Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

فيوجن بوساطة كمين لواحدة Proteoliposomes مع طبقات ثنائية المدعومة المربوطة في خلية ميكروفلويديك تدفق رصدت من قبل المستقطبة TIRF المجهري

Published: August 24, 2016 doi: 10.3791/54349
Automatic Translation
1,2, 1,2,3,4
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine, 2Nanobiology Institute, Yale University, 3Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 4Laboratoire de Neurophotonique, Université Paris Descartes, Faculté des Sciences Fondamentales et Biomédicales, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)

Summary

هنا، نقدم بروتوكول للكشف، والأحداث الانصهار واحدة بوساطة كمين بين الجسيمات الشحمية وطبقات ثنائية معتمدة في قنوات ميكروفلويديك باستخدام TIRFM الاستقطاب، مع حساسية جزيء واحد و~ 15 مللي ثانية قرار الوقت. ويمكن الكشف عن الدهون والافراج عن البضائع القابلة للذوبان في وقت واحد. يتم قياس حجم الجسيمات الشحمية، الانتشارية الدهون، والمسام الانصهار خصائص.

Abstract

في عملية في كل مكان من الانصهار غشاء فتح المسام الانصهار يؤسس أول اتصال بين اثنين من مقصورات منفصلة سابقا. خلال العصبي أو إطلاق هرمون عبر إيماس، يمكن للمسام الانصهار مفتوحة عابر وعلى مقربة مرارا وتكرارا، وتنظيم البضائع إطلاق حركية. ديناميات المسام أيضا تحديد طريقة إعادة التدوير الحويصلة. نتائج إعادة عزل لا رجعة فيها في عابرة الانصهار، "تقبيل والفر"، في حين أن تمدد يؤدي إلى الانصهار الكامل. من أجل فهم أفضل ما هي العوامل التي تحكم ديناميات المسام، وضعنا مقايسة لمراقبة الانصهار غشاء باستخدام الاستقطاب الانعكاس الكلي الداخلي مضان (TIRF) المجهري مع حساسية جزيء واحد و~ 15 قرار الوقت مللي ثانية في كيميائيا واضحة المعالم في نظام المختبر. الانصهار وصفت من fluorescently الحويصلات unilamellar صغيرة تحتوي على البروتينات الخامس الفخ (الخامس سيارات الدفع الرباعي) مع مستو طبقة ثنائية تحمل تي الافخاخ، معتمدة على وسادة لينة البوليمر (تي سيمبول تكنولوجيز، التي تدعمها ر طبقة ثنائية)، ورصدها. يستخدم فحص قنوات تدفق الموائع الدقيقة التي تضمن الحد الأدنى من استهلاك عينة في حين تزويد كثافة ثابتة من سيارات الدفع الرباعي. استغلال تعزيز إشارة السريع على نقل بطاقات الدهون من سيارات الدفع الرباعي إلى SBL خلال الانصهار، ويتم رصد حركية نقل الدهون صبغ. حساسية TIRF المجهري يسمح تتبع العلامات الدهون الفلورسنت واحدة، والتي من الانتشارية الدهون وحجم الدفع الرباعي يمكن استخلاصه لكل حدث الانصهار. الدهون مرات الإفراج صبغة يمكن أن تكون أطول بكثير مما كان متوقعا للمرور دون عوائق من خلال المسام مفتوحة بشكل دائم. باستخدام نموذج يفترض يرجع إلى المسام الخفقان التخلف الإفراج الدهون، المسام "الانفتاح"، وجزء من الوقت تبقى المسام مفتوحة خلال الانصهار، يمكن تقدير. وعلامة القابلة للذوبان يمكن أن تكون مغلفة في سيارات الدفع الرباعي لرصد وقت واحد من الدهون والإفراج البضائع القابلة للذوبان. وتشير هذه القياسات بعض المسام قد ختم بعد فقدان جزء من البضائع القابلة للذوبان.

Introduction

الانصهار الغشاء هو عملية بيولوجية عالمية المطلوبة للاتجار داخل الخلايا من الدهون والبروتينات، إفراز، والتسميد، والتنمية، ويلفها دخول الفيروس إلى الكائنات المضيفة 1-3. بالنسبة لمعظم تفاعلات الاندماج داخل الخلايا بما في ذلك الإفراج عن الهرمونات والناقلات العصبية عبر إيماس، يتم توفير الطاقة لدمج اثنين من طبقات ثنائية الدهون عن طريق تشكيل لحزمة أربعة الحلزون بين (الفخ) البروتينات وما شابه ذلك للذوبان N-ethylmaleimide تراعي بروتين عامل مرفق مستقبلات، الراسية في الحويصلة (الخامس الفخ) والغشاء الهدف (تي الفخ) 4 على التوالي. متشابك الحويصلة إيماس هو تفاعل الاندماج أكثر ينظم بإحكام ويحدث خلال ميلي ثانية واحدة بعد وصول ل1،4،5 المحتملين عمل. المسام الانصهار، الاتصال الأولي بين اثنين من الصمامات مقصورات، يمكن أن تومض مفتوحة ومغلقة عدة مرات قبل إعادة طبع أو توسيع بصورة لا رجعة فيها 5-7. النتائج السابقةفي عابرة، "قبلة وتشغيل" الانصهار، في حين يؤدي الأخيرة إلى الانصهار الكامل. العوامل التي تحكم التوازن بين هذين الوضعين الانصهار وآليات تنظيم المسام الخفقان ليست مفهومة جيدا 5،8.

مطلوبة البروتينات كمين لإيماس. وألغت متشابك الانصهار الحويصلة على الانقسام من الافخاخ التي كتبها أعصاب 9. وأظهرت التجارب الانصهار السائبة باستخدام الحويصلات unilamellar الصغيرة (سيارات الدفع الرباعي) أن الافخاخ ليست مطلوبة فقط، ولكن أيضا ما يكفي لدفع الغشاء الانصهار 10. في هذا الاختبار بكميات كبيرة، وسيارات الدفع الرباعي أعادت مع الخامس الافخاخ (الخامس SUV) ومخدر مع الفوسفورية الفلورسنت (N - (7-نيترو-2-1،3-benzoxadiazol-4-YL) -phosphoethanolamine (NBD-PE) و ( N - (lissamine رودامين B السلفونيل) -phosphoethanolamine (LR-PE) ويخلط مع حويصلات غير المسماة التي تحتوي على تي الافخاخ (ر-SUV) في البداية مضان بنك دبي الوطني-PE في الخامس سيارات الدفع الرباعي ومروي التي كتبها فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق ) إلى LR-PE. كما مختبرالهنداوي الخامس سيارات الدفع الرباعي تلتحم مع غير المسماة تي سيارات الدفع الرباعي، يتم تقليل كثافة سطح fluorophore في الغشاء الآن جنبا إلى جنب، والزيادة الناتجة في دبي الوطني-PE مضان تقارير مدى الدهون خلط 10. كما فحص الجزء الأكبر من السهل إعداد وتحليل، وقد تم استخدامه على نطاق واسع لدراسة آليات بوساطة كمين الانصهار 10-14. ومع ذلك، لديها العديد من القيود، مثل انخفاض حساسية وضعف قرار الوقت. الأهم من ذلك، باعتبارها قياس الفرقة، فإنه المتوسطات النتائج على كل الأحداث مما يجعل التمييز بين الالتحام والانصهار، وكذلك الكشف عن وسيطة hemifusion الصعبة.

وعلى مدى عدة مجموعات العقد الماضي، بما في ذلك بلدنا، وضعت فحوصات جديدة لرصد الأحداث الانصهار في مستوى حويصلة واحدة 15-27. تستخدم ها وزملاؤه الخامس سيارات الدفع الرباعي المربوطة على سطح ومراقبة الانصهار مع حرية تي سيارات الدفع الرباعي 18،19. تم رصد الدهون خلط باستخدام الحنق بين زوج من fluorophores محددة الدهون مسريرا في الخامس وتي سيارات الدفع الرباعي، على التوالي، وذلك باستخدام الانعكاس الكلي الداخلي مضان (TIRF) المجهري 18. وفي وقت لاحق، استخدم مختبر Brunger من نوع دهون، تسمية واحدة جنبا إلى جنب مع علامة محتويات للكشف في وقت واحد من الدهون ومحتويات خلط 20،28. وشملت كلا من الدهون وعلامات محتويات في ارتفاع، تركيزات التبريد الذاتي. أدى اندماج مع سيارات الدفع الرباعي غير المسماة في مضان dequenching 20،28.

وتنصهر الآخرين الخامس سيارات الدفع الرباعي إلى طبقات ثنائية مستو تشكيلها مع تي الافخاخ 15-17،21-27،29. الهندسة المستوية من الهدف (تي فخ الحاوي) يحاكي أفضل طبقة ثنائية عملية الانصهار الفسيولوجية، الحويصلات المنحنية للغاية صغيرة مع غشاء البلازما المسطحة. مجموعة ستاينم المستخدمة الأغشية التي تغطي المسام تشكيلها مع تي الافخاخ، علقت اكثر من مسامية الركيزة نيتريد السيليكون والكشف عن الانصهار مع الفردية-سيارات الدفع الرباعي ضد استخدام ليزر متحد البؤر المسح المجهري 23. الآخرين وتستخدم الخامس سيارات الدفع الرباعي إلى طبقات ثنائية مستو تشكيلها مع تي الافخاخ، معتمد على ركيزة الزجاج 15-17،21،22،24-27،29. ميزة كبيرة لاستخدام طبقات ثنائية المدعومة (SBLs) هي أن TIRF المجهري يمكن استخدامها للكشف عن الالتحام والانصهار الأحداث مع ممتازة نسبة الإشارة إلى الضوضاء ودون تدخل من الخامس سيارات الدفع الرباعي الحرة، على الرغم من استخدام على microfluidics يوفر الدقة حدث واحد باستخدام معيار بعيدة الميدان epifluorescence المجهري 24.

ومصدر القلق الرئيسي هو ما إذا كان وكيف التفاعلات الركيزة طبقة ثنائية تؤثر دعم جودة طبقة ثنائية وعملية الاندماج. تقدم العمل في وقت مبكر استخدام SBLs مستو التي تم دعمها مباشرة على الزجاج أو الكوارتز الركيزة 15-17. وقدمت هذه SBLs عن طريق الامتزاز، انفجار، ونشر والانصهار الأغشية تي سيارات الدفع الرباعي على الركيزة. وقد أدرك ذلك قريبا، مع ذلك، أن حذف عنصر تي كمين رئيسي، SNAP25، من SBLs أعد بهذه الطريقة أدى إلى الخامس SUV الالتحام والانصهار حركية indistinguishable من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام كامل تي الافخاخ 17. لأنه مطلوب SNAP25 تماما عن الانصهار في الجسم الحي 30،31، وضعت أهمية فسيولوجية من هذه المحاولات المبكرة موضع تساؤل. تغلبت مجموعة تام لهذا التحدي باستخدام تشكيل طبقة ثنائية الخاضعة لسيطرة دعم أفضل 21. وهي تستخدم انجميور-بلودجيت ترسب على النشرة الأولى خالية من البروتين من سيمبول تكنولوجيز، تليها انصهار أن أحادي الطبقة مع تي سيارات الدفع الرباعي 21. وأدى ذلك إلى الانصهار تعتمد-SNAP25.

لتجنب القطع الأثرية المحتملة المرتبطة طبقة ثنائية المدعومة مباشرة على ركيزة الزجاج دون الحاجة إلى استخدام أساليب انجميور-بلودجيت، Karatekin وآخرون قدم، بولي رطب (جلايكول الإثيلين) (PEG) وسادة لينة بين طبقة ثنائية والركيزة 24. أدى هذا التعديل أيضا في تعتمد-SNAP25 الانصهار 24. قد طبقات ثنائية خففت على طبقة البوليمر لينة من المعروف للحفاظ على الغشاء أفضلاستخدمت التنقل البروتين وظيفة 32، والدراسات الانصهار مع الفيروسات 33. وبالإضافة إلى ذلك، يبدو أن طبقات ثنائية مضاد للفيروسات للاحتفاظ بعض القدرة في تقرير المصير، شفاء وهي قوية جدا 34،35. أولا، واشتملت على جزء من المتاحة تجاريا سلاسل PEG، مرتبطة الدهون في غشاء تي سيارات الدفع الرباعي. عندما انفجرت هذه تي سيارات الدفع الرباعي وتشكل طبقة ثنائية مستو على ركيزة الزجاج وفرشاة PEG تغطي كلا منشورات من طبقة ثنائية مستو. لأنه هو الدافع وراء تشكيل مستو طبقة ثنائية الإذعان لسلاسل PEG المحيطة تي سيارات الدفع الرباعي على سطح الزجاج ماء، انفجار الحويصلية وتشكيل طبقة ثنائية مستو لا تعير اهتماما نسبيا لتكوين الدهون المستخدمة. ومع ذلك، عندما يتم إدراج كميات كبيرة من الكوليسترول في الدم، وزيادة خصائص متماسكة من سيارات الدفع الرباعي، وسيارات الدفع الرباعي قد لا تنفجر من تلقاء أنفسهم. إذا كان هذا هو الحال، ناضح صدمة أو ثنائي التكافؤ أيونات يمكن استخدامها للمساعدة على مستو تشكيل طبقة ثنائية 25.

وكما ذكر أعلاه، في هذه ا ف باملنهجية فرشاة PEG تغطي جانبي مستو، بدعم طبقة ثنائية. الفرشاة التي تواجه قناة تدفق الموائع الدقيقة يساعد على منع التصاق غير محددة من واردة الخامس سيارات الدفع الرباعي التي هي أيضا تغطيها عادة مع طبقة الربط. تشكيل المجمعات الخامس وتي كمين يبدأ من N-ترميني غشاء القاصي والعائدات في مراحل نحو المجالات غشاء الداني 36. ل-سيارات الدفع الرباعي الخامس للتفاعل مع تي سيمبول تكنولوجيز، والخامس والحاجة تي فخ N-تيرميني لتبرز فوق فرش PEG، والذي يبدو أن هذا هو الحال في ظل ظروف الفحص. يمكن تكييفها ارتفاع فرشاة لدراسة البروتينات الأخرى من الافخاخ من خلال تغيير كثافة من الدهون مضاد للفيروسات وPEG طول سلسلة 37،38. فائدة أخرى من فرش PEG تغطي الأسطح القريبة من طبقات ثنائية الصمامات هي أنها تحاكي بيئة مزدحمة من الأغشية الحيوية التي تكتظ 30،000-40،000 بروتينات الغشاء لا يتجزأ لكل متر مربع ميكرون 39. تماما مثل سلاسل PEG في هذا الاختبار، وREPUطبقة البروتين lsive تغطي الأغشية البيولوجية يجب أن تكون دفعت جانبا للسماح للاتصال بين اثنين من طبقات ثنائية فوسفورية للانصهار تحدث.

تستخدم قنوات تدفق الموائع الدقيقة في هذا الاختبار، كما أنها توفر مزايا فريدة من نوعها. أولا، تدفق ميكروفلويديك يتيح المزيد من ترسب موحد للتي سيارات الدفع الرباعي لنشر والصمامات لتشكيل تي SBL. الثانية، وحجم قناة صغيرة (<1 ميكرولتر) يقلل من استهلاك عينة. ثالثا، كميات صغيرة المطلوبة تسمح التجربة بأكملها التي ستجرى تحت تدفق مستمر. تدفق يزيل ضعيفة، ويفترض غير تحديدا، الالتزام الخامس سيارات الدفع الرباعي من SBL 16. كما يقيم كثافة ثابتة من الخامس سيارات الدفع الرباعي فوق تي سيمبول تكنولوجيز، وتبسيط التحليل الحركي 17. وأخيرا، وتتميز الحويصلات رست بسهولة من تلك الخطوط التي يحملها تدفق 25. الرابعة، وعدة قنوات ميكروفلويديك يمكن استخدامها على نفس ساترة، كل يحققون في حالة مختلفة. وهذا يسمح مقارنة الظروف الدورينانوغرام نفس العملية التجريبية. وقد استخدم نهج مماثل من قبل مجموعة فان Oijen لدراسة الاندماج بين فيروس الإنفلونزا، وSBLs خففت 33.

في TIRF المجهري، واضمحلال الأسي الحقل زائل (مع التحلل ثابت ~ 100 نانومتر) حدود مضان الإثارة إلى تلك الجزيئات التي هي في مكان قريب جدا من واجهة زجاجية عازلة. هذا يقلل من مساهمة جزيئات الفلورسنت التي هي أبعد، ويزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ويتيح حساسية جزيء واحدة مع أوقات التعرض إطار 10-40 مللي ثانية. يؤدي مجال زائل أيضا إلى زيادة إشارة على الانصهار: كما نقل الدهون وصفت من سيارات الدفع الرباعي في سيمبول تكنولوجيز، وجدوا أنفسهم، في المتوسط، في حقل الإثارة أقوى. هذه الزيادة في مضان أقوى لالجسيمات الشحمية أكبر.

إذا تم استخدام الضوء المستقطب لتوليد مجال زائل، تساهم آثار إضافية للتغيرات في مضان على رransfer من التسميات من سيارات الدفع الرباعي في سيمبول تكنولوجيز. بعض الأصباغ الدهون لديها ثنائي القطب الانتقال الموجهة بزاوية متوسط ​​يفضل فيما يتعلق طبقة ثنائية التي هي جزء لا يتجزأ منها. وهذا يخلق فرقا في مقدار مضان المنبعثة من fluorophores عندما يكونون في سيارات الدفع الرباعي مقابل SBL، لأن شعاع الاستقطاب سوف تثير الأصباغ في الأغشية اثنين بشكل مختلف. عن السابق، فإن شعاع الإثارة التفاعل مع ثنائيات الاقطاب الانتقال الموجهة نحو سيارات الدفع الرباعي كروية، في حين أن لهذا الأخير، وسوف تقتصر توجهات ثنائي القطب من قبل هندسة SBL مسطحة. على سبيل المثال، عند استخدام الصورة مستقطب الضوء الساقط (الاستقطاب وضعها الطبيعي لطائرة من الإصابة)، الإثارة أكثر كفاءة عندما الصبغة هي في SBL من في سيارات الدفع الرباعي لمواز الموجهة الدهون صبغ انتقال ثنائي القطب لغشاء 29،40 (مثل تلك التي الجاذبة أو لم 41-43). يظهر SUV مخدر مع مثل هذه fluorophore خافت عندما الاحواض على سيمبول تكنولوجيز (الشكل 7، Representat إيف نتائج). كما يفتح المسام الانصهار ويربط الأغشية سيارات الدفع الرباعي وSBL، تحقيقات الفلورسنت منتشر في SBL وتصبح أكثر عرضة للولع مجال زائل الاستقطاب يالي 25،27،29. وبالتالي، فإن إشارة مضان متكاملة حول الموقع الانصهار يزيد بشكل حاد خلال نقل الصبغة من سيارات الدفع الرباعي في SBL 27 (الشكل 3) والشكل (7). عاملا إضافيا يسهم في إشارة التغييرات التي ترافق الاندماج وdequenching من العلامات الفلورية كما هي المخفف أنها عندما نقل إلى SBL. مساهمة dequenching عادة طفيفة مقارنة آثار تسوس الميدانية والاستقطاب زائل في مقايسة الموصوفة هنا، لأنه فقط جزء صغير ( المعادلة 1 ) من الدهون وصفت.

الزيادة إشارة على الانصهار يمكن استغلالها لاستخلاص الخصائص الانصهار المسام بمقارنة ذلك الوقت،1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>، المطلوبة للدهون للهروب من خلال المسام التي هي قابلة للاختراق بحرية إلى الدهون إلى الافراج عن الوقت الفعلي، المعادلة 1 . إذا جداول مرتين قابلة للمقارنة، ستكون النتيجة هي أن المسام يعرض مقاومة تذكر لتدفق الدهون. ومع ذلك، إذا كان الافراج عن الوقت الفعلي هو أطول بكثير من الوقت لاطلاق سراح محدودة الانتشار، وهذا من شأنه أن يشير إلى عملية، مثل الخفقان المسام، وتأخير الافراج عن الدهون. الافراج عن الوقت محدودة الانتشار، المعادلة 1 ، ويعتمد على حجم الجسيمات الشحمية الصمامات ودهون، الانتشارية. يتطلب تقديراتها هذه المعلمتين ليكون كميا. حساسية جزيء واحد من الفحص تسمح الانتشارية الدهون المراد قياسها من خلال تتبع عدة fluorophores الدهون واحد بعد إطلاق سراحهم في SBL لكل حدث الانصهار 26. حجم كل حويصلة الصماماتويمكن تقدير 27 عن طريق الجمع بين (ط) شدة صبغة الدهون واحد، (ب) التغير في مضان الكلي حول موقع رسو السفن بعد أن يتم نقل جميع fluorophores في سيمبول تكنولوجيز على الانصهار، (ج) المعروفة كثافة العلامات على سيارات الدفع الرباعي الدهون، و (د) من منطقة في الدهون. بالنسبة لكثير من الأحداث الانصهار، تم العثور على الأوقات الافراج عن الدهون الفعلية لتكون أبطأ بكثير مما كان متوقعا من قبل تحت سيطرة نشر الافراج عن 27، كما لوحظ سابقا على افتراض حجم SUV موحد 44. على افتراض التخلف الإفراج الدهون ومن المقرر أن المسام الخفقان، وهذا نموذج كمي يسمح تقدير "انفتاح المسام"، جزء من الوقت تبقى المسام مفتوحة أثناء الانصهار 27.

كلما كان ذلك عمليا، فمن المهم لاختبار آليات الاندماج باستخدام كل من الدهون ومحتويات بطاقات القابلة للذوبان. على سبيل المثال، يمكن أن يؤخر الإفراج الدهون من خلال عمليات أخرى من الخفقان المسام، مثل تقييد انتشار الدهون من البروتينات الفخ الذي تحيط رانه المسام. إذا كانت هذه هي الحالة، ثم الإفراج عن محتويات سيسبق الإفراج عن تسميات الدهون، شريطة المسام كبيرة بما فيه الكفاية للسماح بمرور تحقيقات القابلة للذوبان. خلل أكثر أساسيا في نهج يمكن أن يكون في افتراض أن نقل الدهون المسمى إلى SBL يحدث من خلال المسام الانصهار الضيق الذي يربط بين SBL إلى الحويصلة التي احتفظت إلى حد كبير شكل قبل الانصهار. يمكن نقل الدهون في SBL ايضا ان ينتج من اتساع السريع للمسام الانصهار مع ما يصاحب ذلك، غاية الانهيار السريع من سيارات الدفع الرباعي في غشاء سيمبول تكنولوجيز، كما سبق واقترح بناء على بيانات الافراج عن الدهون وحدها 29. رصد كل الدهون ومحتويات الافراج في وقت واحد، فقد وجد أن العديد من المسام أعادت بعد إطلاق سراح جميع العلامات الدهون، ولكن احتفظت ببعض البضائع القابلة للذوبان من 27. هذا يدل على أن بعض الجسيمات الشحمية لا ينهار على الأقل في SBL بعد الانصهار، والتي نقل الدهون الصبغة في SBL يحدث من خلال المسام الانصهار. وبالإضافة إلى ذلك، لحدث IPID ومحتويات الافراج في وقت واحد 27، مما يجعل من غير المرجح أن تخلف الإفراج الدهون يرجع إلى إعاقة انتشار الدهون من البروتينات كمين المحيطة المسام 45.

بروتوكول الانصهار سيارات الدفع الرباعي SBL التي لم ترصد إطلاق محتويات قابلة للذوبان ونشرت من قبل Karatekin وروثمان 25. هنا، يتم تضمينها المزيد من التطورات الأخيرة، ورصد أي وقت واحد من الدهون والافراج عن محتويات وتقدير خصائص سيارات الدفع الرباعي، الدهون، والانصهار المسام 27. يبدأ البروتوكول مع تعليمات لإعداد الخلايا الموائع الدقيقة، التي تربط بولي (ميثيل siloxane) (PDMS) المطاط الصناعي كتلة تحتوي على أخاديد مع ساترة زجاج 25. بعد ذلك، يتم شرح إعداد الخامس سيارات الدفع الرباعي مع كل من الدهون ومحتويات علامات. القسمين 4 و 5 توفر تعليمات لتجميع الخلايا الموائع الدقيقة، وتشكيل SBLs في الموقع والتحقق من وجود عيوب وسيولة، وإدخال VSأوفس في تدفق الخلايا والكشف عن الأحداث الانصهار. ويقدم القسم 6 تعليمات لتحليل البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد كتلة PDMS لتشكيل قناة ميكروفلويديك

شكل 1
الشكل 1. التصنيع الدقيق من قالب خلية تدفق وإعداد كتلة PDMS. (A) تصميم خلية تدفق أربع قنوات التي تناسبها على الزجاج ساترة 24 × 60 ملم (القاع). يتم ترتيب ستة تصاميم مماثلة لتناسب على رقاقة السيليكون 10 سم (أعلى). (ب) قطع كتلة من PDMS سميكة حوالي 5-8 ملم على الناخس حفرة. (C) الإدراج من الأنابيب في حفرة لكمة باستخدام زوج من ملاقط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. الحصول على قالب خلية تدفق مثل واحد في الشكل 1A. قنوات النموذجية هي 0،3-1 ملم واسعة، وارتفاع 70-100 ميكرون، و 1-2 سم طويلة. صنع قالب لناجي تقنيات ضوئيه القياسية في منشأة غرف الأبحاث 25 أو النظام إذا كان الوصول غرف الأبحاث غير متوفر. بدلا من ذلك، آلة قالب مع أبعاد أكبر من مادة مناسبة.
    ملاحظة: يمكن للموظفين غرف الأبحاث تدريب وتوجيه المستخدمين غير مجرب (الوصول إلى مرفق غرف الأبحاث يقتصر دائما للمستخدمين مع التدريب المناسب) في تصميم وترتيب قناع، تنظيف ويفر، وضوئيه. مرة واحدة يتم الحصول على القالب، يمكن استخدامه خارج غرف الأبحاث مرارا وتكرارا، شريطة أن يوضع في طبق مغلقة والحرص على استبعاد الغبار.
  2. تحضير خليط من ~ 100 مل PDMS (سيليكون قاعدة المطاط الصناعي) و~ 10 مل من عبر رابط (وكيل علاج) في كوب من البلاستيك القابل للتصرف. قطع رأس ماصة المتاح للتعامل مع PDMS لزجة أكثر سهولة. تزن PDMS في كوب من البلاستيك كما pipetting ليست دقيقة.
  3. يقلب الخليط جيدا. إزالة العديد من فقاعات الهواء عن طريق التفريغ في مجفف فراغ (حوالي 20دقيقة). كما يتم وضع الكأس في ظل فراغ، فإن الفقاعات تنمو في البداية في الحجم، وزيادة حجم الخليط إلى حد كبير. السيطرة على الفراغ التي يتم تطبيقها والتأكد من الكأس هي عميقة بما فيه الكفاية لتجنب تسرب.
  4. صب انخفاض كبير من خليط PDMS نزع الغاز في كوب طبق بتري (150 ملم × 20 ملم) واضغط على رقاقة على PDMS مع القالب مواجهة. هذا تتجنب الفقاعات التي محاصرون تحت الرقاقة. سوف فقاعات المحاصرين توسيع وقد تقلب رقاقة عندما يوضع الطبق في الفرن. الآن صب PDMS نزع الغاز على القالب على رأس الرقاقة حتى يتم تغطيته بنحو 5-8 ملم من إيضاحية. في حالة حدوث فقاعة الهواء بلطف إزالته مع طرف ماصة.
  5. خبز نظام تطوير إدارة الأداء في الفرن على 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. ضمان أن الطبق هو مستوى.
  6. استخدام شفرة مشرط جديدة لقطع كتلة PDMS التي تحتوي على هياكل قناة مصبوب. وقطع كتلة يحتاج لتناسب على ساترة (راجع الخطوة 4.1.9).
  7. قشر خارج قطع كتلة من الطبق وررالآس وضعها على قطعة من رقائق الألومنيوم نظيفة.
    ملاحظة: كتل عبر ربط إيضاحية يمكن الاحتفاظ به لبضعة أشهر. على رقاقة واحدة، وهناك 6 مجموعات من قنوات التدفق (الشكل 1A)، لذلك يمكن أن تنتج 6 PDMS كتل في صب PDMS واحد. بعد الاستغناء عن 6 من كتل PDMS، وقطع فضفاضة نظيفة من PDMS، لكن على خلاف ذلك لا تقم بإزالة PDMS المتبقية قبل صب وعبر ربط الدفعة القادمة، والتي سوف تتطلب سوى نحو نصف PDMS المستخدمة في الدفعة الأولى. قالب جيد يمكن أن تستمر لعدة سنوات.
  8. استخدام الناخس حفرة للتنقيب عن طريق كتلة PDMS في الحركة المستقيمة واحد (الشكل 1B). تبدأ على الجانب الأخاديد القناة. تأكد من إزالة مثقبة قطعة من PDMS. كرر هذا للجميع الثقوب ثمانية من تصميم أربع قنوات.
  9. وضع الجانب قناة كتلة PDMS إلى أسفل على قطعة جديدة وخالية من التجاعيد من رقائق الألومنيوم. تخزين كتلة لمدة تصل إلى بضعة أشهر في مربع الجافة، من الناحية المثالية في مجفف.
  10. دفع الأنابيب (0.25 ملم معرف، 0.76 مم OD) عن الثلث في حفرة لكمة باستخدام زوج من ملاقط (الشكل 1C). قطع الأنابيب مائلة لتسهيل الإدراج. ترك أنابيب طويلة بما فيه الكفاية للوصول إلى خزان سيارات الدفع الرباعي وضخ حقنة، على التوالي. بعد وضع رقاقة تجميعها على المجهر، وقطع الأنابيب مرة أخرى إذا كانت طويلة جدا.
  11. للاتصال الحقن مضخة، وقطع قطعة قصيرة من أكبر أنابيب السيليكون (ID 0.51 ملم، 2.1 ملم OD) وإدراج أنبوب أرق في جانب واحد. هذه الكتلة الاستخدام استعداد للPDMS يمكن الاحتفاظ به لبضعة أشهر.

2. ساترة التنظيف

  1. coverslips نظيفة وفقا للبروتوكول وصفها في Karatekin وروثمان 25 باستخدام مزيج مؤكسد قوي من حامض الكبريتيك (H 2 SO 4) وبيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2). تنفيذ هذا الإجراء في غرف الأبحاث، ومراقبة احتياطات السلامة المناسبة. بدلا من ذلك، استخدام غرف الأبحاث تنظيفها جoverslip ما هو متاح تجاريا (انظر قائمة المواد).

3. إعداد الخامس السيارات رباعية الدفع تحتوي على كل من الدهون وتسميات المحتوى

الشكل 2
يتم خلط الشكل 2. تخطيطي من إعداد سيارات الدفع الرباعي. الدهون في أنبوب زجاجي (1) ويبخر المذيب لتشكيل الفيلم الدهون عن طريق تناوب الأنبوب في حمام مائي (2). تتم إزالة آثار المتبقية من المذيبات تحت فراغ عالية (3). ورطب الفيلم الدهون في المخزن إعادة تحتوي على المنظفات والبروتين في حين vortexed (4). إذا محتويات صبغ هو أن تكون مغلفة، يتم تضمينه في هذه الخطوة، وكذلك في الخطوة التخفيف (5). التخفيف من تركيز المنظفات أقل من تركيزه مذيلة حاسم يؤدي إلى الحويصلية تشكيل. ومدال المنظفات بعيدا بين عشية وضحاها (6). لتي سيارات الدفع الرباعي لتشكيل SBL بما في ذلك بنك دبي الوطني-PE (الأخضر)، وطرحت الحويصلات في التدرج الكثافة والتي تم جمعها فيواجهة بين طبقتين (7A). لفصل الخامس سيارات الدفع الرباعي مع علامة المحتوى مغلفة من صبغة خالية تشغيل العينة على عمود الحجم الاستبعاد وجمع في 0.5 مل الكسور (7B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إعداد 4 لتر من العازلة إعادة، التي تحتوي على 25 ملي HEPES-كوه، 140 ملي بوكل، 100 ميكرومتر EGTA و1 ملم DTT، ودرجة الحموضة 7.4. استخدام أكثر من المخزن المؤقت لغسيل الكلى و 100 مل لخطوات أخرى.
    ملاحظة: يمكن استخدام مخازن أخرى، ولكن من المهم للحفاظ على الأسمولية عازلة ثابتة طوال التجربة واختيار الظروف التي البروتينات وظيفية. لإعداد الخامس سيارات الدفع الرباعي التي تحتوي على تسميات الدهون فقط وتي سيارات الدفع الرباعي، اتبع Karatekin وروثمان 25.
  2. كما يتم تخزين مخزون الدهون في -20 درجة مئوية في الكلوروفورم أو الكلوروفورم: الميثانول (2: 1، ت / ت)، واسمحوا قارورة تصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الافتتاح لتجنب التكثيف.
  3. شطف أنبوب زجاجي مع الكلوروفورم لإزالة كميات ضئيلة من المنظفات وخلط الدهون في نسبة المرجوة مع كمية النهائي من 1 مكرومول في خليط من الكلوروفورم والميثانول (2: 1، ت / ت). فقط استخدام المحاقن الزجاجية / أنابيب للتعامل مع المذيبات العضوية / الدهون الذائبة.
    ملاحظة: الدهون المستخدمة هنا هي POPC: SAPE: DOPS: الكولسترول: PEG2000-مخدر: هل في نسبة المولي من 57.4: 15: 12: 10: 4،6: 1 لالخامس كمين تحتوي على حويصلات وPOPC: SAPE: DOPS: نسبة الكولسترول في الدم : PI الدماغ (4،5) ف 2: PEG2000-مخدر: دبي الوطني-PE (54.9: 15: 12: 10: 3: 4.6: 0.5) لتي فخ سيارات الدفع الرباعي. انظر المواد للحصول على التفاصيل. تركيبة الدهون أخرى يمكن استخدامها.
  4. يتبخر المذيب تحت تيار لطيف من النيتروجين، أو في المبخر الدوار. تزج غيض من أنبوب في حمام مائي (37 درجة مئوية) يسخن فوق أعلى درجة حرارة انصهار الدهون لانتاج فيلم الدهون متجانسة وتجنب التغيرات الكبيرة في درجات الحرارة في حين تبخر المذيب. بدء فراغ في جميع أنحاء300 مليبار حتى يتم تشكيل فيلم الدهون، ثم يستمر ل~ 2 دقيقة في أعلى مستوى ممكن فراغ في المبخر الدوار.
  5. إزالة أنبوب زجاجي والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء وإزالة آثار ما تبقى من المذيب عن طريق وضع أنبوب في مجفف تحت فراغ عالية لا يقل عن 2 ساعة. هذه الخطوة يمكن أيضا تشغيل بين عشية وضحاها.
  6. لترطيب الفيلم الدهون المجففة، وإعداد خليط من المنظفات (ن الأوكتيل-β-D-glucopyranoside، OG) والبروتين (الخامس الافخاخ)، وتعتبر الدار في المخزن إعادة (500 الحجم النهائي ميكرولتر). الحفاظ على تركيز المنظفات النهائي ~ 2 مرات أعلى من تركيز مذيلة الحرج (CMC، 20-25 ملم لOG) وضبط الحجم النهائي بحيث المنظفات لنسبة الدهون هو> 10. حل Sulforhodamine ب (SRB) مسحوق في حل البروتين المنظفات للحصول على التركيز النهائي من 10-50 ملم تعتبر الدار التي تهز بلطف الحل. ضبط الأسمولية المخزن المؤقت إعادة عند إضافة تركيزات عالية للدار عن طريق الحد من التعاونncentration من كلوريد البوتاسيوم وفقا لذلك.
    ملاحظة: نسبة الدهون إلى البروتين (LP) لتي الافخاخ عالية (LP ~ 20000، ~ 70 تي الافخاخ للمتر ميكرون 25). أعلى بكثير الكثافة تي كمين في سيمبول تكنولوجيز قد يؤدي إلى المجاميع البروتين نشطة مع انخفاض كبير في معدلات الانصهار 17،24. ليرة لبنانية لالخامس الافخاخ هو أقل بكثير (LP 200 ~، ~ ​​7000 ضد الافخاخ لكل ميكرون 2)، على مقربة من كثافة الخامس الفخ وجدت في الحويصلات المشبكية 46،47. لضمان وظيفة البروتين بعد التعبير المؤتلف وتنقية الخامس وتي الافخاخ من المفيد إجراء انصهار معظم بسيط فحص 48 قبل الذهاب من خلال جميع الخطوات من واحد فحص حويصلة الانصهار.
  7. يهز بلطف أنبوب زجاجي قبل تحسنت تحتوي على فيلم الدهون المجففة مع إضافة الحل البروتين المنظفات-SRB من الخطوة 3.6. في محاولة لتجنب خلق فقاعات. تواصل يهز لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  8. تمييع المنظفات خمسة أضعاف بإضافة إعادةالعازلة التي تحتوي على SRB (إضافة 2 مل، 2.5 الحجم النهائي مل) بينما vortexing لبسرعة لتجنب التدرجات تركيز. تواصل يهز لمدة 15 دقيقة إلى 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: أطول زيادة حضانة كفاءة البروتين إعادة. التخفيف السريع يقلل من تركيز المنظفات أدناه اللجنة العسكرية المركزية ويؤدي إلى تشكيل الجسيمات الشحمية صغيرة.
  9. Dialyze تعليق الحويصلة أولا ضد ~ 1 لتر من العازلة إعادة لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم ضد 3 L من العازلة إعادة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 4 غرام من المازة البوليسترين، وذلك باستخدام 20،000 أنبوب غسيل الكلى MWCO أو الكاسيت. استخدام الأكواب مختلفة لغسيل الكلى من الحويصلات مع وبدون SRB لمنع التلوث.
  10. تتوازن عمود هلام الترشيح مع العازلة إعادة. تشغيل تعليق الحويصلة من خلال عمود فصل SRB مجانا من الخامس سيارات الدفع الرباعي مع SRB مغلفة. استخدام عازلة إعادة دون SRB كما شاطف مرة واحدة لديها عينة كاملدخلت العمود. جمع الخامس سيارات الدفع الرباعي في 0.5 مل الكسور.
  11. تحقق نجاحا التغليف SRB بتركيزات مروي الذاتي عن طريق قياس SRB مضان قبل وبعد إضافة المنظفات لقسامة من الحويصلات 16. باستخدام مطياف مضان، تثير عينة في 550 نانومتر، ومسح انبعاث SRB بين 570 نانومتر و 630 نانومتر. نتوقع زيادة أضعاف 4-8 في مضان تعتبر الدار اعتمادا على كمية مغلفة على إضافة المنظفات مثل الغشاء بالفاعلات وتضعف SRB الافراج عنهم.
  12. تميز الانتعاش الدهون والبروتين باستخدام مضان الطيفي 24 و SDS-PAGE هلام الكهربائي، على التوالي. استخدام أسلوب تلطيخ حساسة، خاصة بالنسبة للارتفاع ليرة لبنانية عينات ر الدفع الرباعي (انظر قائمة المواد). وعادة ما يتم فقد حوالي 50٪ من كل من الدهون والبروتين إدخال أثناء إعداد مما أدى إلى ليرة لبنانية قريبة من القيمة الاسمية.
  13. تميز الأحجام سيارات الدفع الرباعي باستخدام الضوء الديناميكي نثر 24 أو الإلكترون microscoالحمر 48. مخزن تعتبر الدار التي تحتوي الخامس سيارات الدفع الرباعي في 4 درجات مئوية تصل إلى ~ 3-4 أيام. لا تجميد، وتجميد والذوبان يكسر غشاء والنشرات مغلفة SRB.

4. سيارات الدفع الرباعي SBL فيوجن الفحص لمراقبة الدهون الإصدار فقط

  1. تشكيل طبقة ثنائية بدعم المربوطة ضمن قنوات تدفق الموائع الدقيقة
    1. وضع كتلة PDMS (الخطوة 1.11) في ظل فراغ عالية لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل التجربة لإزالة الغازات المذابة. وهذا يقلل كثيرا من خطر فقاعات الهواء في القنوات ميكروفلويديك خلال التجربة الانصهار.
    2. بدوره على الإعداد المجهر وتسخين المرحلة وصاحب العينة (الأرقام 3 و 4) إلى درجة الحرارة المطلوبة.
    3. تصفية المخزن المؤقت إعادة استخدامها لتخفيف الحويصلات من خلال مرشح 0.45 ميكرون أو أصغر حجم المسام.
    4. تمييع ~ 30 ميكرولتر من بنك دبي الوطني-PE وصفت تي سيارات الدفع الرباعي أو (-سيارات الدفع الرباعي الجبهة الوطنية) خالية من بروتين الجسيمات الشحمية التحكم (الأسهمحل 0.5-1 ملي الدهون) مع ~ 60 ميكرولتر من العازلة. التركيز النهائي ليست حرجة هنا.
    5. ديغا هذا الخليط باستخدام حقنة 3 مل. اضغط على معظم الهواء فوق العينة في حين عقد حقنة عموديا. ختم طرف (إبرة الحرة) باستخدام فيلم البارافين وخلق الفراغ الذي ادى الى انخفاض المكبس. اضغط على برميل حقنة لتسريع التفريغ من الحل. كرر هذه العملية عدة مرات حتى لا تحدث أكثر من فقاعات عند تطبيق فراغ.
    6. استخدام إبرة تحت الجلد بقطر أكبر قليلا من الأنابيب التي تعلق على كتلة PDMS لكمة ثقب في الغطاء من أنبوب microcentrifuge. تأكد من أن لكمات من قطعة من البلاستيك ليس داخل أنبوب لأنها قد تسد أنابيب متصلة مدخل قناة ميكروفلويديك في وقت لاحق.
    7. ملء حل سيارات الدفع الرباعي نزع الغاز في أنبوب microcentrifuge وجود ثقب في الغطاء ووضعه في حامل على المسرح المجهر لكي تتوازن إلى درجة الحرارة المحددة.
    8. ررالآس ساترة تنظيفها سابقا (قسم 2) في نظافة البلازما وتشغيل البلازما الجوية لمدة 5 دقائق. وضع ساترة تعامل البلازما (الجانب المعالج تواجه متابعة) على رأس عدد قليل من الأنسجة خالية من الوبر بمثابة وسادة.
    9. إزالة رقائق الألومنيوم من كتلة PDMS نزع الغاز ووضع حجر على رأس ساترة. عند إعادة استخدام كتلة PDMS وضع على وفصل قطعة من شريط لاصق على الجانب القناة لتنظيفه. اضغط على PDMS كتلة على ساترة باستخدام زوج من ملاقط لجعلها عصا، ولكن لا تضغط من الصعب جدا مثل الزجاج قد كسر.
    10. وضع خلية تدفق تجميعها على خشبة المسرح المجهر وتوصيل الأنابيب إلى خزان سيارات الدفع الرباعي وضخ حقنة، على التوالي. الشريط ساترة لمرحلة (الشكل 3B).
    11. بدء الشفط سيارات الدفع الرباعي في 3 ميكرولتر / دقيقة حتى يملأ الحل القنوات تماما (~ 2.25 ملم / ثانية لس 300 ميكرومتر قناة المقطع العرضي 75 ميكرون). عندما حلول لجميع القنوات بدأت تتحرك صعودا والعشرينه أنابيب على الجانب الخروج، والحد من تدفق إلى 0.5 ميكرولتر / دقيقة، واحتضان لمدة 30-45 دقيقة.
      ملاحظة: الوقت بين علاج البلازما الشريحة الزجاجية وتتدفق من سيارات الدفع الرباعي في قناة يجب أن لا تتجاوز 10-20 دقيقة مثل تأثير العلاج البلازما هي عابرة.
    12. تحقق القنوات لأي تسرب. استخدام الهدف الهواء 10-20X لمراقبة دبي الوطني-PE مضان من بنك دبي الوطني-PE التي تحتوي على تي أو الجبهة الوطنية-سيارات الدفع الرباعي. تثير دبي الوطني fluorophores باستخدام الليزر 488 نانومتر. التسريبات هي صعبة للكشف عن استخدام إضاءة ساطعة المجال.
    13. وضع أنبوب العازلة مع إعادة نزع الغاز في حامل والسماح للحرارة يوازن التغيرات السريعة كما هو الحال في درجة الحرارة قد يسبب تشوهات في سيمبول تكنولوجيز. وقف التدفق والانتظار ~ 1 دقيقة للتأكد من توقف تدفق تماما وسوف يستنشق أي فقاعة الهواء في الأنبوب قبل تبديل أنابيب مدخل إلى المخزن المؤقت نزع الغاز.
    14. شطف جميع القنوات مع العازلة نزع الغاز ليغسل سيارات الدفع الرباعي غير منضم.
    15. التبديل إلى higheص الهدف التكبير TIRF (60X، النفط، NA 1،45-1،49) والتحقق من أن طبقة ثنائية تبدو متجانسة وخالية من أي عيوب على نطاق واسع واضحة مثل بقع داكنة أو الأنابيب الدهون تمتد خارجا من سيمبول تكنولوجيز.
  2. تحقق سيولة طبقة ثنائية
    1. إذا وحدة FRAP مخصصة ليست متاحة، أو إذا كان تسلسل FRAP لا يمكن برمجتها، ثم نوعيا سيولة الغشاء اختبار النحو التالي.
      1. إغلاق الحجاب الحاجز الحقل إلى حجم صغير (~ 40 ميكرون قطر) وضبط 488 نانومتر ضوء الإثارة كثافة من خلال برنامج (20-80 مللي واط، أو 15-60 NW / ميكرون 2) لتبييض مضان دبي الوطني-PE في كشفها المجال بشكل كبير، ولكن ليس تماما. لطبقة ثنائية السوائل، في حالة مستقرة، وينبغي أن تكون كثافة مضان في وسط منطقة تتعرض أقل مما كانت عليه في الحواف، مع دخول سليمة جزيئات دبي الوطني-PE المنطقة المكشوفة وتنتشر على مسافة معينة قبل التبييض. في المقابل، إذا كان-الالتزام سطح Sفشل UVs وأن تنفجر، أو لسبب آخر طبقة ثنائية بدعم ليست السوائل، ويجب على جميع fluorophores في منطقة تتعرض التبييض.
        ملاحظة: يتم إعطاء قيم كثافة الليزر في هذا المجال ولاحقة الخطوات كنقطة انطلاق الخام وينبغي أن يكون الأمثل لمجموعة معينة من الظروف.
      2. وقف الإضاءة وتشغيله مرة أخرى بعد بضع دقائق للتحقق من نتائج القياسات حالة مستقرة
    2. برمجة تسلسل FRAP لقياس كمي، إن أمكن. رؤية الملفات الإضافية وأسطورة المقابلة للحصول على التفاصيل.
      ملاحظة: في بعض الأحيان سيارات الدفع الرباعي الانضمام إلى ساترة الزجاج، لكنه يفشل في انفجار وتشكيل طبقة ثنائية السوائل. إذا حدث هذا، وشطف القنوات مع العازلة إعادة نزع الغاز التي تحتوي على 10 ملي المغنيسيوم 2+ للمساعدة في تشكيل طبقة ثنائية معتمد. استخدام التبييض مضان لتقييم طبقة ثنائية سيولة كما في 4.2. مرة واحدة يتم تشكيل طبقة ثنائية السوائل، وشطف مع المغنيسيوم 2+ خالية ريكوعازلة nstitution.
  3. إدخال الخامس سيارات الدفع الرباعي في القنوات تدفق الموائع الدقيقة
    1. ديغا إعادة العازلة واستخدامه لتمييع الحل الأسهم الخامس سيارات الدفع الرباعي من قبل عامل من حوالي 10 مارس - 10 مايو اعتمادا على تركيز الأسهم الخامس سيارات الدفع الرباعي. تهدف لتخفيف التي ينتج عنها حوالي 10-100 الأحداث الانصهار في غضون 60 ثانية في مجال الرؤية.
      ملاحظة: العديد من اندماج زيادة مضان الخلفية (لأن كل ودائع الحدث LR-PE أو لم تسميات الدهون في SBL) وجعل الكشف وتحليل الأحداث الانصهار صعوبة. في المقابل، معدل الانصهار التي هي النتائج المتدنية جدا في الفقراء إحصاءات أو يتطلب اكتساب العديد من الأفلام. لتركيز الخامس سيارات الدفع الرباعي من 0.1 ملي الدهون، تبدأ من خلال تمييع 5 ميكرولتر الأسهم سيارات الدفع الرباعي في المخزن إعادة 995 ميكرولتر ثم تمييع 5-50 ميكرولتر من هذا في 950-995 عازلة ميكرولتر إعادة.
    2. دعونا درجة الحرارة يوازن قبل وقف تدفق وinserتينغ أنبوب مدخل إلى الحل الخامس SUV المخفف.
    3. ضبط زاوية TIRF والاستقطاب على النحو التالي.
      1. بعد وضع الاستقطاب المطلوب من خلال تناوب شعاع الإثارة، وضبط الميل للمرآة القائد الموقف من الحزم عن طريق السائر المحركات من خلال البرنامج. تحرك ببطء موقف شعاع الليزر من مركز الهدف في المستوى البؤري الخلفية إلى جانب واحد خارج المركز. مراقبة الضوء من هدف في الجانب الأمامي الخروج مع زاوية زيادة فيما يتعلق محور موضوعي كما يتم نقل الموقف أكثر خارج المركز.
      2. علما أن موقف السيارات عندما يختفي شعاع تخرج لأول مرة في الهدف، أي عندما يتحقق TIR أولا.
      3. ببطء حفاظ على تحريك الموقف شعاع مزيد من خارج المركز في حين رصد مضان من على سطح الأرض. علما أن موقف السيارات عندما يختفي مضان السطح عندما شعاع انتقلت بعيدا جدا خارج المركز.
      4. اختيار positio شعاع ن بين الحدين تحديدها أعلاه. للحصول على أفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء والمزيد من تعزيز إشارة على الانصهار، واختيار عمق الاختراق الضحلة (شعاع موقف أقرب إلى حافة الهدف) الذي لا يزال يوفر إضاءة موحدة للviewfield.
        ملاحظة: من الأفضل للحفاظ على نفس الموقف TIR شعاع (نفس عمق الاختراق) لجميع التجارب بعد الأمثل الإعدادات. تأكد الدورية الاستقطاب لا تؤدي إلى تغييرات في موقف شعاع.
    4. تدفق الخامس سيارات الدفع الرباعي في قناة بمعدل تدفق 2 ميكرولتر / دقيقة، وهو ما يمثل متوسط ​​سرعة تدفق خطية من ~ 1.5 ملم / ثانية لشريحة من 75 ميكرون س 300 ميكرون. التبديل إلى الإعدادات الإثارة / انبعاث لمراقبة الدهون خلط (LR أو هل فقط).
  4. مراقبة الانصهار بين الخامس سيارات الدفع الرباعي واحدة وSBL

.jpg و"/>
الشكل 3. الإعداد pTIRF التجريبية. (أ) تمثيل تخطيطي من الخامس سيارات الدفع الرباعي وتي SBL على ركيزة الزجاج. كاذبة الصور الملونة TIRFM من واحد حدث الانصهار سيارات الدفع الرباعي SBL تبين الدهون لرسو السفن (1) والإفراج عن صبغ الدهون في سيمبول تكنولوجيز (2)، يليه تبيض وانخفاض كثافة مضان (3). يظهر كثافة مضان الإجمالية (مجموع القيم بكسل في × 5.3 ميكرون مربع 5.3 ميكرون) إشارة. وسجلت (ب) ساترة المستعبدين إلى كتلة PDMS على مرحلة ساخنة. أنبوب مدخل للقنوات ميكروفلويديك رسم عينات من أنبوب في صاحب العينة المعدنية (يمين) يستنشق عن طريق ضخ حقنة (يسار). تحت المضخة وحدة الانبعاثات المزدوجة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

OAD / 54349 / 54349fig4.jpg "/>
. يتم إنشاء الشكل 4. تخطيطي من الإعداد التجريبية موجة زائل في واجهة زجاجية عازلة في قناة ميكروفلويديك. يتم تشكيل SBL على الزجاج والخامس سيارات الدفع الرباعي ويستنشق من صاحب العينة المعدنية (أعلى اليمين) من خلال القناة إلى حقنة (أعلى اليسار). M، مرآة، DM، مرآة مزدوج اللون. L، عدسة، F، فلتر، P، المستقطب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. باستمرار إثارة ومراقبة الخامس SUV مضان باستخدام نانومتر 561 (لLR-PE) أو 638 نانومتر (للم) ليزر اعتمادا على fluorophore تأسست في الخامس سيارات الدفع الرباعي. كما الخامس سيارات الدفع الرباعي تصل إلى قناة تدفق وقفص الاتهام على والصمامات مع سيمبول تكنولوجيز، تبدأ إشارة الخلفية مضان تتراكم.
  2. ضبط شدة الإثارة الليزر من خلال برنامج لتبييض مستمر الخلفيةمضان مثل هذا في الالتحام والانصهار جديدة الأحداث حالة مستقرة ويمكن بسهولة أن يلاحظ.
    ملاحظة: إذا تبيض بطيء جدا، وسوف مضان الخلفية تكون مرتفعة للغاية. إذا تبييض سريع جدا، وسوف إشارات من سيارات الدفع الرباعي رست ومن fluorophores تطلق في SBL تتلاشى بسرعة، وتقصير نافذة خلالها انصهار سيارات الدفع الرباعي رست يمكن الكشف أو يمكن تتبع على fluorophore. لمتحمس LR-PE في 561 نانومتر، 2،5-7،5 السلطة ميغاواط توهج 190 دائرة ميكرون قطر (100-250 NW / ميكرون 2) هي قيمة معقولة للبدء. ل638 نانومتر الإثارة من فعل، 0،8-1،6 ميجاوات على مدى 190 ميكرون دائرة قطرها (30-60 NW / ميكرون 2) يمكن استخدامها لاختبارات أولية.
  3. اكتساب العديد من الأفلام في مواقع مختلفة في قناة معينة. تحقق دبي الوطني-PE مضان للتحقق من أن SBL لم يكن لديك عيوب في هذه المواقف. الحصول على الأفلام كامل الإطار في الحد الأقصى لمعدل (~ 50 لقطة / ثانية) أو منطقة اقتصاص من الفائدة عند أعلى معدل الإطار (إلى~ 100 هرتز) لمدة 60 ثانية.
  4. الانتقال إلى قناة ميكروفلويديك آخر وتكرار التسجيلات لأمراض أخرى. وتشمل الضوابط سلبية مثل SBL أو سيارات الدفع الرباعي خالية من البروتين، إضافة المجال حشوية القابلة للذوبان في الخامس كمين VAMP2 (CDV) مثل مثبط أو علاج ضد سيارات الدفع الرباعي مع عصبي الكزاز (30 دقيقة عند 37 درجة مئوية) في واحد أو أكثر القنوات على نفس ساترة.
  1. تنظيف وإعادة تدوير PDMS
    1. من أجل إعادة كتلة PDMS، وشطف القنوات ميكروفلويديك مع ~ 200 ميكرولتر من الايثانول 70٪ في معدل التدفق من 5 ميكرولتر / دقيقة. وأخيرا، ونضح الهواء عبر الأنابيب والقنوات.
    2. فصل PDMS كتلة بلطف من ساترة عن طريق الضغط عليه قليلا. وضعه على قطعة نظيفة من رقائق الألومنيوم. تخزينها في مجفف فراغ. ويمكن إعادة استخدامها عدة مرات.
    3. لتنظيف أكثر شمولا شطف القنوات مع المنظفات أو محلول هيدروكسيد الصوديوم قبل 70٪ من الإيثانول. بدلا من ذلك، إزالة جميع الأنابيب جيئة وذهابا م في PDMS ويصوتن كتلة لمدة 30 دقيقة في الأيزوبروبانول، قبل التجفيف وإدخال أنابيب جديد.

5. سيارات الدفع الرباعي SBL فيوجن الفحص لمراقبة الدهن والمحتوى الإصدار في وقت واحد

  1. لرصد اللون المزدوج من الدهون في وقت واحد ومحتويات قابلة للذوبان الإفراج عنهم، اتبع نفس الخطوات كما في الباب 4، باستثناء الجسيمات الشحمية استخدام المسمى مع كل من الدهن (لم) ومحتويات قابلة للذوبان (SRB) التسمية، كما هو موضح في القسم مغلفة 3. تعتبر الدار في 10 ملي وفي البداية عالية مروي النفس.
  2. باستخدام التكوين أظهرت تخطيطي في الشكل (4)، تثير SRB ولم مضان في وقت واحد باستخدام 561 نانومتر و 638 نانومتر ليزر، على التوالي. مرآة مزدوج اللون (640 نانومتر) انشقاقات انبعاث إلى شعاعين التي تعمل من خلال مسافة قصيرة (595/50 نانومتر) وطويل فلتر (700/75 نانومتر) الطول الموجي للكشف عن SRB ولم الانبعاثات، على التوالي. ومن المتوقع الحزم الانبعاثات اثنين جنبا إلى جنب على رقاقة EM-CCD.
jove_title "> 6. تحليل البيانات

  1. تحليل البيانات FRAP
    1. استخدام برنامج MATLAB المنصوص عليها في معلومات تكميلية لتقدير معامل الدهون نشرها، D. يقرأ البرنامج قائمة من الملفات OME-TIFF 49، بالكشف عن منطقة المبيض، المؤامرات القيم متوسط ​​بكسل في منطقة المبيض بوصفها وظيفة من الوقت، ويناسب منحنى الانتعاش مما أدى إلى نموذج من Soumpasis 50 لاستخراج وقت الانتعاش، المعادلة 1 حيث ث هو نصف قطر الدائرة ابيض.
      ملاحظة: تم توفير برنامج MATLAB في وقت سابق 25 لتحليل الأفلام FRAP باستخدام ملفات نيكون ND2. يقرأ البرنامج الحالي OME-TIFF ملفات 49، وذلك لأن معظم صيغ الملفات يمكن بسهولة تحويلها إلى OME-TIFF. تحليل كمي لبيانات FRAP هو أسهل وأكثر دقة عندما تبيض غير لحظية، وbleacالمنطقة هد هي عبارة عن دائرة، وتبيض خلال قراءة من لا يكاد يذكر. على الرغم من أن هذه المعايير غير راض بدقة في القياسات FRAP بسيطة الموصوفة هنا، وهو تقدير معقول للمعامل الانتشار ويمكن الحصول على. لتقدير أكثر دقة، استخدم تتبع الأصباغ الدهن واحدة (القسم 6.3).
  2. تحليل معدل لرسو السفن، ومعدل الانصهار وأوقات تأخير لرسو السفن إلى الانصهار
    1. استخدام يماغيج لفتح فيلم لتحليل وضبط السطوع والتباين على تحديد واضح لرسو السفن الحويصلة ودمج الأحداث. بدء تشغيل البرنامج المساعد SpeckleTrackerJ 26. يرى سميث وآخرون. 26 وعلى شبكة الإنترنت ثائق SpeckleTrackerJ للحصول على الإرشادات للاستخدام.
    2. التعرف على جميع سيارات الدفع الرباعي رست مؤخرا في SpeckleTrackerJ. للتمييز بين سيارات الدفع الرباعي التي ترسو بإحكام من تلك التي ترتد من سيمبول تكنولوجيز، فرض مدة رسو السفن الحد الأدنى من عدد قليل من الإطارات. حفظ المسارات، وأكرر لجميع الأفلام.
      ملاحظة: للحصول على وثيقةمعدل ملك، كل ما يهم هو تحديد عندما رست سيارات الدفع الرباعي، وذلك فقط في الإطار الأول فيها سيارات الدفع الرباعي رست احتياجات ليتم تسجيلها في هذه المسارات. لن تؤخذ بقية المسارات بعين الاعتبار في التحليل. ومع ذلك، لصناعة السيارات في تتبع كل سيارات الدفع الرباعي حتى التبييض أو الصمامات يساعد سيارات الدفع الرباعي العلامة التي تم تتبعها بالفعل.
    3. تحديد جميع الحويصلات التفجير. لهذه، ينبغي أن يشمل جميع المسارات لقطة من الإطار الأول رست سيارات الدفع الرباعي حتى الإطار الأول الذي الانصهار هو واضح من زيادة مفاجئة في مضان من بقعة تتبعها. وتستخدم هذه المدد من هذه المسارات لحساب التأخير لرسو السفن إلى الانصهار. حفظ جميع المسارات. أكرر للجميع الأفلام.
    4. لتحليل مجموعة من البيانات لرسو السفن أو الانصهار، تجميع قائمة من الملفات مساره من الأفلام ذات الصلة، وتشغيل البرامج MATLAB تزويد Karatekin وروثمان 25. اتبع الإرشادات التي يتم توفيرها جنبا إلى جنب مع البرامج.
      ملاحظة: برامج مؤامرة نائب الرئيسulative الالتحام والانصهار الأحداث بوصفها وظيفة من الزمن، استنادا إلى المعلومات المستخرجة من الملفات مسار. وتقدر معدلات الالتحام والانصهار من سفوح هذه المؤامرات. للحصول على بيانات الانصهار، كما يحسب التأخير لرسو السفن إلى الانصهار وتآمر توزيعها باعتباره مؤامرة البقاء على قيد الحياة، أي احتمال أن الاندماج لم يحدث حتى الان من جانب تأخير تعطى بعد لرسو السفن.
  3. الدهون الانتشارية
    1. لكل حدث الانصهار، وتتبع الدهون الفلورسنت واحدة عندما تصبح ملحوظ عندما يكون لديهم تنتشر بما فيه الكفاية بعيدا عن موقع الانصهار (الشكل 6). استخدام SpeckleTrackerJ لتتبع، وحفظ المسارات لمزيد من التحليل باستخدام MATLAB. اعتمادا على حجم الحويصلة الصمامات، وعادة ما يمكن تتبع 3-30 fluorophores واحدة. لأن مسارات أطول مرغوبة لحساب المعادلة 1 ، في محاولة لتعقب جزيئات واحدة طالماممكن، وذلك باستخدام التصحيح اليدوي للمسارات إذا لزم الأمر.
    2. حساب متوسط ​​تربيع النزوح (MSD) لاحد مسارات علامة الدهون التي تستمر> 40-50 الإطارات (حوالي ~ 1.5 ثانية). استخدام MSD لحساب معامل الدهون نشرها، المعادلة 1 . يرى سميث وآخرون. 26 وستراتون وآخرون. 27 لمزيد من التفاصيل.
  4. واحدة الدهون صبغ كثافة، سيارات الدفع الرباعي SBL عامل تخفيض كثافة، وحجم الحويصلة
    1. قياس مجموع القيم بكسل من علامة الدهون في بكسل 3 × 3 (خ 0.8 ميكرون 0.8 ميكرون) المنطقة المحيطة علامة ل~ 15 لقطة قبل وبعد التبييض علامة في خطوة واحدة. طرح كثافة خلفية بمعدل متوسط ​​على الإطارات بعد التبييض من شدة ما قبل التبييض المتوسط ​​قبل التبييض للحصول على كثافة علامة الدهون تتبعها. تكرار قياس العديد من علامات ممكن عمليا من أجل معين فيلم.
    2. رسم توزيع شدة التسمية الدهون واحد، المعادلة 1 ، وتناسب التمويه لتقدير متوسط.
    3. حساب تأخير بين وقت وقوع انصهار وعندما انتهى مسار علامة الدهون واحدة صدر في هذا الحدث في تبييض خطوة واحدة. الحصول على تبيض مرة لfluorophore في سيمبول تكنولوجيز، المعادلة 1 ، من خلال التآمر على وظيفة الناجين من التأخير والمناسب لالأسي.
      ملاحظة: نظرا لأن الاستقطاب الأزواج الحقل الإثارة أكثر ضعيفة إلى fluorophores على سيارات الدفع الرباعي، وتبيض مرة من سيارات الدفع الرباعي عادة ما يكون أبطأ بكثير (27).
    4. تقدير المعادلة 1 وعامل تخفيض كثافة لصبغ الدهون عندما تكون في سيارات الدفع الرباعي بالنسبة إلى عندما يكون في سيمبول تكنولوجيز، بعد ستراتون 27 (tp_upload / 54349 / 54349eq8.jpg "/> المعادلة 1 ومن شدة صبغة واحدة في SUV).
      ملاحظة: إذا كانت تبيض يكاد يذكر، المعادلة 1 سيكون مساويا لشدة رست المعادلة 1 يتم إيداع (النقطة (1) في الشكل 3A، اللوحة اليمنى)، مقسوما على كثافة الإجمالية التي تم التوصل إليها بعد كل fluorophores في سيمبول تكنولوجيز على الانصهار (خط متقطع وصفت المعادلة 1 في الشكل 3). ولكن نظرا لتبييض السريع في سيمبول تكنولوجيز، المعادلة 1 عادة لا يتم التوصل إليها وتقدير دقيق ل المعادلة 1 يتطلب تركيب حركية الافراج عن تعبير 27 التي مدفوع الكيجن على حد سواء المعادلة 1 (انظر 6.4.3) و المعادلة 1 . يتم توفير تعابير منفصلة في ستراتون وآخرون 27 للحالات حركية محدودة المسام ونشر الإصدار المحدود؛ أفضل الأحوال تناسب يختلف من حال إلى حال (انظر 6.5.1 لحالة حركية محدودة المسام).
    5. حساب مساحة الحويصلة عن الأحداث الفردية من 27 المعادلة 1 ، أين المعادلة 1 هي كثافة سيارات الدفع الرباعي رست، المعادلة 1 هو يعني كثافة من صبغة الدهون واحد في سيمبول تكنولوجيز، المعادلة 1 هو عامل تخفيض كثافة لصبغ الدهون عندما يكون في سيارات الدفع الرباعي بالنسبة إلى عندما يكون في سيمبول تكنولوجيز، وأوجه 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54349 / 54349eq12.jpg "/> هو كثافة المساحي المعروف الأصباغ الدهون.
  5. خصائص الانصهار المسام
    1. على افتراض الإفراج غير محدودة المسام، وتناسب حركية الإفراج عن العلامة الدهون إلى 27 المعادلة 1 ، أين المعادلة 1 هي كثافة سيارات الدفع الرباعي رست قبل الانصهار وكما هو معرف معلمات أخرى في وقت سابق. استخدام قيمة المعادلة 1 تم الحصول عليها في 6.4.3 كمعلمة ثابتة، واستخراج أفضل تناسب تقديرات ل المعادلة 1 و المعادلة 1 .
    2. تقدير جزء من الوقت المسام مفتوحة، ف 0، ومن المقرر أن المسام الخفقان 27 افتراض التخلف الإفراج الدهون:60. المعادلة 1 = المعادلة 1 حيث A فيس هي المنطقة الحويصلة (القسم 6.4.5)، (ب) هو ارتفاع المسام (عادة المتخذة ليكون ~ 15 نانومتر)، ص ص ≈ 3 نانومتر هو نصف قطر المسام فعالة كما يراها التسميات الدهون نشرها ويتضمن نصف سمك طبقة ثنائية (~ 2 نانومتر)، المعادلة 1 هو انتشارية الدهون (محسوبة في 6.3)، و المعادلة 1 هو الوقت المناسب لنسبة الدهون في أن يصدر من سيارات الدفع الرباعي في سيمبول تكنولوجيز (من 6.5.1).
    3. لتأكيد أن الاسمية ف 0> 1 إلى المسام مفتوحة بالكامل، ف 0 = 1، تناسب دوام كثافة إلى المعادلة 4 من ستراتون وآخرون. 27، حركية وتوقع لالمسام مفتوحة بشكل دائم. وينبغي أن يكون هذا مناسبا أفضل من fittinز التعبير في 6.5.1 لالمسام مفتوحة بشكل دائم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الجودة SBL

ومن الأهمية بمكان للتحقق من جودة وسيولة من سيمبول تكنولوجيز قبل التجربة الانصهار. يجب أن يكون مضان في الجانب السفلي، والزجاج من قناة ميكروفلويديك موحد، من دون أي عيوب واضحة. إذا مرت فقاعة الهواء على الرغم من أن قناة، فإنه عادة ما يترك ندوبا واضحة على SBL. إذا كان هناك مثل هذه الندوب الكبيرة الحجم / العيوب، لا تستخدم هذه القناة. في بعض الأحيان قد سيارات الدفع الرباعي الالتزام على الركيزة لكنه يفشل في انفجار وتشكيل SBL المستمر. إذا كان هذا هو الحال، مضان قد لا تزال تظهر موحد للغاية، ولكن لن يتعافى بعد التبييض منطقة صغيرة. إدخال 10 ملي المغنيسيوم 2+ غالبا ما يساعد حل هذه المسألة. ويمكن إدخال عوامل أخرى للمساعدة في انفجار سيارات الدفع الرباعي، مثل الكاتيونات الأخرى ثنائي التكافؤ 51، حل البوليمر 52، أو صدمة التناضحي 25.

her.within الصفحات = "1"> وحتى عندما مضان غير متجانسة إلى حد كبير، وأنه يتعافى بعد التبييض، قد تبقى بعض سيارات الدفع الرباعي غير مدمجة سليمة على السطح. سوف تظهر مثل هذه الجسيمات الشحمية بمثابة نقطة مضيئة إذا كانت كبيرة بما فيه الكفاية. بعد تبيض منطقة تحتوي على مثل هذه الجسيمات الشحمية، النقاط المضيئة سابقا بدوره الظلام وتبقى هكذا، مع انتعاش مضان في SBL المحيطة بها، ولكن ليس في الجسيمات الشحمية سليمة. هذه الجسيمات الشحمية سليمة لا تؤثر قياسات الاندماج، شريطة كثافتها منخفضة.

التغيرات في درجات الحرارة تسبب تغيرات في منطقة SBL لأن المنطقة المتوسطة من الدهون المحتلة تعتمد على درجة الحرارة. يمكن زيادة درجة الحرارة أو خفضه بنسبة 5-10 درجة مئوية أو أكثر يؤدي في منطقة الزائدة الذهاب إلى أنابيب ينبثق من السطح، أو البقع السوداء SBL خالية من الظهور على السطح، على التوالي 53. ولذلك فمن المهم للحفاظ على تغيرات درجة الحرارة إلى أدنى حد ممكن.

الآثار البيئية-together.within الصفحات = "1"> يتم عرض قياس FRAP نموذجي في الشكل (5) لSBL الذي كان نسبيا خالية من العيب والسوائل.

الرقم 5
الرقم 5. FRAP لفحص SBL سيولة. وهناك سلسلة من الصور تظهر مساحة مضيئة محددة بواسطة الحجاب الحاجز الحقل مغلقة (قطر 49 ميكرون) قبل (الإطار الأول) وبعد التبييض مع نبض الضوء القوي. وتصوير المنطقة في التعرض للضوء المنخفض لمتابعة انتعاش مضان عن طريق الانتشار من بنك دبي الوطني المسمى الدهون. ويظهر الرسم البياني مضان تطبيع بوصفها وظيفة من الوقت لعدة قنوات من coverslips مختلفة مما يدل على مستوى عال من استنساخ طريقة. وكان تكوين الدهن من تي SBL POPC: SAPE: DOPS: PI الدماغ (4،5) ف 2: الكولسترول PEG2000-مخدر: دبي الوطني-PE (54.9: 15: 12: 10: 3: 4.6: 0.5٪ الخلد ) وليرة لبنانية = 20000. كانت المنطقة التبييض 984،203 μم 3. كان الوقت الانتعاش ومعامل الانتشار تحسب من نوبة (انظر 6.1) τ = 67.3 ثانية وD = 1.99 ميكرون 2 / ثانية، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كشف أحادية اللون من الالتحام والانصهار الأحداث عن طريق تسمية الدهون

العد والفرز اليدوي لرسو السفن والانصهار أحداث مهمة شاقة كانت هناك حاجة 100-400 الأحداث في حالة لإحصاءات جيدة. منذ السيارات الرياضية متعددة الاستخدامات يمكن ان تتحرك على SBL قبل التفجير، هناك حاجة إلى تتبع البرامج. SpeckleTrackerJ 26 المساعد ليماغيج ديه الميزات التي تم تطويرها خصيصا لتتبع سيارات الدفع الرباعي لتحليل الالتحام والانصهار الأحداث. في كثير من الأحيان سوى جزء صغير من الحويصلات رست في نهاية المطاف الصمامات.لحساب معدل رسو السفن تحتاج لتعقبها من تلك التي تلتحم أو جزء فقط من الفيلم يحتاج إلى تحليل حتى يتم الكشف عن وجود عدد كاف من الأحداث لتقدير موثوق به العديد من السيارات الرياضية متعددة الاستخدامات. إذا كان التركيز الرئيسي هو معدل الانصهار و / أو التأخير لرسو السفن إلى الانصهار، فقط لا بد من تحديد وتتبع سيارات الدفع الرباعي التفجير.

بعد التأكد من نوعية SBL، يتم إدخال سيارات الدفع الرباعي في القنوات ومضان من هو متحمس بشكل مستمر تحت TIR باستخدام الضوء المستقطب الصورة. لالتجارب الأولية، قد تحتاج إلى تعديل لضبط عمق الاختراق من موجة زائل ينتج عن ذلك من زاوية السقوط من شعاع الإثارة TIR. ويرد واحد لرسو السفن سيارات الدفع الرباعي والانصهار الحدث تمثيلي في الشكل 6A. الحويصلة رست خلال إطار ملحوظ D وبدأ الانصهار في إطار F. بعد حوالي 1.3 ثانية (إطار S) وأصبحت نسبة الدهون في واحدة يمكن تمييز لأنها تنتشر بعيدا عن الانصهار الجلوسه. يتم رسم كثافة مضان الإجمالية (مجموع القيم بكسل) في كل مربع بوصفها وظيفة من الوقت في الشكل 6B، مع إطارات الذي الالتحام والانصهار حدث أشار. العدد التراكمي للأحداث الانصهار كما يتم رسم وظيفة من الزمن في الشكل 6C، لمدة خمسة أفلام مختلفة باستخدام تي فخ أعاد SBLs (تي SBL، ليرة لبنانية = 20000، حوالي 70 ر الافخاخ لكل متر مربع. ميكرون). تم احتساب معدل الانصهار من كل فيلم من نوبة خطية إلى المنحدر. ويظهر هذا متوسط ​​معدل الانصهار ± SEM مثل رسم بياني شريطي في لوحة D. وكان التأخير لرسو السفن إلى الانصهار للمثال هو مبين في الشكل 6A، B، 0.07 ثانية. ويظهر توزيع التأخير تحسب على نحو مماثل لما مجموعه 158 الأحداث في الشكل 6D باعتباره مؤامرة الناجين، أي احتمال أن الحويصلة رست لم تنصهر بعد في تأخير معين. حوالي 1/2 من هذه الحويصلات تنصهر ضمن 100 مللي ثانية. مع زيادة مستويات الكوليسترول في الدم، وتوزيع الطاقution من التأخير لرسو السفن إلى الانصهار يقصر، على الرغم من انتشار الدهون يبطئ 27.

ومن المهم لتشغيل تجارب السيطرة بشكل متواز. على نفس ساترة من التي تم الحصول عليها البيانات في الشكل 6B، D، تم اختبار الظروف تحكم في القنوات المجاورة. في قناة واحدة، فإن SBL لا تشمل أي تي الافخاخ. من 5 أفلام دائم 60 ثانية لكل منهما، وسجلت فقط 7 أحداث الانصهار مقارنة مع 158 عندما أدرجت-الافخاخ ر (الشكل 6C). في قناة أخرى، أدرج المجال حشوية القابلة للذوبان في الخامس كمين VAMP2 (CDV). CDV يربط تي الافخاخ على سيمبول تكنولوجيز، ومنع ملزم من VAMP2 طول الكامل الذي هو على سيارات الدفع الرباعي. في خمسة أفلام 60 ثانية، تم الكشف عن أي أحداث الانصهار في وجود CDV (الشكل 6C).

الشكل (6)
الشكل (6). سيارات الدفع الرباعي SBL الالتحام والانصهار الأحداث. (A) سلسلة من الصور لحدث الانصهار الخامس سيارات الدفع الرباعي مع تي SBL تصويرها من قبل pTIRF المجهر بعد انتشار LR-PE. تؤخذ الصور كل 18 ميللي ثانية، فقط يتم عرض كل إطار الثاني. D و F بمناسبة بداية الالتحام والانصهار، على التوالي. أصبحت علامة مميزة الدهون الفردية يمكن تحديدها كما نشر بعيدا عن موقع الانصهار وآخر (S). أبعاد الإطار: 16.7 ميكرون س 16.7 ميكرون. (ب) شدة الإسفار بوصفها وظيفة من الوقت لهذا الحدث الانصهار هو مبين في الفقرة (أ). (ج) عدد التراكمي للأحداث الانصهار بوصفها وظيفة من الوقت لالخامس سيارات الدفع الرباعي وصفت مع فعل من مجموعة أخرى من التجارب. (د) معدل الانصهار تطبيع (يعني ± SEM، SX ميكرون 2 × PM SUV) -1، على افتراض 2 × 10 4 الدهون في سيارات الدفع الرباعي و (E) احتمال البقاء على قيد الحياة لفترة معينة بعد التحام الحويصلة. تكوين لجميع SBوكانت ليرة سورية POPC: SAPE: DOPS: PI الدماغ (4،5) ف 2: الكولسترول PEG2000-مخدر: دبي الوطني-PE (54.9: 15: 12: 10: 3: 4.6: 0.5 الخلد٪) وليرة لبنانية = 20000. وكانت تتألف الخامس سيارات الدفع الرباعي من POPC: SAPE: DOPS: الكولسترول: PEG2000-مخدر: LR-PE (57.4: 15: 12: 10: 4،6: 1 الخلد٪) وليرة لبنانية = 200 A و B. على CE، الخامس كان تكوين -SUV مماثل، باستثناء هل كان يستخدم بدلا من LR-PE. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الدهون الانتشارية، الحويصلة الحجم، والانصهار المسام خصائص

حساسية جزيء واحد من الفحص تتيح استخراج العديد من المعلمات بالإضافة إلى معدلات الالتحام والانصهار والتوزيعات تأخير لرسو السفن إلى الانصهار. تصبح واحدة، والدهون fluorescently المسمى ملحوظ كما نشر بعيدا عن موقع الانصهار (الشكل 6A). تتبع رذات المناظر تقدم مباشرة الدهون الانتشارية 26، المعادلة 1 ، والقياس الرقمي للمعدل تبيض لfluorophores في SBL 27. كما ذكر في مقدمة، والانبعاثات مضان من التسميات تختلف في سيارات الدفع الرباعي مقابل في سيمبول تكنولوجيز، بسبب ثلاثة عوامل هي بشكل عام من الصعب أن نفصل: (ط) dequenching من التسميات على الانصهار، ويرجع ذلك إلى التخفيف من عند نقلها إلى SBL ، (ب) وأعلى كثافة الإثارة في SBL بسبب اضمحلال مجال زائل الناتجة عن النقل البري الدولي، و (ج) توجه ثنائيات الاقطاب fluorophore الانتقال فيما يتعلق استقطاب شعاع الإثارة. حجم عامل (ب) يعتمد على الأحجام النسبية للزائل طول تسوس الميدانية وحجم الحويصلة وهو مختلف عن كل حدث الانصهار بسبب التبعثر في أحجام سيارات الدفع الرباعي. عامل (ج) يعتمد على fluorophore والاستقطاب المستخدمة. بدلا من محاولة دي sentangle هذه الآثار، يمكن للمرء أن قياس حجم التغيير مضان مباشرة بمقارنة إجمالي القيم بكسل في المنطقة المحيطة سيارات الدفع الرباعي قبل الانصهار وبعد كل fluorophores قد أودعت في SBL التالية الانصهار (الشكل 3A، (1) مقابل ( 2)). وخلافا للعمل السابق 29،44، وينبغي اختيار منطقة واسعة بما فيه الكفاية بحيث لا fluorophores سوف لم يقم ذلك عن طريق نشر للمرة يعتبر بعد الانصهار. اختيار المنطقة بكسل 30 × 30 (8 × 8 ميكرون ميكرون) لتحليل ما يصل الى 1.6 ثانية بعد الانصهار هو عادة كافية 27. تبيض تجاهل لحظة، ونسبة المعادلة 1 قبل وبعد الانصهار يوفر عامل مضان خفض كثافة، المعادلة 1 . ويمكن تقدير حجم الحويصلة نظرا لكثافة مضان من تسمية واحدة في سيمبول تكنولوجيز (ديزيل / ftp_upload / 54349 / 54349eq6.jpg "/>)، والعامل الذي شدته ستقل لو كانت في سيارات الدفع الرباعي ( المعادلة 1 )، وكثافة معروفة من التسميات في سيارات الدفع الرباعي، والمنطقة التي كتبها الدهن المحتلة. في الممارسة العملية، وتبيض عادة ما يكون سريعا بما فيه الكفاية أنه بحلول الوقت الذي تودع جميع علامات في سيمبول تكنولوجيز، والبعض الآخر ابيض بالفعل. لهذا السبب، لتقدير دقيق، وعامل مضان خفض كثافة، المعادلة 1 ، والافراج عن الوقت الدهون، المعادلة 1 ، وأفضل المستخرجة من يصلح لمدار الساعة من إجمالي قيم البكسل يأخذ بعين الاعتبار تبيض 27. ويقدر معدل تبييض التسميات في SBL بشكل مستقل من واحد تتبع صبغ الدهون، أو عن طريق تركيب والأسي إلى إجمالي ملف كثافة، المعادلة 1في بعض الأحيان طويلة (على سبيل المثال، النظام (3) في الشكل 3). معرفة حجم حويصلة الصمامات والانتشارية الدهون يسمح مقارنة بين الافراج عن الوقت الدهون الفعلي، المعادلة 1 ، إلى وقت الانتشار من الدهون حول الحويصلة المعادلة 1 حيث فيس A غير منطقة الحويصلة و المعادلة 1 هو انتشارية الدهون. إذا جداول مرتين قابلة للمقارنة، ويعرض المسام مقاومة تذكر لإطلاق الدهون، والإفراج محدودة الانتشار. في المقابل، إذا المعادلة 1 ، ثم المسام يؤخر بشكل كبير الدهون تغير مستمر. مقياس كمي لالتخلف هو "انفتاح المسام"، ف 0، أي ما يعادل نسبة المعادلة 1 مرات عامل سوحدة النظام و تتصل المسام الهندسة 27. لالدولتين، فتح / مغلقة المسام، ف 0 هي جزء من الوقت في حالة فتح. لمسام الخفقان الذي يختلف بشكل مستمر الحجم، ف 0 تمثل بلغ متوسط ​​وقت قريب دائرة نصف قطرها إلى دائرة نصف قطرها مفتوحة بالكامل.

نسبة الإشارة إلى الضوضاء يجب أن تكون جيدة بما فيه الكفاية لتتبع fluorophores الدهن واحدة. ويتحقق ذلك بسهولة أكبر في التجارب أحادية اللون، وذلك باستخدام علامة مشرقة مثل LR-PE.

كشف في وقت واحد من الدهون القابلة للذوبان وشحن الإصدار

ويرد الحدث ممثل في الشكل (7). وفي التركيزات العالية المستخدمة لتغليف ومضان SRB هو البداية مروي ذاتيا. ولذلك، فإن معظم رست الخامس سيارات الدفع الرباعي يمكن اكتشافها إلا من خلال فعل إشارتهم 27. زيادة حادةهل في مضان يمثل الدهون الاختلاط، كما هو الحال في أحادية اللون التجارب الدهون التسمية. بداية إطلاق الدهون وتزامن مع ظهور زيادة في مضان تعتبر الدار. وكانت هذه الزيادة على الأرجح بسبب dequenching SRB كما هرب الجزيئات تعتبر الدار سيارات الدفع الرباعي وتعتبر الدار الباقية تم تخفيفه إلى أقل من تركيزات التبريد الذاتي. ومن المثير للاهتمام، وصلت مضان تعتبر الدار هضبة مستقرة. إذا بقي المسام الانصهار مفتوحة، فإن للمرء أن يتوقع إشارة SRB لزيادة كحد أقصى بسبب dequenching، يتبعها انخفاض في الخلفية كما غادر تعتبر الدار الباقية سيارات الدفع الرباعي، أو إذا انهارت سيارات الدفع الرباعي في سيمبول تكنولوجيز. هضبة مستقرة على الأرجح يشير إلى المسام أعادت بعد إطلاق سراح جميع العلامات الدهون وجزء من البضائع القابلة للذوبان.

في بعض الحالات، لم تكن مصحوبة إشارة إطلاق الدهن من قبل أي محتويات كشف الافراج عن الإشارات. هذا يمكن أن يكون إما لأن المسام كانت صغيرة جدا للسماح بمرور العام للدار، أو بعضكيف سيارات الدفع الرباعي قد فقدت بالفعل حمولتها القابلة للذوبان. للتمييز بين هذين الاحتمالين، وتبيض من سيارات الدفع الرباعي رست يمكن تحليلها. تبييض التسمية الدهون لم يقلل إشارة مضان في غضون ثوان، في حين تبيض النتائج تعتبر الدار في البداية مروي النفس في زيادة في إشارة SRB ككسر من SRB هي الصور تحويلها إلى منتجات أخرى ويخلص التبريد الذاتي. في حين أن معظم سيارات الدفع الرباعي رست (48 من أصل 58 تحليل الأحداث) عرض الزيادة المتوقعة في مضان تعتبر الدار على مدى فترات طويلة من الإضاءة، لم جزء صغير (10/58) لا تظهر أي إشارات SRB على الإطلاق. وبالتالي، جزء صغير من سيارات الدفع الرباعي قد تفقد محتواها للذوبان خلال الفترة ما بين إعدادها واستخدامها في التجارب.

في أكثر من 80٪ من أحداث (74 من 91) التي يمكن أن يتبع كلا SRB وإشارات فعلت، مضان تعتبر الدار زاد وبقي في هضبة مستقرة 27. في ~ 20٪ من رالحالات ذات المناظر تم الإفراج عن مضان تعتبر الدار الباقية فجأة لبضع ثوان في وقت لاحق. هذا قد يكون إما نتيجة لإعادة فتح المسام والسماح السريع، والإفراج الكامل في غضون 1-2 إطارات (18-36 مللي ثانية) أو انفجار سيارات الدفع الرباعي بسبب تراكم الصور الضرر 16. أيا كان مصدره، وهذا الثاني، الإفراج السريع عن SRB يستبعد احتمال أن يكون إشارة SRB المتبقية بعد الإصدار الأولي قد يكون راجعا إلى SRB المتبقية شرك في الفضاء بين SBL والركيزة الزجاج بعد الإفراج الكامل. واقترح مثل هذه الآلية في دراسة سابقة حيث دعمت SBL مباشرة على الزجاج، مع مساحة صغيرة بين 16 اثنين. في المقابل، يتعين على الدهون مضاد للفيروسات المستخدمة في هذا الاختبار تقدم 4-5 نانومتر الفضاء بين SBL والزجاج 25، والسماح للSRB أن ينتشر بعيدا عن موقع الانصهار.

الشكل (6)
الرقم 7. Simultan eous الدهون وإطلاق المحتوى. إشارات الإسفار من الدهون (الأزرق)، والمحتوى (الحمراء) علامة لحدث الانصهار سيارات الدفع الرباعي سيمبول تكنولوجيز (لمزيد من التفاصيل انظر النص). وأظهرت لقطات من كل قناة في الجزء السفلي (4.0 ميكرون واسع). الرسوم (وسط) توضح المراحل المختلفة. (1) الاحواض سيارات الدفع الرباعي، لم مضان منخفض. (2) فيوجن يسمح بنقل هل في SBL ولم زيادات مضان. يزيد SRB إشارة أيضا يخلص التبريد الذاتي هروب العام للدار من خلال المسام. (3) لا تزال إشارة SRB بينما مستقرة لم جزيئات نشر ضمن SBL يشير إلى إعادة عزل ممكن من المسام. (4) إشارات SRB الانخفاض بسرعة جدا، بسبب الانصهار الكامل السريع أو انفجار الحويصلية. وكان تشكيل الخامس سيارات الدفع الرباعي POPC: SAPE: DOPS: PEG2000-مخدر: هل (67: 15: 12: 5: 1 الخلد٪)، LP 200، في حين كانت تتألف تي SBLs من POPC: SAPE: DOPS: PI الدماغ (4،5) ف 2: PEG2000-مخدر: دبي الوطني-PE (64.5: 15: 12: 3: 5: 0.5 الخلد٪) وليرة لبنانية = 20000. = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

FRAP_instructions.pdf - تعليمات لإنشاء تسلسل FRAP الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

ReadMe_FRAP.txt - ملف نص يصف الإجراء لتحليل البيانات الانتعاش FRAP باستخدام رمز ماتلاب التي يتم توفيرها الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

EK_FRAPbatch.m - ملف MATLAB لدفعة تحليل مضان الانتعاش بعد photobleaching من. ويدعو هذا الملف MATLAB الوظائف الفرعية EK_getFRAPvals.m وEK_SoumpassisFit.m."_blank"> اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

EK_getFRAPvals.m - ملف MATLAB، روتين دعا اليه EK_FRAPbatch.m الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

EK_SoumpassisFit.m - ملف MATLAB، روتين دعا اليه EK_FRAPbatch.m الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

JN150923c1_FRAP_list.txt - مثال على قائمة أسماء ليكون الى جانب السيناريو MATLAB الرئيسي EK_FRAPbatch.m-تحليل دفعة الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الالملفات التالية هي أكوام TIF وملفات النص المطابق لمدة خمسة أمثلة على تسلسل FRAP التي يمكن تحليلها عن طريق تشغيل EK_FRAPbatch.m واختيار ملف JN150923c1_FRAP_list.txt عندما يطلب منك اختيار قائمة ملف.

JN150923c1_F1_MMStack_Pos0.ome.tif - FRAP كومة صورة يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

JN150923c1_F1_MMStack_Pos0_metadata.txt - ملف نص المقابلة مع التعريف الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

JN150923c1_F2_MMStack_Pos0.ome.tif - FRAP كومة صورة ررتخفيف الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

JN150923c1_F2_MMStack_Pos0_metadata.txt - ملف نص المقابلة مع التعريف الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

JN150923c1_F3_MMStack_Pos0.ome.tif - FRAP كومة صورة يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

JN150923c1_F3_MMStack_Pos0_metadata.txt - ملف نص المقابلة مع التعريف الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

JN150923c1_F4_MMStack_Pos0.ome.tif - FRAP صورة المكدس. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

JN150923c1_F4_MMStack_Pos0_metadata.txt - ملف نص المقابلة مع التعريف الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

JN150923c1_F5_MMStack_Pos0.ome.tif - FRAP كومة صورة يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

JN150923c1_F5_MMStack_Pos0_metadata.txt - ملف نص المقابلة مع التعريف الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التنفيذ الناجح لفحص الانصهار سيارات الدفع الرباعي SBL الموصوفة هنا يعتمد بشكل كبير على عدة خطوات رئيسية، مثل إعادة الوظيفية للبروتينات إلى الجسيمات الشحمية، الحصول على SBLs ذات نوعية جيدة، واختيار المعلمات التصوير الصحيحة للكشف عن جزيئات واحدة. على الرغم من أنه قد يستغرق بعض الوقت والجهد للنجاح، مرة واحدة ويتم تنفيذ الفحص بنجاح، فإنه يوفر ثروة من المعلومات حول عملية الانصهار غير متوفرة من أي في المختبر الانصهار الفحص الأخرى التي نوقشت في مقدمة. المعدلات التي ترسو سيارات الدفع الرباعي على والصمامات مع سيمبول تكنولوجيز، وتوزيع الأوقات لرسو السفن إلى الانصهار، الانتشارية الدهون، وحجم كل الحويصلية الصمامات، وعما إذا كان الإفراج عن الدهون لحدث الانصهار معين هو diffusion- أو التي تسيطر عليها المسام يمكن كن مصمما. إذا الإفراج أبطأ بكثير مما كان متوقعا من نشرها، النموذج الذي يفترض المسام الخفقان يكمن وراء التخلف من عائدات الإفراج الدهون، ف 0، جزء من الوقت المسام طق مفتوحة خلال الانصهار 27.

الأعمال السابقة تحقق واحد سيارات الدفع الرباعي SUV الانصهار 18-20،28 أو مزيج من الجسيمات الشحمية والجزيئات الفيروسية لSBLs 15-17،21،22،33،44 تعتمد على الحنق والتبريد الذاتي بين جزيئات الصبغة. في المقابل، علينا أن نتجنب إلى حد كبير صبغ dequenching للتحقيق حركية الدهون نقل التسمية في سيمبول تكنولوجيز، وذلك لسببين. أولا، كفاءة الحنق هو مراسل غاية غير الخطية الإفراج الدهون. تغييرات طفيفة في أمور صبغ مسافة د نتيجة تغيرات كبيرة في كفاءة الحنق، ولكن فقط لعدد محدود من د / R 0 القيم، حيث R 0 هي المسافة فورستر. هذا هو، والفارق الزمني بين تخفيف الصبغة الفعلي والزيادة الملحوظة في إشارة dequenching قد تحدث، وذلك بسبب الوقت اللازم لأن ينخفض ​​إلى قيمة قريبة من R 0. وبالمثل، هناك تغير طفيف في إشارة dequenching مرة واحدة كثافة الصبغة تنخفض بما فيه الكفاية بعد الإفراج الدهون بحيث 0 greaterThan 1.4، حتى لو كمية كبيرة من صبغة لا يزال في الحويصلة. هذه الخصائص تجعل dequenching وسيلة جيدة للحصول على ارتفاع في إشارة للكشف عن أحداث الانصهار، ولكن تعقيد التحليل الحركي الكمي للإفراج الدهون باستخدام تحليل الأوان. في المقابل، تغيرات في شدة بسبب إعادة توجيه ثنائي القطب والآثار مجال زائل كما نقل fluorophore من سيارات الدفع الرباعي في SBL المتعلقة خطيا إلى جزء من الصبغة لا تزال قائمة في سيارات الدفع الرباعي. ثانيا، على تركيزات عالية من تسميات الدهون اللازمة للتبريد الذاتي قد يؤثر على عملية الاندماج نفسها.

لالإثارة TIRF الاستقطاب، والإعداد محلي الصنع كما في الشكل (4) فعالة من حيث التكلفة ويوفر سيطرة ممتازة على العقارات الاستقطاب. ومع ذلك، فإن الإعداد محلي الصنع وليس من الضروري، على الأقل بعض المجاهر TIRF التجارية تستخدم الإثارة الاستقطاب وقبالة الجاهزة للتتوفر اللونين حدات تقسيم الانبعاثات. تم استخدام المجهر التجارية التي تستخدم (PM) الألياف الحفاظ على الاستقطاب لزوجين ضوء الإثارة الاستقطاب الناشئة من الليزر في مجهر بنجاح سابقا 25-27. في مثل هذا الصك، والاستقطاب يمكن أن تكون استدارة ببساطة عن طريق تدوير PM إدخال الألياف إلى وحدة TIRF المجهر. في المقابل، قد تكون بعض الاجهزة تجارية أخرى توظف استقطاب الحزم الخائن في وحدة TIRF، إجراء تعديلات الاستقطاب أكثر صعبا أو مستحيلا. للأسف، غالبا ما تكون غير محددة الخصائص الاستقطاب للأنظمة التجارية. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان بالنسبة للمستخدمين الذين لا يريدون لبناء نظام محلي الصنع لمناقشة خصائص الاستقطاب ومحاولة وحدة العرض قبل الاستثمار في خيار تجاري معين.

يوفر مراقبة في وقت واحد من الدهون والإفراج البضائع القابلة للذوبان مزيد من المعلومات عن عملية الاندماج. ويبدو أن العديد من المسام لختم بعد releasing سوى جزء صغير من التسمية القابلة للذوبان مغلفة في سيارات الدفع الرباعي 27. وعادة ما يتم إطلاق سراح جميع التسميات الدهون في الوقت reseals المسام، لذلك تم إعادة عزل المسام لا اعتقد سابقا من رصد تحرر الدهون وحدها. حدث نقل الواقع ورصد الإفراج عن الدهون وحدها، كيسلينج وآخرون. 29 قد اقترح من الدهون وصفت في SBL عبر الانهيار السريع للغاية من الغشاء سيارات الدفع الرباعي كامل في سيمبول تكنولوجيز.

إعادة إغلاق المسام الانصهار بعد وحظ الإفراج الجزئي للمحتويات مسبقا في طبقة ثنائية التصحيح الانصهار مقايسة الحويصلية المربوطة. Rawle وآخرون. 54 مستعدة بقع طبقة ثنائية قائما بذاته التي كانت مصطفة على ساترة التي كتبها ~ 8 نانومتر الفواصل DNA طويلة. وبعد ذلك قدم الجسيمات الشحمية التي كان يقودها تهجين الحمض النووي تقارن الدهون واحدة الذين تقطعت بهم السبل التكميلية ترتكز على الجسيمات الشحمية والتصحيح الأغشية الانصهار إلى التصحيح طبقة ثنائية. وكانت 12٪ من جميع الأحداث اندماج عابرة، مما أدى جزئياالافراج عن الاتحاد العالمي للتعليم لمحتويات الحويصلية. كانت الحويصلية انفجار الأحداث، وينظر في بعض المقايسات الانصهار سيارات الدفع الرباعي SBL السابقة 44، نادرة جدا. واقترح الباحثون أن ~ 8 نانومتر الفضاء تحت التصحيح طبقة ثنائية، ومنع التفاعلات طبقة ثنائية الركيزة، قد سمحت نقل غير المتسرب من محتويات الحويصلية إلى الفضاء تحت طبقة ثنائية. وبالإضافة إلى ذلك، لم تعرقل نشر الملصقات القابلة للذوبان صدر بشكل كبير في الفضاء بين طبقة ثنائية مستو والركيزة الزجاج. في مقايسة الموصوفة هنا، طبقة ثنائية مستو وكذلك أبقى ~ 5 نانومتر بعيدا عن ساترة عن وجود بولي (جلايكول الإثيلين) تقارن -lipid.

المعلومات الإضافية المقدمة من خلال رصد وهما لونا من البضائع القابلة للذوبان والدهون يأتي مع بعض المقايضات. أولا، إعداد السيارات الرياضية متعددة الاستخدامات مع تسميات اثنين إلى حد ما أكثر تعقيدا من بما في ذلك بطاقات الدهون وحدها. ثانيا، هناك بعض الخسائر الحتمية للإشارة إلى الضوضاء عند رصد إشارات من التسميات الدهون في تيانه نفس المعدل اكتساب كما هو الحال في أحادية اللون تجارب إطلاق الدهون (15-20 مللي ثانية في الإطار). بعض من هذه الخسارة ويرجع ذلك إلى حقيقة أن فعلت ذلك، تستخدم تسمية الدهون جنبا إلى جنب مع علامة SRB القابلة للذوبان، ليست مشرقة كما LR-PE المستخدمة في التجارب أحادية اللون. خسائر إضافية ناتجة عن ارتفاع الخلفية نظرا لفي وقت واحد الإثارة يومين الليزر ومكونات إضافية في مسار بصري (الشكل 4). وحتى الآن، وانخفاض الضوضاء إشارة إلى منعنا من تتبع موثوق بها من احد لم التسميات في التجارب اللونين. وهذا بدوره يمنع إجراء تحليل دقيق لاستخراج جميع المعلومات التي يمكن أن تكون مع واحد اللون القياسات LR-PE. ويمكن التغلب على هذا التحدي في المستقبل عن طريق تحسين شروط اكتساب واختبار أزواج أخرى من التسميات المتوافقة مع خصائص محسنة.

مراقبة في وقت واحد من الافراج عن البضائع القابلة للذوبان والدهون يمكن أيضا الكشف عن hemifusion، وهي الدولة التي لم تنصهر منشورات الداني، ولكن القاصيمنشورات لم تفعل ذلك. في الواقع، يمكن أن توفر مثل هذه التجارب اللونين تقييم قاطع الوحيد من وجود hemifusion في الآخر في فحوصات المختبر الانصهار 18،20. ومع ذلك، يمكن أن يعتمد عليه يتم الكشف عن hemifusion في أحادية اللون سيارات الدفع الرباعي SBL الإفراج مراقبة التجارب الدهون وحدها 22،44. في مثل هذه التجارب، حوالي 1/2 كثافة التسمية الدهون الأولية من سيارات الدفع الرباعي تبقى في بقعة الانصهار. قد تختفي كثافة المتبقية عند الصمامات منشورات البعيدة بعض الوقت في وقت لاحق، إذا كانت البقعة لم ابيض حتى الان.

استخدام الدهون مضاد للفيروسات لتقديم وسادة لينة بين SBL والدعم الزجاج كان أساسيا في إعادة إنتاج شرط SNAP25 من إيماس. نتائج البروتوكول في الربط فرشاة تغطية جانب من سيمبول تكنولوجيز التي تواجه قناة تدفق كذلك. هذه بعض الفوائد، مثل الحد من التفاعلات غير محددة بين سيارات الدفع الرباعي وSBL، كما هو موضح في مقدمة. إذا البروتينات التي تتفاعل مع الدهون الفوسفاتية منوقدم SBL في الفحص، ومع ذلك، فإن فرشاة PEG سيشكل عقبة الفراغية ضد هذه التفاعلات. وهكذا، بالنسبة لبعض التطبيقات، فإنه سيكون من المرغوب فيه لتشمل طبقة الربط غير متماثلة، فقط بين SBL وساترة الزجاج. ان الجانب من سيمبول تكنولوجيز التي تواجه قناة تدفق تكون قادرة على التفاعل مع فوسفورية ملزم البروتينات، مثل synaptotagmin ذلك الحين. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق استخدام سلاسل PEG ثنائية الفنية التي يمكن أن تكون مرتبطة تساهميا إلى ساترة في نهاية واحدة ويحمل مرساة الدهون في الطرف الآخر. ويمكن بعد ذلك أساليب انجميور-بلودجيت استخدامها لإيداع أحادي الطبقة الدهون على طبقة PEG 55. الجسيمات الشحمية قدم فوق هذا الفتيل سطح مسعور معها، وتشكيل طبقة ثنائية 56. ومن المؤمل أن هذا النهج سوف تكون مجتمعة مع على microfluidics في المستقبل.

ومن المتوقع أن فحص سيارات الدفع الرباعي SBL المقدمة هنا سيكون مفيدا في استكشاف دور البروتينات الإضافية التي تتفاعل مع الافخاخ،مثل الأسرة Munc18 / Sec1، واستشعار الكالسيوم synaptotagmin-1، وcomplexin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Milli-Q (MQ) water Millipore
KOH J.T. Baker 3040-05
Ethanol 190 Proof Decon
Isopropanol Fisher Chemical A416P4
HEPES AmericanBio AB00892
Sodium Cholride (KCl) AmericanBio AB01915
Dithiothreitol AmericanBio AB00490
N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) AmericanBio AB00892
EGTA Acros Organics 409911000
Buffers
HEPES-KOH buffer (pH 7.4) 25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 μM EGTA, 1 mM DTT
Solvents
Chloroform  J.T. Baker 9180-01 in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Methanol J.T. Baker 9070-03 in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Liposome preparation
Gastight Hamilton syringe Hamilton var. sizes only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)
Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm screw cap culture tube Pyrex  70825-16 clean thoroughly, rinse with chloroform
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC) Avanti Polar Lipids 850457 Lipids come dissolved in CHCl3 or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 °C. Keep stocks in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at -20 °C. let come to RT before opening
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS) Avanti Polar Lipids 840035 Same as above.
1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE) Avanti Polar Lipids 850804 Same as above.
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2 Avanti Polar Lipids 840046 Same as above.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE Avanti Polar Lipids 810145 Same as above.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE Avanti Polar Lipids 880130 Same as above.
cholesterol (ovine wool, >98%) Avanti Polar Lipids 700000 Same as above.
DiD' oil; DiIC18(5) oil (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate) Molecular Probes D-307
Rotavapor R-210 Buchi R-210 heat bath above Tm of lipids used
OG n-Octyl-β-D-Glucopyranoside Affymetrix 0311 store at -20 °C, let come to RT before opening
Shaker - Eppendorf Thermomixer R Eppendorf
Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20k MWCO, 3 ml life technologies 66003
Bio-Beads SM-2 Adsorbents Bio-Rad 1523920
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma-Aldrich D1556
Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm Beckman Coulter 41121703
Beckman SW41 Ti rotor
SuflorhodamineB Molecular Probes S-1307
Econo-Column Chromatography Columns, 2.5 × 10 cm Bio-Rad 7372512
Sepharose CL-4B GE Healthcare 17-0150-01
SYPRO Orange Protein Gel Stain Molecular Probes S-6650 5,000x Concentrate in DMSO
PDMS block
Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS Dow Corning 3097358-1004
Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover Corning 3160-152
Hole puncher - Reusable Biopsy Punch, 0.75 mm World Precision Instruments 504529
Manual Hole Punching Machine  SYNEO MHPM-UNV
Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch SYNEO CR0350265N20R4 drill diameter: 0.9 mm, punch bore size: 0.74 mm
Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD Cole-Parmer 06419-00 0.010" ID, 0.030" OD
Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD Cole-Parmer 95802-00 0.020" ID, 0.083" OD
Cover glass - cleanroom cleaned
Schott Nexterion cover slip glass D Schott 1472305
plasma cleaner Harrick PDC-32G
pTIRF setup and accessories
IX81 microscope body Olympus IX81
EM CCD camera Andor ixon-ultra-897
Thermo Plate, heated microscope stage Tokai Hit MATS-U52RA26
1 ml hamilton glass syringes (4x) Hamilton 81365
syringe pump kd Scientific KDS-230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sudhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323, 474-477 (2009).
  2. Wickner, W., Schekman, R. Membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 658-664 (2008).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 690-698 (2008).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 631-643 (2006).
  5. Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. The fusion pore. Biochim Biophys Acta. 1641, 167-173 (2003).
  6. Staal, R. G., Mosharov, E. V., Sulzer, D. Dopamine neurons release transmitter via a flickering fusion pore. Nat Neurosci. 7, 341-346 (2004).
  7. Wu, Z., et al. Nanodisc-cell fusion: Control of fusion pore nucleation and lifetimes by SNARE protein transmembrane domains. Sci. Rep. 6, 27287 (2016).
  8. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Ann Rev Physiol. 75, 393-422 (2013).
  9. Rossetto, O., Pirazzini, M., Montecucco, C. Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights. Nature Rev Microbiol. 12, 535-549 (2014).
  10. Weber, T., et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  11. Nickel, W., et al. Content mixing and membrane integrity during membrane fusion driven by pairing of isolated v-SNAREs and t-SNAREs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 12571-12576 (1999).
  12. McNew, J. A., et al. Compartmental specificity of cellular membrane fusion encoded in SNARE proteins. Nature. 407, 153-159 (2000).
  13. Melia, T. J., You, D. Q., Tareste, D. C., Rothman, J. E. Lipidic antagonists to SNARE-mediated fusion. J Biol Chem. 281, 29597-29605 (2006).
  14. Hernandez, J. M., et al. Membrane fusion intermediates via directional and full assembly of the SNARE complex. Science. 336, 1581-1584 (2012).
  15. Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7311-7316 (2004).
  16. Bowen, M. E., Weninger, K., Brunger, A. T., Chu, S. Single molecule observation of liposome-bilayer fusion thermally induced by soluble N-ethyl maleimide sensitive-factor attachment protein receptors (SNAREs). Biophys J. 87, 3569-3584 (2004).
  17. Liu, T., Tucker, W. C., Bhalla, A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. SNARE-driven, 25-millisecond vesicle fusion in vitro. Biophys J. 89, 2458-2472 (2005).
  18. Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19731-19736 (2006).
  19. Diao, J., et al. A single-vesicle content mixing assay for SNARE-mediated membrane fusion. Nat Commun. 1, 1-6 (2010).
  20. Kyoung, M., et al. In vitro system capable of differentiating fast Ca2+-triggered content mixing from lipid exchange for mechanistic studies of neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E304-E313 (2011).
  21. Domanska, M. K., Kiessling, V., Stein, A., Fasshauer, D., Tamm, L. K. Single vesicle millisecond fusion kinetics reveals number of SNARE complexes optimal for fast SNARE-mediated membrane fusion. J Biol Chem. 284, 32158-32166 (2009).
  22. Kreutzberger, A. J., Kiessling, V., Tamm, L. K. High Cholesterol Obviates a Prolonged Hemifusion Intermediate in Fast SNARE-Mediated Membrane Fusion. Biophys J. 109, 319-329 (2015).
  23. Schwenen, L. L., et al. Resolving single membrane fusion events on planar pore-spanning membranes. Sci Rep. 5, 12006 (2015).
  24. Karatekin, E., et al. A fast, single-vesicle fusion assay mimics physiological SNARE requirements. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3517-3521 (2010).
  25. Karatekin, E., Rothman, J. E. Fusion of single proteoliposomes with planar, cushioned bilayers in microfluidic flow cells. Nat Protoc. 7, 903-920 (2012).
  26. Smith, M. B., et al. Interactive, computer-assisted tracking of speckle trajectories in fluorescence microscopy: application to actin polymerization and membrane fusion. Biophys J. 101, 1794-1804 (2011).
  27. Stratton, B. S., et al. Cholesterol Increases the Openness of SNARE-mediated Flickering Fusion Pores. Biophysical journal. 110, (2016).
  28. Diao, J., et al. Synaptic proteins promote calcium-triggered fast transition from point contact to full fusion. Elife. 1, e00109 (2012).
  29. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophys J. 99, 4047-4055 (2010).
  30. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  31. Washbourne, P., et al. Genetic ablation of the t-SNARE SNAP-25 distinguishes mechanisms of neuroexocytosis. Nat Neurosci. 5, 19-26 (2002).
  32. Diaz, A. J., Albertorio, F., Daniel, S., Cremer, P. S. Double cushions preserve transmembrane protein mobility in supported bilayer systems. Langmuir. 24, 6820-6826 (2008).
  33. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
  34. Albertorio, F., et al. Fluid and air-stable lipopolymer membranes for biosensor applications. Langmuir. 21, 7476-7482 (2005).
  35. Daniel, S., Albertorio, F., Cremer, P. S. Making lipid membranes rough, tough, and ready to hit the road. Mrs Bulletin. 31, 536-540 (2006).
  36. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337, 1340-1343 (2012).
  37. Kenworthy, A. K., Hristova, K., Needham, D., Mcintosh, T. J. Range and Magnitude of the Steric Pressure between Bilayers Containing Phospholipids with Covalently Attached Poly(Ethylene Glycol). Biophys J. 68, 1921-1936 (1995).
  38. Knoll, W., et al. Solid supported lipid membranes: New concepts for the biomimetic functionalization of solid surfaces. Biointerphases. 3, Fa125-Fa135 (2008).
  39. Quinn, P., Griffiths, G., Warren, G. Density of newly synthesized plasma membrane proteins in intracellular membranes II. Biochemical studies. J Cell Biol. 98, 2142-2147 (1984).
  40. Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence. Biophys J. 77, 2266-2283 (1999).
  41. Johnson, D. S., Toledo-Crow, R., Mattheyses, A. L., Simon, S. M. Polarization-controlled TIRFM with focal drift and spatial field intensity correction. Biophys J. 106, 1008-1019 (2014).
  42. Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM. J Cell Biol. 188, 415-428 (2010).
  43. Axelrod, D. Carbocyanine dye orientation in red cell membrane studied by microscopic fluorescence polarization. Biophys J. 26, 557-573 (1979).
  44. Wang, T., Smith, E. A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. Lipid mixing and content release in single-vesicle, SNARE-driven fusion assay with 1-5 msec resolution. Biophys J. 96, 4122-4131 (2009).
  45. Chernomordik, L. V., Frolov, V. A., Leikina, E., Bronk, P., Zimmerberg, J. The pathway of membrane fusion catalyzed by influenza hemagglutinin: restriction of lipids, hemifusion, and lipidic fusion pore formation. J Cell Biol. 140, 1369-1382 (1998).
  46. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127, 831-846 (2006).
  47. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
  48. Scott, B. L., et al. Liposome fusion assay to monitor intracellular membrane fusion machines. Methods Enzymol. 372, 274-300 (2003).
  49. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
  50. Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys J. 41, 95-97 (1983).
  51. Ohki, S. A mechanism of divalent ion-induced phosphatidylserine membrane fusion. Biochim Biophys Acta. 689, 1-11 (1982).
  52. Berquand, A., et al. Two-step formation of streptavidin-supported lipid bilayers by PEG-triggered vesicle fusion. Fluorescence and atomic force microscopy characterization. Langmuir. 19, 1700-1707 (2003).
  53. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys J. 47, 105-113 (1985).
  54. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophys J. 101, L37-L39 (2011).
  55. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Reconstituted syntaxin1a/SNAP25 interacts with negatively charged lipids as measured by lateral diffusion in planar supported bilayers. Biophys J. 81, 266-275 (2001).
  56. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of Supported Planar Bilayers by Fusion of Vesicles to Supported Phospholipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 1103, 307-316 (1992).

Tags

علم الأعصاب، العدد 114، غشاء الانصهار والبروتينات الفخ، دهن طبقة ثنائية، proteoliposomes، بدعم طبقة ثنائية، واحد الانصهار الحويصلة، والانصهار المسام، إيماس، جزيء واحد مضان، على microfluidics، TIRFM، الفيزياء الحيوية
فيوجن بوساطة كمين لواحدة Proteoliposomes مع طبقات ثنائية المدعومة المربوطة في خلية ميكروفلويديك تدفق رصدت من قبل المستقطبة TIRF المجهري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nikolaus, J., Karatekin, E.… More

Nikolaus, J., Karatekin, E. SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (114), e54349, doi:10.3791/54349 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter