성을 평가하기 위해 설계되었습니다. 경쟁 상황 (줄기 세포 니스 완만 저하를 검출 할 가능성) 분석의 상대 감도를 높이고 조사 주입의 효능에 대한 내부 기술적 인 제어를 제공한다. 그러나, HSC 적당의 절대 측정으로서 사용되어서는 안된다; 경쟁 재구성 감소 자동 조혈 경쟁의 부재 하에서도 수행하지 않을 것을 의미하는 것은 아니다. 이 경쟁 설정 나은 시작점 참가자 세포 생존 할 결함 HSC 기능 및 모든 수신자 마우스 구출 같이,라고 주장 될 수 있지만, 하나는 결과의 해석에주의해야한다. 비 경쟁 환경에서 결과를 확인하는 것은 결론을 공고히 할 것이다.
여기에 제시된 실험 설계는 HSC 상당의 한때를 사용전체 골수 세포의 antities 대신 -sorted 조혈 유세포 순수한 집단. 다른 기증자 사이의 변동성을 제거하고 표현형 HSC 주파수의 변화가 HSC 기능 (14)에 변경하는 것으로 해석되지 않도록하기 위해 연구 (다른 기증자, 경쟁) 아래에있는 모든 집단에서 조혈 모세포의 수를 동일하게하는 것이 중요하다. 정제 된 조혈 모세포를 통해 여기에 설명 된 방법의 장점은 다음과 같습니다 개선 된 세포 생존 능력으로 인해 단축 된 처리 시간 및 정렬시 외부 압력의 부족; 수신자 골수에 개선 호밍 (정렬 세포에 대한 항체의 존재는 골수 (15)에서의 생착을 방해 할 수있다). 반대로, 주요 단점은 이식의 결과로 비 HSC 인구의 기여도, 이식 후 이른 시점에서 단명 전구 세포, 특히 역할이다. 또한, 치료 또는 유전자 변형 SURFAC의 발현을 변경하면조혈 모세포 (16)의 선택에 사용되는 전자 마커가있는 것 바이어스 결과, 하나의 샘플에 있지만 다른에 "변장"조혈 모세포의 상당수가있을 수 있습니다. 정제 된 조혈 모세포를 이용하여 이식 분석에 내재 때, 동일한 문제가 발생할 수있다.
본 프로토콜을 사용하여 얻어진 결과 집단 수준에서 질적이다. 즉, 도너 이식 후 세포의 감소로 인한 기여 수; 시작 인구의 기능 조혈 모세포의 낮은 숫자; 골수에 정착하고 이식 후 첫 일 주간에 확장 할 수있는 개인 조혈 모세포의 감소 능력; 또는 주변에 검출에 사용되는 성숙한 세포로의 분화와 성장 문제. 이는 분리의 경쟁력 이식의 결과를 사용하지하지만 H에서 세포 증식, 생존 및 분화를 측정 할 세이로 보완하는 것이 중요혈액 세포를 순환하는 SC. 이는 말초 혈액에서 공여 세포의 부재와 함께 골수 공여자 유래 조혈 모세포의 존재가 분화 블록 나타내는 것 또한 말초 혈 (도 3), 골수 (도 4) 사이에 도너 셀 기여를 비교하는 것이 중요 . 실시 예에 도시되지는 않았지만, 돌려 GPI1 (17)의 다른 아형에 기초 적혈구 재구성을 평가하는 것도 가능하다. 혈액에 존재하는 적혈구의 많은 수를 감안할 때, 그들은 조혈 모세포의 낮은 번호를 이식 또는 오랜 기간에 걸쳐 출력을 다음과 같은 경우에 특히 유용 할 수 있습니다 기증자 유래 세포, 탐지의 매우 민감한 방법을 나타냅니다. 스펙트럼의 다른 쪽 단부에서, 골수 세포는 종종 때문에 그들의 짧은 반감기의 말초 혈액에서 부분적으로 낮은 주파수의 부분에서 검출되는 실패 제들이다.
이 일을 적용 할 수있다전자 경쟁력을 다시 채우기 분석은 제한 희석 분석 (또는 LDA)을 사용하여 조혈 모세포의 정량화를 허용합니다. 정렬 또는 정렬되지 않은 상기 한 바와 같이 어느 도너 셀이 여러 다른 각 그룹 참가자들의 상이한 비율을 수신하는 그룹으로 나누어받는 마우스의 훨씬 더 큰 수를 필요로한다. 공여 세포의 수가 감소하면, 도너 세포 유래의 비율은 하나 또는 여러 개의 계통에 미리 설정된 임계 값에 도달하지 않는 더 많은 마우스가있을 것이다. 이는 이식 된 공여 세포의 수에 대한 그룹당 "네거티브"쥐의 주파수를 플롯 및 계속되는 그래프 18,19 조혈 모세포에서의 주파수를 결정하는 것이 가능하다.
이식 후 추적 관찰의 권장 기간은 문헌에 따라 다릅니다. 이식 후 16주 기간이 장기간 조혈 모세포의 출력을 반영하기에 충분한 것으로 간주 된 특정한 합의있을 사용. 내가 "의 그러나, 최근의 보고서그 기능 부 (16) 주의 필요성을 강조했다 직후 감소 ntermediate "조혈 모세포는 HSC 기능 (17)의 더욱 엄격한 평가합니다. 이러한 우려를 충족하기 위해 16 주 시점을지나 이식받는 사람의 추적을 확장 확실히 가능하다. 한 번 더 틀림없이 더 높은 감도 다른 옵션은, 골수 세포가 조사 보조받는 사람에 주입 처음 이식에서 회복 보조 이식 (그림 1B)입니다. 두 번째 이식은 자신의 종료를 강제로 조혈 모세포에 추가 증식 압력을 넣 더 나은 이차 이식 상이한 샘플 사이 HSC 번호를 조정 정렬 된 공여체 세포를 사용하는 것이 때로는 바람직하다 휴면 및 출력을 유지하기 위해 강력한 자기 갱신 만 셀을 허용한다.. 대안 적으로, 도너의 예상 비율을 설정할 수있다 : 기본 골수에서 경쟁 조혈 모세포 (예를 들어,
전술 한 바와 같이, 공여체 조혈 주어진 모집단 보여줄 수있는 이유에 대한 이유로 장기 재구성 용량 감소가있다. 그러한 이유는 이식 (또한 원점 복귀) 후 골수로 마이그레이션 및 골수 틈새에서 자신을 해결하기 위해 조혈 모세포의 기능입니다. 이는 골수 유도 단기 확장을 조사하는 여기에 제시된 프로토콜을 적용 할 수있다. 이는 이식 된 세포의 수 (5,000-10,000 조혈 모세포의 등가물을 증가시킬 필요가있다원점 복귀 분석 및 이식 후 첫 주 이내에 분석을위한 1,000-2,000 조혈 모세포). 원점 복귀 분석에서,받는 사람 마우스는 이식 후 첫 16-24 시간 및 본 프로토콜의 설명에 따라 결정되는 골수에 도달 한 기증자의 조혈 모세포의 수 내에서 안락사있다. 도 1b에서 설명한 바와 같이 상기 그 기능을 평가하기 위해, 단기 수신자로부터 회수 된 골수 세포를 이식받는 보조 할 수있다. 보조받는에서 도너 유래 세포의 비율은 이전 수신자 골수에 정착 공여자 조혈 모세포의 능력을 평가하는 데 사용될 수있다.
경쟁 골수 이식과 주요 문제는 조사 및 사출에서 발생하고 어느 증가 이식 후 사망률로 자신을 소개하거나 재구성 효율을 감소. 여기에 제시된 바와 같이 분할 투여 량 조사는, 일반적으로 더 효율적 myeloablation와 연관되고단일 용량 (20)에 비해 적은 독성. 용량은 (두 번 450 래드) 여기 추천으로, 골수와 B 림프 인구를 효율적으로 삭제하지만 잔류 T 림프구 (그림 3)을 유지 할 수 있습니다. 이식 거부 (다른 유전 적 배경을 가진 기증자와받는 사람 마우스), 조사의 높은 용량 (550-600 래드의 두 가지 용량) 두 복용 사이의 짧은 지연 시간 (4 시간 대신 다음과 같은 일을 의심 할 이유가있는 경우 ) 잔류 T 림프구를 제거하는 데 도움이 거부 반응에 의한 이식 실패의 가능성을 감소해야한다. 혈관 주위 공간 대신에 꼬리 정맥 내로 잘못 주사 또는 주입, 샘플 준비 동안 적절한주의 부족 도너 세포 생존 또는 도너 세포 오염의 문제는 또한 이식 실패 및 이식 후 사망률을 증가시킬 것이다. (예를 들어, 기술적 문제로 인해) 비효율적 조사 감소 재구성의 효율성을 초래할 것이지만 MO 증가 안된다rtality. 경쟁사 세포는 항상 조사받는 사람을 재구성 할 수 있어야로 기증자 HSC 기능의 선의의 감소에서 (여기에 설명 된대로)이 모든 상황에서, 분석에서 경쟁 세포의 존재는 기술적 인 문제를 해리하는 데 도움이됩니다. 면역 결핍 호스트는 또한 방사선 및 / 또는 이식 거부 반응의 위험에 대한 필요성을 감소시키는, 인간 조혈 21-23의 기능을 평가하는데 사용될 수있다.
결론적으로, 우리는 여기에 설명에 설명 된대로 여러 가지 용도에 적용 할 수있는 경쟁력있는 이식 프로토콜을 제시한다. 우리의 방법은 처리 시간을 감소시키고 세포 분류와 비교할 때 동시에 이식 세포의 생존 능력을 향상하는 HSC 당량을 사용한다. 셀 소터에 대한 액세스가 제한되고 HSC 함수의 분석을 위해 그것을 매력적인 출발점하게 정량적 LDA 분석법에 비해 적은 수의 쥐가 필요할 때 또한 실용적인 해결책이다. </ P>
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Acknowledgments
우리는 절차의 그림 디자인 및 데모와 지원을 Roxann Hétu - 아버에 감사하고 있습니다. 실험실에서 연구가 콜 재단에서 전환 수상에 의해 지원되었다, 검색없이 부여합니다. 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회 및 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI 지도자 기금 없음. 31377 부여) 419226-2012. 상테 (FRQS) - KMH는 퐁 드 공들인 뒤 퀘벡에 대한 Chercheur - Boursier 주니어입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| 20 G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | |
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μg/ml |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μg/ml |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μg/ml |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μg/ml |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μg/ml |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μg/ml |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 56149 | 0.5 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0.25 μg/ml |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 558162 | 0.25 μg/ml |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μg/ml |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0.625 μg/ml BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1 ml tuberculin syringe with 27 G needle | BD Syringe | 309623 | |
| 1 ml tuberculin syringe with 25 G needle | BD Syringe | 309626 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 |
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