SNARE-mediert Fusion Single Proteoliposomes med tethered Støttede bilagene i en mikrofluid Flow Cell overvåkes av polarisert TIRF Mikroskopi

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å detektere enkelt, skarptromme-mediert fusjonshendelser mellom liposomer og støttet bilagene i microfluidic kanaler ved hjelp av polarisert TIRFM, med enkelt molekyl følsomhet og ~ 15 ms tidsoppløsning. Lipid og løselig last utgivelsen kan oppdages samtidig. Liposomstørrelseforandringer, lipid diffusivitet, og fusion pore egenskaper måles.

Abstract

I allestedsnærværende fremgangsmembranfusjon åpningen av et fusjons pore etablerer den første forbindelse mellom to tidligere adskilte rom. Under neurotransmitter eller hormon utgivelse via eksocytose, kan fusjon pore forbigående åpne og lukke gjentatte ganger, som regulerer lastefrigjøringskinetikk. Pore ​​dynamikk også bestemme modus for vesikkel resirkulering; irreversible forseglingsegenskaper resultater i forbigående, "kiss-and-run" fusion, fører mens utvidelse til full fusjon. For bedre å forstå hvilke faktorer som styrer pore dynamikk, har vi utviklet en analyse for å overvåke membran fusjon ved hjelp av polarisert total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi med enkelt molekyl følsomhet og ~ 15 ms tidsoppløsning i en biokjemisk veldefinert in vitro system. Fusjon av fluorescensmerkede små unilamellære vesikler som inneholder v-SNARE-proteiner (v-SUV) med en plan bilags peiling t-snarer, støttet på en myk polymer pute (t-SBL, t-støttet bilags), Blir overvåket. Analysen bruker microfluidic strømningskanaler som sikrer minimal prøve forbruket samtidig leverer en konstant tetthet av SUVer. Utnyttelse den raske signalforsterkning ved overføring av lipid etiketter fra SUV til SBL under fusjon, er kinetikk av lipid dye transfer overvåkes. Sensitiviteten av TIRF mikros tillater relativ enkle lipid fluorescerende merkelapper, fra hvilken lipid diffusivitet og SUV størrelse kan utledes for hver fusjon arrangement. Lipid fargestoff utgivelsen tider kan være mye lengre tid enn forventet for uhindret passasje gjennom permanent åpne porene. Ved hjelp av en modell som foruts retardasjon av lipid utgivelsen skyldes pore flimring, en pore "åpenhet", brøkdel av tiden pore forblir åpen under fusjon, kan estimeres. Et løselig markør kan være innkapslet i SUVer for samtidig overvåkning av lipid og løselig last utgivelse. Slike målinger angir noen porer kan forsegles på nytt etter å ha mistet en del av det løselige last.

Introduction

Membran fusion er en universell biologisk prosess som kreves for intracellulær trafficking av lipider og proteiner, sekresjon, gjødsling, utvikling, og innhyllet virus oppføring i vertsorganismer ^1-3. For de fleste intracellulær fusjon reaksjoner inkludert frigjøring av hormoner og signalstoffer via eksocytose, er energi å fusjonere to lipidbilagene levert av dannelsen av en fire-heliksbunt mellom beslektet løselig N-etylmaleimid sensitiv faktor vedlegg protein reseptor (Snare) proteiner, forankret i vesikkel (v-SNARE) og målet membran (t-SNARE) ^4, henholdsvis. Synaptic vesicle eksocytose er den mest strengt regulert fusjonsreaksjon og skjer innen et millisekund etter ankomst av et aksjonspotensial ^1,4,5. Sammensmeltingen pore, den første forbindelse mellom de to fusing avdelinger, kan flimre åpen og lukket flere ganger før forsegles eller utvide irreversibelt ^5-7. Den tidligere resultaterforbigående, "kiss & run" fusion, mens sistnevnte fører til full fusjon. Faktorer som regulerer balansen mellom disse to modusene for fusjon og mekanismer som regulerer pore flimring er ikke godt forstått ^5,8.

Snare proteiner er nødvendig for eksocytose; synaptisk vesikkelfusjon er avskaffet ved spalting av snarer av nervegifter ^9. Bulk fusion eksperimenter med små unilamellære vesikler (SUV) viste at snarer er ikke bare nødvendig, men også tilstrekkelig til å drive membranfusjon ^10. I denne analysen bulk, SUV rekonstituert med v-snarer (v-SUV) ble dopet med fluorescerende fosfolipider (N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) -phosphoethanolamine (NBD-PE) og ( N -. (lissamin rhodamine B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) og blandet med umerkede vesikler som inneholder t-snarer (t-SUV) Opprinnelige fluorescens av NBD-PE i v-SUV ble stanset ved Förster resonans energi overføring (FRET ) til LR-PE. Som labeLED v-SUVer fusjonere med umerkede t-SUVer, blir fluoroforen overflatetetthet i nå kombinert membran redusert og den resulterende økningen i NBD-PE fluorescens rapporterer omfanget av lipid blande ^10. Ettersom hoveddelen analysen er lett å sette opp og analysere, har det vært mye brukt for å studere mekanismene for SNARE-mediert fusjon ^10-14. Det har imidlertid flere begrensninger, slik som lav følsomhet og dårlig tidsoppløsning. Viktigst, som et ensemble måling, det gjennomsnitt resultater over alle hendelser som gjør diskriminering mellom dokking og fusjon, samt deteksjon av hemifusion mellomprodukter vanskelige.

Det siste tiåret har flere grupper, inkludert våre, har utviklet nye metoder for å overvåke fusion hendelser på singelen vesikkel nivå ^15-27. Ha og kolleger brukte v-SUVer tjoret på en overflate og overvåket sin fusjon med gratis t-SUVer ^18,19. Lipidblanding ble overvåket ved bruk av FRET mellom et par av lipid-bundne fluoroforer emsengs i v- og t-SUVer, henholdsvis ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikros ^18. Senere Brunger laboratorium brukes en enkelt lipid-label arter sammen med et innhold markør for samtidig påvisning av lipid og innhold blande ^20,28. Både lipid og innholdet markører ble inkludert ved høye, selvlukkende konsentrasjoner; fusjon med umerkede SUVer resulterte i fluorescens dequenching ^20,28.

Andre har smeltet v-SUV til planar bilayers rekonstituert med t-snarer ^{15-17,21-27,29.} Den plane geometri målet (t-SNARE holdige) dobbeltlag bedre etterligner den fysiologiske fusjon prosessen av små, svært buede vesikler med flatskjerm plasma membran. Den Steinem gruppe næringsdrivende pore spennende membraner rekonstituert med t-snarer, suspendert over et porøst silisiumnitrid substrat og oppdaget fusjon med individuelle v-SUVer bruker konfokal laser scanning mikros ^23. andre fbrukte v-SUV til planar bilayers rekonstituert med t-snarer, støttet på et glass substrat ^{15-17,21,22,24-27,29.} Den store fordelen med å bruke støttede dobbeltlag (SBLs) er at TIRF mikroskopi kan brukes til å oppdage tilkoblings og fusjonsbegivenheter med utmerket signal-til-støy-forhold og uten innblanding fra frie v-SUVer, selv om du bruker MicroFluidics gir også enkelthendelse oppløsning ved hjelp av standard langt-feltet epifluorescence mikros ^24.

En stor bekymring er hvorvidt og hvordan substrat-bilaget interaksjoner påvirke støttet bilagskvalitet og fusjonsprosessen. Tidlig arbeid gjort bruk av planar SBLs som var direkte understøttet på et glass eller kvarts substrat ^15-17. Disse SBLs ble laget ved adsorpsjon, sprengning, spredning og blanding av t-SUV-membraner på substratet. Det ble snart innså imidlertid at å utelate en nøkkel t-SNARE komponent, SNAP25, fra SBLs fremstilt på denne måten resultert i v-SUV docking og fusion kinetikk indistinguisHable fra de som oppnås ved bruk av komplett t-snarer ^17. Fordi SNAP25 er absolutt nødvendig for fusjon in vivo ^30,31, ble den fysiologiske betydningen av disse tidlige forsøk satt i spørsmålet. Tamm gruppe vant denne utfordringen ved å bruke bedre kontrollert støttet bilagsdannelse ^21. Det pleide Langmuir-Blodgett avsetning for proteinfritt første vedlegget SBL, etterfulgt av fusjon av at enkeltlag med t-SUVer ^21. Dette resulterte i SNAP25 avhengig fusjon.

For å unngå eventuelle gjenstander i forbindelse med en to-lags direkte understøttet på et glass-substrat uten behov for å bruke Langmuir-Blodgett metoder, Karatekin et al., Innføres en myk, hydratisert poly (etylenglykol) (PEG) pute mellom bilaget og substratet ^24. Denne endringen resulterte også i SNAP25 avhengig fusjon ^24. Bilag polstrede på en myk polymersjikt hadde vært kjent for å bedre bevare transmembraneprotein mobilitet og funksjon ^32, og hadde blitt brukt i fusjonsstudier med virus ^33. I tillegg pegylert bilag synes å beholde noen evne til selv helbrede og er veldig robust ^34,35. Først blir en fraksjon av kommersielt tilgjengelige, lipid-koblet PEG-kjedene som inngår i t-SUV membran. Når disse t-SUVer sprekke og danne en plan dobbeltlag på et glass substrat, en PEG børste dekker både flygeblader av den plane bilaget. Fordi plane bilagsdannelse er drevet av adhesjon av PEG-kjedene omkring t-SUVer på den hydrofile glassoverflaten, liposom sprengning og plane bilagsdannelse er forholdsvis ufølsomme overfor lipid preparat som brukes. Imidlertid, når store mengder av kolesterol er inkludert, øker de kohesive egenskaper av SUV, SUV kan ikke briste spontant. Dersom dette er tilfelle, kan osmotisk sjokk eller toverdige ioner anvendes for å hjelpe plane bilagsdannelse ^25.

Som nevnt ovenfor, i dette apming en PEG børste dekker begge sider av den plane, støttet bilaget. Børsten som vender mot mikrofluidstrømningskanalen bidrar til å hindre ikke-spesifikk adhesjon av innkommende v-SUVer som også vanligvis er dekket med et lag PEG. Dannelse av V- og T-snare komplekser starter fra membranen-distal N-termini og fortsetter i etapper mot membran-proksimale domener ^36. Til V-SUVer å interagere med T-SBL, V- og T-SNARE N-termini behovet for å stikke opp over PEG børster, som synes å være tilfelle under betingelsene for analysen. Børste høyde kan tilpasses til å studere andre enn feller proteiner ved å variere tettheten av PEGylerte lipider og PEG kjedelengde ^37,38. En annen fordel med PEG børster dekker proksimale overflater av fikserings bilagene er at de etterligner den overfylt miljø av biologiske membraner som er fullpakket med 30,000-40,000 integrerte membranproteiner per kvadrat micron ^39. Akkurat som PEG-kjedene i denne analyse ble repulsive proteinlaget som dekker biologiske membraner trenger å bli skjøvet til side for å tillate kontakt mellom de to fosfolipid dobbeltlag for fusjon til å forekomme.

Mikrofluidstrømningskanaler er brukt i denne analysen, siden de tilbyr unike fordeler. Først gjør microfluidic flyt mer enhetlig deponering av T-SUV til å spre og sikring for å danne t-SBL. For det andre, den lille kanal volum (<1 ul) minimaliserer prøve forbruk. For det tredje, de små volumer som kreves for at hele eksperimentet som skal utføres under konstant strømning. Flow fjerner svakt, antagelig ikke-spesifikt, følges v-SUV fra SBL ^16. Det opprettholder også en konstant tetthet av v-SUVer over t-SBL, forenkle kinetisk analyse ^17. Endelig er forankret vesikler lett skilles fra gratis de båret av flyten ^25. Fjerde, flere microfluidic kanaler kan brukes på samme dekkglass, hver sondering en annen tilstand. Dette gjør det mulig å sammenligne forholdene During den samme forsøkskjøring. En lignende tilnærming har blitt brukt av van Oijen gruppe for å studere fusjon mellom influensavirus og polstrede SBLs ^33.

I TIRF mikroskopi, den eksponentielle desintegrasjon av det svinnende felt (med en desintegrasjonskonstanten ~ 100 nm) rammen fluorescenseksitasjon i de molekyler som er i umiddelbar nærhet av glass-buffer grensesnitt. Dette reduserer bidraget av fluorescerende molekyler som er lenger bort, øker signal-til-støyforholdet, og gjør det mulig enkelt molekyl følsomhet med ramme eksponeringstider på 10-40 msek. Den flyktige feltet fører også til et signal økning på fusjon: som den merkede lipider overføring fra SUV inn i SBL, befinner de seg i gjennomsnitt i en sterkere eksitasjon felt. Økningen i fluorescens er sterkere for større liposomer.

Når polarisert lys blir brukt til å generere det flyktige feltet, ytterligere effekter bidrar til endringene i fluorescens ved transfer av etiketter fra SUV inn i SBL. Noen fargestoffer lipid har en overgang dipol orientert med en foretrukket midlere vinkel med hensyn til dobbeltlaget, hvor de er innleiret. Dette skaper en forskjell i mengden av fluorescens emittert ved fluoroforene når de er i SUV versus SBL, ettersom det polariserte strålen vil eksitere fargestoffer i de to membraner på en annen måte. For det første, vil eksiteringen bjelken samhandle med overgangs dipoler orientert rundt den sfæriske SUV, mens det for den sistnevnte, vil dipol-orienteringer være begrenset av den flate SBL geometri. For eksempel, når s-polarisert innfallende lys (polarisert vinkelrett på innfallsplanet) anvendes, er eksitasjon mer effektiv når fargestoffet er i den SBL enn i SUV for et lipid fargestoff overgang dipol orientert parallelt med membranen ^29,40 (slik som for Dil eller gjorde ^41-43). En SUV dopet med en slik fluorofor vises dimme når det dokker ut mot SBL (figur 7, Representat ive resultater). Som en fusjon pore åpner og forbinder SUV og SBL membraner, fluorescerende prober diffus i SBL og bli mer sannsynlig å bli begeistret av s-polarisert flyktig felt ^25,27,29. Følgelig fluorescens signal integreres over hele fusjons området øker sterkt i løpet av farvestoffoverføring fra SUV inn i SBL ²⁷ (figur 3 og figur 7). En ytterligere faktor som bidrar til å signalisere endringene som følger fusjon blir dequenching av fluorescerende markører som de fortynnes når de overføres inn i SBL. Bidraget av dequenching er vanligvis liten i forhold til evanescent felt råte og polariseringseffekter i analysen beskrevet her, fordi bare en liten del ( ) Av lipidene er merket.

Signalet Økningen ved fusjon kan utnyttes til å utlede fusjon poreegenskapene ved å sammenligne den tid,1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, som kreves for en lipid å flykte gjennom en pore som er fritt gjennomtrengelig for lipider til selve utgivelsen tid, . Dersom de to tidsskalaer er sammenlignbare, vil det bli konkludert med at den pore presenterer liten motstand mot strømning lipid. Men hvis selve utgivelsen tid er betydelig lengre enn tiden for diffusjon begrenset utgivelse, ville dette indikere en prosess, for eksempel pore flimring, hemmende lipid utgivelse. Spredningen begrenset utgivelsen tid, , Avhenger av størrelsen av fikserings liposom og lipid-diffusivitet; sin estimering krever disse to parametere som skal kvantifiseres. Den eneste molekyl sensitiviteten til analysen tillater lipid diffusivitet som skal måles ved å spore flere enkelt lipid fluoroforer etter at de slipper inn i SBL for hver fusjon arrangement ^26. Størrelsen av hver fikserings vesikkelkan estimeres ²⁷ ved å kombinere (i) intensiteten av et enkelt lipid fargestoff, (ii) endringen i total fluorescens rundt et forankrings område etter at alle fluoroforen blir overført til SBL ved fusjon, (iii) den kjente merking tettheten av SUV lipider, og (iv) det areal per lipid. For mange fusjonsbegivenheter, ble selve lipid frigjørings ganger funnet å være mye tregere enn forventet ved diffusjon-kontrollert frigjøring ^27, som ble nevnt tidligere forutsatt uniform SUV størrelse ^44. Forutsatt retardasjon av lipid utgivelsen skyldes pore flimring, tillater en kvantitativ modell estimering av "pore åpenhet", brøkdel av tiden pore forblir åpen i fusion ^27.

Når praktisk, er det viktig å teste fusjons mekanismer ved hjelp av både lipid og oppløselige innhold etiketter. For eksempel kan lipid utgivelsen være tilbakestående av andre enn pore flimrende prosesser, for eksempel begrensning av lipid diffusjon av snaren proteiner som surround than pore. Hvis dette var tilfelle, og slipp av innholdet vil gå forut for utgivelsen av lipid etiketter, forutsatt at pore er stor nok til å tillate passasje av løselige sonder. En mer grunnleggende feil i tilnærmingen kan være i antakelsen om at overføringen av merket lipider til SBL skjer gjennom en smal fusjon pore kobler SBL til en vesikkel som i stor grad har beholdt sin pre-fusion form. Lipid overføringen til SBL kan også skyldes hurtig utvidelse av fusjons pore med en samtidig, ekstremt hurtig sammenbrudd av SUV inn i SBL membranen, som tidligere er foreslått basert på lipid frigjøringsdata alene ^29. Overvåking av både lipid og innholdet slipper samtidig, ble det funnet at mange porer lukkes igjen etter frigjøring alle deres lipid-etiketter, men beholdt noen av deres oppløselige last ^27. Dette indikerer at i det minste noen av liposomer ikke kollapser inn i SBL etter fusjon, og at lipidet farvestoffoverføring inn i SBL skjer gjennom en fusjon pore. I tillegg er lipid og innholdet utgivelsen skjedde samtidig ^27, noe som gjør det usannsynlig at retardasjon av lipid utgivelsen skyldes hindring av lipid diffusjon av snaren proteiner rundt pore ^45.

En SUV-SBL fusjon protokoll som ikke overvåke løselige innholdet meldingen ble tidligere utgitt av Karatekin og Rothman ^25. Her er mer den siste utviklingen med, nemlig samtidig overvåking av lipid og innholdet slipp og estimering av SUV, lipid, og fusion pore egenskaper ^27. Protokollen starter med instruksjoner for utarbeidelse av microfluidic celler, laget ved å binde en poly (dimetylsiloksan) (PDMS) elastomer blokk inneholder riller med et glass dekk ^25. Deretter er utarbeidelse av v-SUVer med både lipid og innhold markører forklart. § 4 og § 5 gi instruksjoner for montering av microfluidic celler, danner de SBLs in situ og se etter feil og flyt, innføring av VSUVS i strømnings celler og påvisning av fusjonsbegivenheter. § 6 gir instruksjoner for dataanalyse.

Protocol

1. Utarbeidelse av en PDMS Block å danne mikrofluid Channel

Figur 1. microfabrication av strømningscelle templat og PDMS blokk forberedelse. (A) Design av en fire-kanals strømningscelle som passer på en 24 x 60 mm glass dekkglass (nederst). Seks identiske design er arrangert for å passe inn i en 10 cm silisium wafer (øverst). (B) Kutt ut blokk på ca 5-8 mm tykke PDMS på en hullemaskin. (C) Innsetting av slangen inn i den stansede hull ved hjelp av en pinsett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1. Skaff en flyt celle mal slik som den i figur 1A. Typiske kanaler er 0,3-1 mm brede, 70-100 um høye, og 1-2 cm lang. Dikte opp en mal ossing standard fotolitografi teknikker i et renrom anlegget ²⁵ eller bestille dersom renrom tilgang er ikke tilgjengelig. Alternativt kan maskinen en mal med større dimensjoner fra et passende materiale.
   Merk: renrom ansatte kan trene og veilede uerfarne brukere (tilgang til et renrom anlegget er alltid begrenset til brukere med riktig trening) i design og bestilling av en maske, wafer rengjøring, og fotolitografi. Når en mal er oppnådd, kan den brukes utenfor renrom gjentatte ganger, forutsatt at det er holdt i et lukket rett og omsorg er tatt for å hindre at støv.
2. Lag en blanding av ~ 100 ml PDMS (silikon base) og ~ 10 ml av tverr linker (herder) i en engangs plastkopp. Bryte av spissen av en engangspipette å håndtere viskøse PDMS lettere. Veie PDMS inn i plastkopp som pipettering er ikke nøyaktig.
3. Rør blandingen godt. Fjern de mange luftbobler etter avgassing i en vakuum-eksikator (ca. 20min). Når koppen er plassert under vakuum, vil boblene innledningsvis vokse i størrelse, øker volumet av blandingen sterkt. Styr vakuum som er brukt, og sørg for at koppen er dypt nok til å unngå søl.
4. Hell en stor dråpe av avgasset PDMS blandingen i et glass petriskål (150 mm x 20 mm), og trykk på wafer på de PDMS med malen vendt opp. Dette unngår bobler blir fanget under wafer. Fanget bobler vil utvide og kan vippe wafer når retten settes i ovnen. Nå hell avgassede PDMS ut mot malen på toppen av wafer til den er dekket av ca 5-8 mm av pmds. Hvis en luftboble oppstår det forsiktig ut med en pipette tips.
5. Stek pmds i en ovn ved 60 ° C i 3 timer. Kontroller at parabolen er nivå.
6. Bruk en ny skalpell blad til å kutte ut en PDMS blokk som inneholder de støpte kanalstrukturer. Den kutte ut blokken må passe inn i en dekk (se trinn 4.1.9).
7. Skrelle ut kuttet ut blokk fra fatet og pless det på et stykke av ren aluminiumfolie.
   Merk: kryssbundet pmds blokker kan oppbevares i et par måneder. På en enkelt skive, det er 6 sett av strømningskanaler (figur 1A), slik at 6 PDMS blokker kan fremstilles i en enkelt støpe PDMS. Etter å kutte ut alle seks av PDMS blokker, rene løse biter av PDMS, men ellers ikke fjerne de gjenværende PDMS før strømme og kryssbinding neste gruppe, som vil kreve bare omtrent halvparten av PDMS brukes for første batch. En god mal kan vare noen år.
8. Bruk en hullemaskin for å bore gjennom PDMS blokk i en rett bevegelse (figur 1B). Begynn på siden av kanal sporene. Sørg for å fjerne utstanset stykke PDMS. Gjenta dette for alle de åtte hullene på fire kanal design.
9. Plasser PDMS blokken kanalsiden ned på en ny og rynkefri stykke aluminiumsfolie. Lagrer blokken for opp til noen få måneder i en tørrboks, helst i en eksikator.
10. Skyv røret (0,25 mm ID, 0,76 mm OD) om lag en tredjedel inn i stansede hull ved hjelp av en pinsett (figur 1C). Kutt slangen skrå for enklere innsetting. La rørene lenge nok til å nå SUV reservoaret og sprøytepumpen, henholdsvis. Etter å ha plassert montert chip på mikroskopet, kutte rørene igjen hvis de er for lange.
11. Hvis du vil koble til sprøyter med pumpen, kuttet en liten del av større silikonslanger (0,51 mm ID, 2,1 mm OD) og sett tynnere rør til den ene siden. Dette klar til bruk blokk av PDMS kan holdes i et par måneder.

2. Coverslip Rengjøring

1. Rene Dekkglass i henhold til protokollen som er beskrevet i Karatekin og Rothman ²⁵ ved hjelp av et sterkt oksidasjons blanding av svovelsyre (H ₂ SO ₄₎ og hydrogenperoksid (H ₂ O _2). Utfør denne prosedyren i et renrom, og observere riktige sikkerhetsforanstaltninger. Alternativt kan du bruke en renrom renset coverslip som er kommersielt tilgjengelig (se Materials List).

3. Utarbeidelse av v-SUVer som inneholder både Lipid og innhold Etiketter

Figur 2. Skjematisk av SUV fremstilling. Lipids blandes i et glassrør (1), og løsningsmidlet fordampes under dannelse av en lipid film ved rotering av røret i et vannbad (2). Gjenværende spor av løsningsmiddel fjernes under høyvakuum (3). Lipidfilmen blir hydratisert i rekonstituering buffer inneholdende detergent og protein mens virvles (4). Hvis innholdet fargestoff er som skal innkapsles, er det inkludert i dette trinn, så vel som i fortynningen (5). Fortynning av vaskemiddelkonsentrasjonen under dens kritiske micellekonsentrasjon fører til liposomdanning. Vaskemiddel dialysert vinne over natten (6). For T-SUVer for SBL dannelsen inkludert NBD-PE (grønn), er vesikler fløt i en tetthet gradient og samlet pågrenseflaten mellom to lag (7a). For å skille v-SUVer med innkapslet innhold markør gratis fargestoff prøven kjøres over en størrelse-eksklusjon kolonne og samlet i 0,5 ml fraksjoner (7b). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1. Forbered 4 L av rekonstitusjon buffer, inneholdende 25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 mM EGTA og 1 mM DTT, pH 7,4. Bruk det meste av buffer for dialyse og 100 ml for andre trinn.
   Merk: Andre buffere kan anvendes, men det er viktig å holde buffer osmolariteten konsistent gjennom hele eksperimentet og velge forholdene der proteinene er funksjonelle. For å forberede v-SUVer som inneholder lipid etiketter bare og t-SUVer, følger Karatekin og Rothman ^25.
2. Som lipid-lager blir lagret ved -20 ° C i kloroform eller kloroform: metanol (2: 1, v / v), la ampuller romtemperatur før åpning for åunngå kondens.
3. Skyll et glassrør med kloroform for å fjerne spormengder av vaskemiddel og blandes lipidene i det ønskede forhold med en avsluttende mengde av en umol i en blanding av kloroform og metanol (2: 1, v / v). Bruk kun sprøyter av glass / rør for å håndtere organiske løsemidler / oppløste lipider.
   Merk: lipider som brukes her er POPC: SAPE: DOPS: Kolesterol: PEG2000-DOPE: gjorde på en molar ratio på 57,4: 15: 12: 10: 4,6: 1 for v-snare inneholder vesikler og POPC: SAPE: DOPS: Kolesterol : hjernen PI (4,5) P _2: PEG2000-DOPE: NBD-PE (54.9: 15: 12: 10: 3: 4,6: 0,5) for t-SNARE SUVer. Se Materiale for detaljer. Andre lipid-blandinger kan anvendes.
4. Fordamp løsningsmidlet under en forsiktig strøm av nitrogen, eller i en rotasjonsfordamper. Dyppes spissen av røret i et vannbad (37 ° C) oppvarmes til over den høyeste smeltetemperaturen av lipidene for å gi en homogen lipid film og for å unngå store endringer i temperaturen, mens fordampning av løsningsmidlet. Begynn vakuum på rundt300 mbar til lipidfilmen er dannet, og deretter fortsette i ~ 2 minutter med høyest mulig vakuum i en rotasjonsfordamper.
5. Fjern glassrøret og vikle den i aluminiumsfolie for å unngå lyseksponering og fjerne gjenværende spor av løsningsmiddel ved å plassere røret i en desikkator under høyt vakuum i minst 2 timer. Dette trinnet kan også kjøre over natten.
6. Å rehydrere det tørkede lipidfilmen, fremstille en blanding av detergent (n-oktyl-β-D-glukopyranosid, OG), protein (v-snarer), og SRB i rekonstituering buffer (500 pl sluttvolum). Hold den endelige vaskemiddel konsentrasjon ~ 2 ganger over den kritiske micellekonsentrasjon (CMC, 20-25 mm OG) og justere den endelige volumet slik at vaskemiddel til lipid forholdet er> 10. Oppløs Sulforhodamin B (SRB) pulver i protein-detergentløsning for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10-50 mM SRB ved forsiktig risting av løsningen. Justere osmolariteten til den rekonstitusjonsbuffer når tilsetning av høye konsentrasjoner av SRB ved å redusere concentration av kaliumklorid tilsvarende.
   Merk: Lipid-til-protein ratio (LP) for t-snarer er høy (LP ~ 20 000, ~ 70 t-snarer per kvadratkilometer mikron ^25.). Betydelig høyere t-snare tettheter i SBL kan føre til inaktive proteinaggregater med betydelig redusert fusjons prisene ^17,24. LP for v-snarer er mye lavere (LP ~ 200, ~ 7000 v-snarer per mikrometer ^2), i nærheten av V-snare tettheter finnes på synaptiske vesikler ^46,47. For å sikre protein funksjon etter rekombinant ekspresjon og rensing av v- og t-snarer er det nyttig å utføre en enkel bulk fusjon analyse ⁴⁸ før du går gjennom alle trinnene i én vesikkelfusjon analysen.
7. Rist forvarmede glassrøret som inneholdt den tørkede lipidfilmen under tilsetning av protein-detergent-SRB-løsning fra trinn 3.6. Prøv å unngå å skape bobler. Fortsett å riste i 15 minutter ved 37 ° C.
8. Fortynn vaskemiddel femdoblet ved å legge til tilberedningbuffer som inneholder SRB (tilsett 2 ml, 2,5 ml endelig volum) mens hurtig virvling å unngå konsentrasjons gradienter. Fortsett å riste i 15 minutter til 1 time ved 37 ° C.
   Merk: Lengre inkubasjon økning protein tilberedning effektivitet. Den raske fortynning senker vaskemiddelkonsentrasjon under CMC og fører til dannelse av små liposomer.
9. Dialyser den vesikkelsuspensjon først mot ~ 1 l rekonstituering buffer i 1-2 timer ved omgivelsestemperatur og deretter mot 3 l av rekonstitusjon buffer over natten ved 4 ° C med 4 g av polystyren-adsorpsjonsmiddel, ved anvendelse av en 20 000 MWCO dialyserør eller kassett. Bruk forskjellige kanner for dialyse av vesikler med og uten SRB å hindre smitteoverføring.
10. Ekvilibrere en gelfiltreringskolonne med rekonstituering buffer. Kjør vesikkelsuspensjon gjennom kolonnen for å separere fri SRB fra v-SUVer med innkapslet SRB. Bruk rekonstitusjon buffer uten SRB som elueringsmiddel, når hele prøven harangitt i kolonnen. Samle v-SUVer i 0,5 ml fraksjoner.
11. Bekreft vellykket SRB innkapsling på selv slukket konsentrasjoner ved å måle SRB fluorescens før og etter tilsetting av vaskemiddel til en delmengde av vesikler ^16. Ved hjelp av en fluorescens spektrometer, opphisse prøven ved 550 nm og skanne SRB utslipp mellom 570 nm og 630 nm. Forvente en 4-8 gangers økning i SRB fluorescens, avhengig av den innkapslede beløpet ved tilsetning vaskemiddel som membranen er oppløst og det frigjorte SRB er fortynnet.
12. Karakterisere lipid og protein utvinning ved hjelp av fluorescens spektroskopi ²⁴ og SDS-PAGE gel elektroforese, henholdsvis. Bruk en følsom fargemetode, spesielt for høy LP t-SUV prøver (se Materials List). Typisk ca 50% av både lipid og protein-inngang går tapt under fremstillingen resulterer i en LP nærheten av den nominelle verdi.
13. Karakter SUV størrelser ved hjelp av dynamisk lysspredning ²⁴ eller elektron mikroskop,py ^48. Butikk SRB-inneholdende v-SUVer ved 4 ° C opp til ~ 3-4 dager. Må ikke fryses, så frysing og tining bryter membranen og frigjør innkapslet SRB.

4. SUV-SBL Fusion analysen til Monitor Lipid Slipp Only

1. Dannelse av den forankrede understøttet dobbeltlaget i løpet av de microfluidic strømningskanalene
   1. Plasser PDMS-blokk (trinn 1.11) under høyt vakuum i minst 20 minutter før forsøket for å fjerne oppløste gasser. Dette reduserer risikoen for luftbobler i microfluidic kanaler under fusjon forsøket.
   2. Slå på mikroskopet oppsett og oppvarme trinnet og prøveholderen (figurene 3 og 4) til den ønskede temperatur.
   3. Filtrer den rekonstituering bufferen anvendt til å fortynne vesiklene gjennom et filter med 0,45 pm eller mindre porestørrelse.
   4. Spe ~ 30 mL av NBD-PE merket t-SUVer eller proteinfritt (PF-SUV) kontroll liposomer (lagerLøsningen 0,5-1 mM lipid) med ~ 60 pl buffer. Den endelige konsentrasjonen er ikke kritisk her.
   5. Degas denne blandingen ved bruk av en 3 ml sprøyte. Trykk ut det meste av luften over prøven mens du holder sprøyten vertikalt. Tett (nål gratis) tips å bruke parafin film og skape et vakuum ved å trekke ned stempelet. Hurtig på sprøytesylinderen for å akselerere avgassing av oppløsningen. Gjenta denne prosessen et par ganger til det ikke flere bobler oppstår når vakuum er brukt.
   6. Benytte en kanyle med en diameter som er litt større enn røret som er festet til PDMS blokken for å slå et hull i lokket av et mikrosentrifugerør. Kontroller at utstanset stykke plast er ikke inne i røret som det kan tette slangen koblet til mikrofluidkanalen senere.
   7. Fyll avgasset SUV løsningen inn i mikrosentrifugerør med et hull i lokket og plasser den i holderen på mikroskopet scenen for å stabilisere til innstilt temperatur.
   8. pless en tidligere renset dekkglass (§ 2) i en plasma renere og kjøre luft plasma for ca 5 min. Sett plasma behandlet dekkglass (behandlet siden opp) på toppen av noen lofri vev fungerer som en pute.
   9. Ta av folien fra avgasset PDMS blokken og plasser blokk på toppen av dekkglass. Når gjenbruk PDMS blokk sette på og ta et stykke tape til kanalen side for å rengjøre den. Trykk ned PDMS blokkere på dekkglass ved hjelp av en pinsett for å gjøre det pinne, men ikke trykk for hardt som glass kan bryte.
   10. Plasser den monterte strømningscellen på objektbordet og koble slangen til SUV reservoaret og sprøytepumpen, henholdsvis. Tape dekkglass til scenen (figur 3B).
   11. Begynn å aspirere SUV ved 3 ul / min inntil oppløsningen fyller kanalene fullstendig (~ 2,25 mm / sek til 75 um x 300 um kanaltverrsnitt). Når løsninger for alle kanalene begynner å flytte opp the rør på utgangssiden, reduseres strømningen til 0,5 ul / min og inkuberes i 30-45 min.
       Merk: Tid mellom plasma behandling av glass-slide og flyter SUV inn i kanalen bør ikke overstige 10-20 min som effekten av plasma-behandling er forbigående.
   12. Kontroller kanaler for enhver lekkasje. Bruk en 10-20x luft mål å observere NBD-PE fluorescens fra NBD-PE inneholder t- eller PF-SUVer. Excite NBD fluoroforer bruker 488 nm laser. Lekkasjer er vanskelig å oppdage ved hjelp av lyse felt belysning.
   13. Sett en tube med avgasset rekonstitusjonsbuffer i holderen og la temperaturen stabilisere seg som raske endringer i temperatur kan føre til defekter i SBL. Stoppe flyten og vente ~ 1 min for å sørge for at flyten har stoppet helt og ingen luftboble vil suges inn i røret før du slår på nyanlegg til avgasset buffer.
   14. Skyll alle kanaler med avgasset buffer for å vaske bort ubundne SUVer.
   15. Bytt til en higher forstørrelse TIRF objektiv (60x, olje, NA 1,45 til 1,49) og kontrollere at bilaget ser homogen og uten noen åpenbare store defekter som mørke flekker eller lipid tubuli strekker seg ut fra SBL.
2. Sjekk fluiditeten av bilaget
   1. Hvis en dedikert FRAP enhet ikke er tilgjengelig, eller hvis en FRAP sekvens ikke kan programmeres, så kvalitativt prøve membranfluiditet som følger.
      1. Lukk feltblenderen til en liten størrelse (~ 40 mikrometer i diameter) og juster 488 nm eksitasjon lysintensitet gjennom programvaren (20-80 μW, eller 15-60 nW / mikrometer ²⁾ å bleke NBD-PE fluorescens i den eksponerte området betydelig, men ikke helt. For et fluid dobbeltlag, i steady state, bør fluorescensintensiteten i midten av det eksponerte området være lavere enn ved kantene, som intakte NBD-PE-molekyler angi det utsatte området og spre en viss avstand før bleking. I motsetning til dette, hvis den overflate klebet SUVs klarte å sprekke, eller av en annen grunn som støttes bilaget er ikke væske, bør alle fluoroforer i det utsatte området bleke.
         Merk: Laser intensitetsverdier i dette og senere trinn er gitt som en grov utgangspunkt og bør optimaliseres for et gitt sett av betingelser.
      2. Stopp belysning og starte den igjen et par minutter senere for å bekrefte resultatene av stabile målinger
   2. Programmere en FRAP-sekvens for en mer kvantitativ måling, om mulig. Se supplerende filer og tilsvarende legende for detaljer.
      Merk: Noen ganger SUVer vil følge på dekkglass, men ikke klarer å sprekke og danne en væske bilaget. Hvis dette skjer, skyll kanaler med avgasset rekonstituering buffer som inneholder 10 mM Mg ²⁺ å hjelpe støttet bilags formasjon. Bruk fluorescens bleking å vurdere bilags flyt som i 4.2. Når en væske bilaget er dannet, skyll med Mg ²⁺ -fri reconstitution buffer.
3. Vi presenterer v-SUV inn i microfluidic strømningskanalene
   1. Degas rekonstitusjonsbuffer og bruke den til å fortynne den v-SUV-stamløsning med en faktor på omtrent ¹⁰ mars til 10 mai, avhengig av v-SUV-lager-konsentrasjon. Målet for en fortynning som resulterer i omtrent 10-100 fusjonsbegivenheter løpet av 60 sek i synsfeltet.
      Merk: For mange fusjoner øke bakgrunnen fluorescens (siden hver hendelses innskudd LR-PE eller gjorde lipid etikettene inn i SBL) og gjøre deteksjon og analyse av fusjonsbegivenheter vanskelig. I motsetning til en fusjon frekvens som er for lave resultater i dårlig statistikk eller krever oppkjøp av mange flere filmer. For en v-SUV konsentrasjon på 0,1 mM lipid, start ved å fortynne 5 mL SUV lager i 995 mL rekonstitusjonsbuffer og deretter fortynne 5-50 mL av dette i 950-995 mL rekonstituering buffer.
   2. La temperaturen stabilisere seg før stoppe flyten og inserlingen innløpsrøret inn i det fortynnede v-SUV-løsning.
   3. Juster TIRF vinkel og polarisering som følger.
      1. Etter innstilling av ønsket polarisasjon ved å rotere eksitasjon strålen, justere hellingen av speilet kommanderende posisjonen til strålen via en trinnmotor gjennom programvaren. Sakte flytte plasseringen av laserstrålen fra midten av målet på baksiden fokusplanet til den ene side ut av senter. Observere lyset fra målet på forsiden fremstå med en økende vinkel i forhold til målet akse som stilling beveges videre ut av senter.
      2. Legg merke til motorposisjonen når den utgående strålen først forsvinner inn i målet, dvs. når TIR først oppnådd.
      3. Sakte holde bevegelige bjelken posisjon ytterligere ikke-sentrert mens man overvåket fluorescens fra overflaten. Legg merke til motorposisjonen når overflaten fluorescensen forsvinner når strålen har beveget seg så langt ut av senter.
      4. Velg en bjelke posisjonering n mellom de to grenser bestemt ovenfor. For best signal-til-støy-forhold og mer signalforsterkning ved fusjon, velge en grunne inntrengningsdybde (beam posisjon nærmere kanten av målet) som fortsatt gir jevn belysning av View.
         Merk: Det er best å holde samme TIR strålen posisjon (samme inntrengningsdybde) for alle forsøkene etter innstillingene er optimalisert. Gjøre at dreie polarisasjonen ikke resulterer i forandringer i strålen stilling.
   4. Strømnings v-SUVer inn i kanalen ved en strømningshastighet på 2 mL / min, tilsvarende en gjennomsnittlig lineær strømningshastighet på ~ 1,5 mm / sek for et tverrsnitt på 75 pm x 300 pm. Bytt til eksitasjon / utslipps innstillinger for å overvåke lipid blande (LR eller gjorde bare).
4. Observere fusjon mellom enkelt v-SUVer og SBL

.jpg "/>
Figur 3. Det eksperimentelle oppsettet pTIRF. (A) Skjematisk representasjon av en v-SUV og en t-SBL på et glass-substrat. Falsk-farge TIRFM bilder av enkelt SUV-SBL-fusjons arrangement som viser lipid dokking (1) og frigjøring av lipid fargestoff inn i SBL (2) etterfulgt av bleking og minskning av fluorescens-intensitet (3). Den totale fluorescens-intensitet (sum av pikselverdiene i 5,3 um x 5,3 um boks) signal er vist. (B) Et dekkglass bundet til PDMS blokken er tapet på den oppvarmede trinnet. Innløpsrør for microfluidic kanaler trekke prøver fra rør i metall prøveholderen (høyre) aspirert ved sprøytepumpe (til venstre). Under pumpen er den doble utslipp enheten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

OAD / 54349 / 54349fig4.jpg "/>
Figur 4. Skjematisk av eksperimentelle oppsettet. Den flyktig bølge skapes ved glass-buffer grensesnittet i mikrofluidkanalen. Den SBL er dannet på glass og v-SUV suges fra metallprøveholderen (øverst til høyre) gjennom kanalen inn i sprøyten (øverst til venstre). M, speil; DM, dichroic speil; L, linse; F, filter; P, polarisator. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1. Kontinuerlig opphisse og overvåke v-SUV fluorescens ved hjelp av en 561 nm (for LR-PE) eller 638 nm (for VISSTe) laser avhengig av fluoroforen innlemmet i v-SUVer. Som v-SUVer nå strømningskanalen og dock på og sikring med SBL, bakgrunnen fluorescens signal begynner å hope seg opp.
2. Juster eksitasjon laser intensitet gjennom programvaren til å kontinuerlig bleke bakgrunnenfluorescens slik at ved steady state nye tilkoblings og fusjonsbegivenheter kan lett observeres.
   Merk: Hvis bleking er for treg, vil bakgrunnsfluorescens være for høy. Hvis bleking er for fort, vil signalene fra kai SUVer og fra fluorophores slippes ut i SBL falmer raskt, forkorte vinduet der fusjon av forankrede SUVer kan oppdages eller en fluorofor kan spores. For LR-PE spent på 561 nm, 02.05 til 07.05 mW belyser en mikrometer diameter sirkel 190 (100-250 nW / mikrometer ²⁾ er en rimelig verdi for å starte. For 638 nm eksitasjon av VISSTe, 0,8-1,6 mW effekt over en 190 um diameter krets (30-60 nW / um ²⁾ kan brukes til innledende tester.
3. Skaffe flere filmer på ulike posisjoner i en gitt kanal. Sjekk NBD-PE fluorescens for å bekrefte at SBL ikke har mangler på disse stillingene. Acquire fullformat filmer på maksimal hastighet (~ 50 bilder / sek) eller et beskåret område av interesse for høyere bildefrekvens (opptil~ 100 Hz) i 60 sek.
4. Flytt til en annen microfluidic kanal og gjenta opptakene for andre forhold. Omfatte negative kontroller som et proteinfritt SBL eller SUVer, tilsett oppløselige cytoplasmiske domene av v-SNARE VAMP2 (CDV) som en inhibitor eller behandle v-SUV med tetanus neurotoxin (30 minutter ved 37 ° C) i en eller flere av kanalene på den samme dekkglass.

5. Rydd opp og PDMS resirkulering
   1. For å kunne gjenbruke PDMS blokken, skyll microfluidic kanaler med ~ 200 pl av 70% etanol ved en strømningshastighet på 5 ul / min. Til slutt, aspirate luft gjennom slangen og kanaler.
   2. Ta av PDMS blokkere forsiktig fra dekkglass ved å klemme det litt. Plasser den på et rent stykke aluminiumsfolie. Lagre i en vakuum-eksikator. Det kan brukes om igjen flere ganger.
   3. For en mer grundig rengjøring skylle kanalene med et vaskemiddel eller natronlut før 70% etanol. Alternativt fjerne alle rør fro m hvilket PDMS og sonikere blokken i 30 minutter i isopropanol, før tørking og sette inn ny slange.

5. SUV-SBL Fusion analysen å overvåke Lipid og innhold Slipp samtidig

1. For tofarget overvåking av samtidig lipid og løselige innholdet slipp, følger de samme trinnene som i § 4, med unntak av bruk liposomer merket med både en lipid (DID) og en løselig innhold (SRB) etikett, som forklart i kapittel 3. SRB er innkapslet ved 10 mM, og er i utgangspunktet meget selv slukkes.
2. Bruke konfigurasjonen vist skjematisk i figur 4, opphisse SRB og gjorde fluorescens samtidig bruker 561 nm og 638 nm lasere, henholdsvis. En dichroic speil (640 nm) deler utslipp i to stråler som går gjennom en kort (595/50 nm) og en lang filter (700/75 nm) bølgelengde for å oppdage SRB og gjorde utslipp, henholdsvis. De to utslipps stråler projiseres side-ved-side på EM-CCD-brikken.

jove_title "> 6. Data Analysis

1. Analyse av FRAP data
   1. Bruk MATLAB program gitt i analytiker å anslå lipid diffusjonskoeffisienten, D. Programmet leser en liste over OME-TIFF-filer ^49, detekterer det blekede område, plotter de midlere pikselverdier i det blekede område som en funksjon av tid, og passer den resulterende utvinning kurve til en modell ved Soumpasis ⁵⁰ for å ekstrahere utvinning tid, , Hvor w er radius i sirkelen bleket.
      Merk: En MATLAB program ble gitt tidligere ²⁵ for analyse av FRAP filmer med Nikon ND2 filer. Den nåværende programmet leser OME-TIFF-filer ^49, fordi de fleste filformater kan lett konverteres til OME-TIFF. En kvantitativ analyse av FRAP data er enkleste og mest nøyaktige når bleking er momentant, den bleacHed-regionen er en sirkel, og bleking under lese-out er ubetydelig. Selv om disse kriteriene ikke er strengt oppfylt i de enkle FRAP målingene er beskrevet her, kan man oppnå en rimelig estimat av diffusjonskoeffisienten. For en mer nøyaktig anslag, bruker sporing av enkelt lipid fargestoffer (seksjon 6.3).
2. Analyse av docking rente, fusjon rate og docking-til-fusion forsinkelsestider
   1. Bruk ImageJ å åpne en film til å analysere og justere lysstyrke og kontrast for å kunne identifisere vesikkel docking og smeltet hendelser. Start SpeckleTrackerJ ²⁶ plugin. Se Smith et al. ²⁶ og elektronisk dokumentasjon for SpeckleTrackerJ for instruksjoner for bruk.
   2. Identifisere alle nylig kai SUVer i SpeckleTrackerJ. For å skille SUVer som forankres tett fra de som spretter av SBL, innføre et minimum docking varighet på noen rammer. Lagre sporene, og gjenta for alle filmer.
      Merk: For dockonge rente, er alt som teller for å identifisere når en SUV forankret, slik at bare det første bildet der SUVer forankret behov for å bli tatt opp i disse sporene. Resten av sporene vil ikke bli tatt hensyn til i analysen. Men auto-tracking hver SUV til det bleker eller sikringer hjelper mark SUVer som allerede er sporet.
   3. Identifisere alle fusing blemmer. For disse, bør sporene omfatte alle rammer fra den første ramme en SUV forankret til den første ramme i hvilken fusjon er tydelig ved en plutselig økning i fluorescensen av sporet sted. Varigheten av disse sporene er brukt til å beregne docking-til-fusion forsinkelser. Lagre alle spor. Gjenta for alle filmer.
   4. For batch analyse av tilkoblings eller fusjon data, kompilere en liste over bane filer fra de aktuelle filmene og kjøre MATLAB programmer som følger med Karatekin og Rothman ^25. Følg instruksjonene som fulgte sammen med programmene.
      Merk: Programmene plotte cumulative tilkoblings og fusjonsbegivenheter som en funksjon av tid, basert på informasjon trukket ut av banen filer. Dokking og fusjon prisene er beregnet fra bakken av disse tomter. For fusion data blir docking-til-fusion forsinkelser også beregnet og deres distribusjon plottet som en overlevelse plott, dvs. sannsynligheten for at fusjon ennå ikke har skjedd ved en gitt opphold etter dokking.
3. lipid spredningsevne
   1. For hver fusjon hendelse, sporer enkelt fluorescerende lipider etter hvert som de blir synlige når de er diffundert i tilstrekkelig grad bort fra fusjons området (figur 6). Bruk SpeckleTrackerJ for sporing, og lagre sporene for videre analyse ved hjelp av MATLAB. Avhengig av størrelsen av fikserings vesikkel, typisk 3-30 enkelt fluoroforer kan spores. Fordi lengre spor er ønskelig for beregning av Prøve å spore enkle molekyler som lengesom mulig, ved hjelp av manuell korrigering av baner om nødvendig.
   2. Beregn middelverdien squared forskyvning (MSD) for enkelt lipid markør baner som varer> 40-50 rammer (ca ~ 1,5 sek). Bruk MSD å beregne lipid diffusjonskoeffisient, . Se Smith et al. ²⁶ og Stratton et al. ²⁷ for detaljer.
4. Enkelt lipid fargestoff intensitet, SUV-SBL intensitet reduksjonsfaktor, og vesikkel størrelse
   1. Måle summen av pikselverdier av et lipid markør i en 3 x 3 piksler (0,8 um x 0,8 um) området rundt markør for ~ 15 bilder før og etter markøren blekemidler i et enkelt trinn. Trekke fra bakgrunnsintensiteten midlet over de post-blekemiddel rammer fra pre-blekemiddel intensitet midlet før bleking for å oppnå intensiteten av den sporede lipid markør. Gjenta målingen for så mange markører som praktisk for en gitt film.
   2. Plott fordelingen av enkelt lipid label intensiteter, Og passer en gaussisk for å anslå middelverdi.
   3. Beregn forsinkelse mellom sammensmelting når oppstod, og når banen til en enkelt lipid markør frigjort i så fall avsluttet i en enkelt-trinns bleking. Skaff bleking tid for en fluoroforen i SBL, , Ved å plotte overlevende funksjon av forsinkelser og passende til en eksponentiell.
      Merk: Fordi polariserte eksitasjon felt par mer svakt til fluorophores på en SUV, er bleking tiden av en SUV som regel mye tregere ^27.
   4. Beregne , Intensiteten reduksjonsfaktoren for et lipid fargestoff når i SUV i forhold til når det er i den SBL, følgende Stratton ²⁷ (tp_upload / 54349 / 54349eq8.jpg "/> er intensiteten av en enkelt fargestoff i SUV).
      Merk: Hvis bleking var ubetydelig, ville være lik dokket intensitet (punkt (1) i figur 3A, høyre panel), dividert med den totale intensitet oppnådd etter alle fluoroforer er deponert i SBL ved sammensmelting (stiplet linje merket i Figur 3). Imidlertid, på grunn av rask bleking i SBL, er vanligvis ikke nådd, og et nøyaktig estimat av krever montering av frigjøringskinetikken til et uttrykk ²⁷ som inkl udes både (Se 6.4.3) og . Separate uttrykk er gitt i Stratton et al ²⁷ for de tilfeller av pore begrenset og diffusjon begrenset utslipp kinetikk.; passer best case varierer fra hendelse til hendelse (se 6.5.1 for tilfelle av pore begrenset kinetikk).
   5. Beregn vesikkel området for enkelthendelser fra ²⁷ , hvor er dokket SUV intensitet, er den midlere intensitet av en enkelt lipid fargestoff i SBL, er intensiteten reduksjonsfaktoren for et lipid fargestoff når det er i SUV i forhold til når det er i den SBL, ogasjon en "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq12.jpg "/> er kjent areal tetthet av lipid fargestoffer.
5. Fusion pore egenskaper
   1. Forutsatt utgivelsen er pore begrenset, passe lipid etiketten frigjøringskinetikken til ²⁷ , hvor er forankret SUV intensitet like før fusjon og de andre parametrene er som definert tidligere. Bruk verdien av innhentet i 6.4.3 som et fast parameter, og trekke ut de best tilpassede estimat for og .
   2. Beregn brøkdel av tiden pore er åpen, P _0, er forutsatt retardasjon av lipid utgivelsen på grunn av pore flimring ^27:60; = , Hvor A _ves er vesikkel-området (avsnitt 6.4.5), b er den pore høyde (vanligvis tatt til å være ~ 15 nm), r _p ≈ 3 nm er den effektive poreradius som sett av Diffuseranordningen lipid etikettene og inkluderer halv bilaget tykkelse (~ 2 nm), er lipid diffusivitet (beregnet 6,3), og er det tid for lipider å bli løst fra SUV inn i SBL (fra 6.5.1).
   3. For å bekrefte at en nominell P _0> 1 indikerer en helt åpen pore, P ₀ = 1, passe intensitet tidsforløpet til likning 4 av Stratton et al. ^27, den anslåtte kinetikk for en permanent åpen pore. Dette passer bør være bedre enn fitting uttrykket i 6.5.1 for en permanent åpen pore.

Representative Results

SBL Kvalitet

Det er viktig å kontrollere kvaliteten og flyt av SBL før fusjonen forsøket. Fluorescensen ved bunnen, glass side av en mikrofluidteknisk kanal bør være ensartet, uten noen åpenbare defekter. Hvis en luftboble passerer om kanalen, vanligvis forlater det synlige arr på SBL. Hvis det er slike store arr / feil, ikke bruk denne kanalen. Noen ganger SUVer kan forholde seg til underlaget, men ikke klarer å sprekke og danne en kontinuerlig SBL. Hvis dette er tilfelle, kan fluorescensen fortsatt vises meget jevn, men vil ikke komme seg etter bleking av en liten region. Vi presenterer 10 mM Mg ²⁺ ofte hjelper å løse dette problemet. Andre stoffer kan innføres for å bidra til sprengning SUVer, for eksempel andre toverdige kationer ^51, en ​​polymerløsning ⁵² eller osmotisk sjokk ^25.

Temperaturendringer fører til endringer av SBL området fordi gjennomsnittlig areal okkupert av en lipid avhenger av temperaturen. Ved å øke temperaturen eller redusere det ved 5-10 ° C eller mer kan resultere i overkant område går inn i rør ekstrudert fra overflaten, eller mørke, SBL-frie flekker vises på overflaten, henholdsvis ^53. Det er derfor viktig å holde temperaturvariasjoner til et minimum.

figur 5 for en SBL som var relativt feilfrie og væske.

Figur 5. FRAP å undersøke SBL flyt. En sekvens av bilder som viser en opplyst område avgrenset av den lukkede feltblenderen (diameter 49 mm) før (første bildet) og etter bleking med et sterkt lys puls. Området er avbildet ved lav lyseksponering å følge fluorescensgjenvinning ved diffusjon av NBD merkede lipider. Diagrammet viser den normaliserte fluorescens som en funksjon av tiden for flere kanaler fra forskjellige dekkglass som indikerer høy grad av reproduserbarhet av fremgangsmåten. Den Lipid Sammensetningen av t-SBL var POPC: SAPE: DOPS: Kolesterol: hjerne PI (4,5) P _2: PEG2000-DOPE: NBD-PE (54,9: 15: 12: 10: 3: 4,6: 0,5 mol% ) og LP = 20.000. Blekemiddelet området var 984.203 μm ^3. Oppgangen tid og diffusjonskoeffisienten beregnet ut fra en plass (se 6.1) var τ = 67,3 sek og D = 1,99 mikrometer ² / sek, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Single-farge Påvisning av Dokking og Fusion hendelser ved hjelp av en Lipid etikett

Manuell telling av docking og fusjonsbegivenheter er en kjedelig oppgave som 100-400 tilfeller per tilstand er nødvendig for god statistikk. Siden SUVer kan flytte på SBL før den festes, er en sporingsprogramvare. SpeckleTrackerJ ²⁶ plugin for ImageJ har funksjoner som er spesielt utviklet for å spore SUVer for analyse av docking og fusjonsbegivenheter. Ofte bare en brøkdel av forankrede vesikler ende opp fusing;å beregne forankrings hastighet mange flere SUVer må spores enn de som smelte eller bare en del av filmen må analyseres inntil et tilstrekkelig antall hendelser blir detektert for en pålitelig estimering. Hvis hovedfokus er fusjon hastighet og / eller docking-til-fusion forsinkelser, bare fikserings SUVer må identifiseres og spores.

Etter å sikre kvaliteten på SBL, blir SUVer innføres i kanalene og deres fluorescens er kontinuerlig spent i henhold til TIR ved hjelp av s-polarisert lys. For de innledende eksperimenter, kan innfallsvinkelen til den TIR eksitasjon strålen må justeres for å justere inntrengningsdybden av den resulterende transiente bølger. En representativ enkelt SUV dokking og fusjons arrangement er vist i figur 6A. Den vesikkel forankret i ramme merket D og fusjon startet i ramme F. Om 1,3 sek senere (ramme S) enkle lipider ble merkbar som de diffust unna fusjon sittee. Den totale fluorescens-intensitet (sum av pikselverdier) i hver boks er plottet som en funksjon av tid i figur 6B, med de rammer ved hvilke forankrings og fusjon skjedde indikert. Den kumulative antall fusjonsbegivenheter som en funksjon av tiden er plottet i figur 6C, for fem forskjellige filmer med t-SNARE rekonstituert SBLs (t-SBL, LP = 20 000, ca 70 t-snarer per kvadratkilometer. Micron). Sammensmeltingen sats fra hver film ble beregnet ut fra en lineær tilpasning til skråningen. Dette gjennomsnittet fusjonsfrekvensen ± SEM er vist som et stavdiagram på panelet D. docking-til-fusjons forsinkelse for det eksempel som er vist i Figur 6A, B, var 0,07 sek. Fordelingen av forsinkelser beregnet på samme måte for en total på 158 arrangementer er vist i figur 6D som en overlevende plott, dvs. sannsynligheten for at en forankret vesikkel ennå ikke smeltet ved en gitt forsinkelse. Ca 1/2 av disse vesikler smeltet i løpet av 100 millisekunder. Med økende kolesterolnivå, er distribuertution av docking-til-fusion forsinkelser forkorter, selv om lipid diffusjon bremser ^27.

Det er viktig å drive kontrollforsøk i parallell. På samme dekkglass som dataene på figur 6B, D er ervervet, ble kontrollforhold testet i nabokanalene. I en kanal, gjorde SBL ikke inkludere noen t-snarer. Ut av 5 filmer som varer 60 sekunder hver, ble bare 7 fusion hendelser registrert i forhold til 158 når t-snarer ble inkludert (figur 6C). I en annen kanal, ble den løselige cytoplasmiske domene av v-SNARE VAMP2 (CDV) inkludert. CDV binder t-snarer på SBL, hindrer binding av full-lengde VAMP2 som er på SUVer. I fem 60 sek filmer, ble ingen fusjonsbegivenheter oppdaget i nærvær av CDV (figur 6C).

Figur 6. SUV-SBL docking og fusjonsbegivenheter. (A) Sekvens av bilder av en v-SUV fusjon hendelse med t-SBL fotografert av pTIRF mikros følgende spredning av LR-PE. Bildene blir tatt hvert 18 msek, bare annenhver ramme er vist. D og F markerer starten på dokking og fusjon, respektivt. Individuelle lipid-etiketter blir identifiserbare som de diffunderer bort fra fusjonssete og en annen (S). Ramme dimensjoner: 16,7 mikrometer x 16,7 mikrometer. (B) Fluorescens intensitet som en funksjon av tid for fusjons arrangementet vist i (A). (C) Akkumulert antall av fusjonsbegivenheter som en funksjon av tid for v-SUV-er merket med VISSTe fra et annet sett med eksperimenter. (D) den normaliserte fusjonshastigheten (gjennomsnitt ± SEM, sx mikrometer ² x pM SUV) ^-1, forutsatt at 2 x 10 ⁴ lipider pr SUV og (E) overlevelsen sannsynligheten for en gitt tid etter dokking av vesikkel. Sammensetningen for alle SBLs var POPC: SAPE: DOPS: Kolesterol: hjernen PI (4,5) P _2: PEG2000-DOPE: NBD-PE (54.9: 15: 12: 10: 3: 4,6: 0,5 mol%) og LP = 20.000. v-SUV var sammensatt av POPC: SAPE: DOPS: Kolesterol: PEG2000-DOPE: LR-PE (57.4: 15: 12: 10: 4,6: 1 mol%) og LP = 200 for A og B. For CE, v -SUV sammensetning var lik, bortsett gjorde var brukt i stedet for LR-PE. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Lipid spredningsevne, Vesikkel størrelse, og Fusion Pore Properties

Den single-molekyl følsomhet av analysen tillater utvinning av flere parametre i tillegg til tilkoblings og fusion priser og docking-til-fusion forsinkelse distribusjoner. Enkle, fluorescensmerkede lipider bli merkbar som de sprer seg bort fra fusjons området (Figur 6A). sporing these direkte gir lipid diffusivitet ^26, , Og en digital måling av blekehastigheten for fluoroforer i SBL ^27. Som nevnt i innledningen, fluorescensemisjonen av etikettene avviker i SUV versus i SBL, skyldes tre forhold som er generelt vanskelig å greie: (i) dequenching av etiketter ved fusjon, på grunn av deres fortynning når de overføres inn i SBL , (ii) en høyere intensitet eksitasjon i SBL på grunn av nedbrytning av det flyktige feltet generert av TIR, og (iii) orienteringen av fluorofor overgangs dipoler med hensyn til polarisering av strålen eksitasjon. Størrelsen av faktor (ii) avhenger av de relative størrelser av det flyktige feltet forråtnelse lengde og vesikkel størrelse og er forskjellig for hver fusjon hendelse på grunn av dispersitet i SUV størrelser. Faktor (iii) avhenger av fluoroforen og polariseringen som brukes. Snarere enn å prøve å di sentangle disse effektene, man kan måle styrken av fluorescensen endringen direkte ved å sammenligne de totale pikselverdier i et område som omgir et SUV før fusjon og etter at alle fluoroforer er blitt deponert i SBL følgende fusjon (figur 3A, (1) g ( 2)). I motsetning til i tidligere arbeid ^29,44, bør regionen velges tilstrekkelig stor slik at ingen fluorophores vil ha forlatt den via diffusjon for tiden vurderes etter fusjon. Å velge en 30 x 30 piksler region (8 um x 8 um) for analyse opptil 1,6 sek etter at sammensmelting er vanligvis tilstrekkelig ^27. Ignorerer bleking for øyeblikket, forholdet mellom før og etter fusjon gir fluorescensintensiteten reduksjonsfaktor, . Det vesikkel størrelse kan estimeres gitt fluorescensintensiteten av en enkelt etikett i SBL (iles / ftp_upload / 54349 / 54349eq6.jpg "/>), faktoren som sin intensitet vil bli redusert hvis det var i en SUV ( ), Den kjente tettheten av etiketter i SUV, og det areal som opptas av en lipid. I praksis er bleking vanligvis rask nok at når alle merkene er deponert i SBL, har noen allerede bleket. Av denne grunn, for en nøyaktig estimering, fluorescensintensiteten reduksjonsfaktor, Og lipid frigivelse tid, Er beste trukket ut fra en tilpasning til tidsforløpet av de totale pikselverdiene som tar hensyn til bleking ^27. Bleke frekvensen av etiketter i SBL er uavhengig beregnet fra enkelt lipid fargestoff sporing, eller ved å montere en eksponensiell til den totale intensiteten profil, , Ved lange tider (f.eks regime (3) i figur 3). Å vite størrelsen på et fikserings vesikkel og lipid diffusivitet muliggjør sammenligning av den aktuelle lipid frigivelse tid, , Til diffusjonstiden av en lipid rundt vesikkel Hvor A _ves er det vesikkel-området og er lipid spredningsevne. Hvis de to tidsskalaer er sammenlignbare, presenterer pore litt motstand mot lipid utgivelsen, og utgivelsen er diffusjon begrenset. Hvis derimot Da pore hemmer lipid fluks betydelig. Et kvantitativt mål for retardasjonen er "pore åpenhet", P _0, lik forholdet ganger en faktor of For enhet knyttet til poregeometri ^27. For en to-stat, åpen / lukket pore, P ₀ er brøkdel av tiden i åpen tilstand. For en flimrende pore hvis størrelse kontinuerlig varierer, P ₀ representerer den gjennomsnittlige tids radius i forhold til helt åpen radius.

Signal-til-støy-forhold må være tilstrekkelig god for sporing av enkelt lipid fluoroforer. Dette er lettere oppnås i ensfargede eksperimenter, ved hjelp av en lys markør som LR-PE.

Samtidig Påvisning av Lipid og Løselig Cargo utløsning

Et representativt arrangement er vist i figur 7. Ved de høye konsentrasjonene som benyttes for innkapsling, er det SRB fluorescens innledningsvis selv slukkes. Derfor er de fleste kai v-SUVer er bare påvises ved deres VISSTe signal ^27. En kraftig økningi hadde fluorescens markerer lipid blanding, som i ensfargede lipid-label eksperimenter. Utbruddet av lipid utgivelsen sammenfaller med utbruddet av en økning i SRB fluorescens. Denne økningen var mest sannsynlig på grunn av SRB dequenching som SRB molekylene unnsluppet SUV og den gjenværende SRB ble fortynnet til under selvlukkende konsentrasjoner. Interessant, SRB fluorescens nådd et stabilt platå. Dersom fusjons pore forble åpen, vil man forvente SRB-signal til å øke til et maksimum på grunn av dequenching, etterfulgt av en reduksjon til bakgrunnen som den resterende SRB venstre SUV, eller hvis den SUV kollapset i SBL. Den stabile platået indikerer mest sannsynlig pore resealed etter frigir alle lipid etiketter og en brøkdel av løselig last.

I noen tilfeller ble det lipid utløsersignalet ikke ledsaget av noen detekterbare innhold slipper signaler. Dette kan være enten fordi porene var for små til å tillate passasje av SRB, eller noenhvordan SUV hadde allerede mistet sin løselig last. For å skille mellom disse to mulighetene kan bleking av forankrede SUVer skal analyseres. Bleking av lipid etiketten VISSTe reduserer dens fluorescens-signalet i løpet av sekunder, mens bleking av de innledningsvis selv bråkjølt SRB resulterer i en økning av SRB-signalet som en brøkdel av SRB er foto-omdannet til andre produkter og selvlukkende er lettet. Mens de fleste kai SUVer (48 av 58 analyserte hendelser) vises den forventede økningen i SRB fluorescens over lengre belysning, gjorde en liten del (10/58) ikke viser noen SRB signaler i det hele tatt. Således kan en liten fraksjon av SUVer mister sin oppløselige innhold i perioden mellom fremstilling og anvendelse i eksperimentene.

I mer enn 80% av hendelser (74 av 91) som både SRB og gjorde signaler kunne følges, SRB fluorescens økt og holdt seg på et stabilt platå ^27. I ~ 20% av these tilfeller de rester SRB fluorescens ble plutselig sluppet opp til et par sekunder senere. Dette kan enten skyldes en gjenåpning av pore å tillate rask, fullstendig frigjøring i løpet av 1-2 rammer (18-36 msek) eller en sprengning av SUV på grunn av akkumulert foto-skade ^16. Uansett opprinnelse, det andre, styrer hurtig frigjøring av SRB ut muligheten for at rest SRB-signalet etter den opprinnelige frigjøring kan være forårsaket av den SRB gjenværende innesluttet i rommet mellom SBL og glass-substratet etter full frigjøring. En slik mekanisme er foreslått i en tidligere studie hvor den SBL ble støttet direkte på glass, med lite mellomrom mellom de to ^16. I motsetning til dette, bør det pegylerte Lipidene anvendt i denne analysen tilveie 4-5 nm av rommet mellom SBL og glasset ^25, slik at SRB til å diffundere vekk fra fusjons området.

Figur 7. Simultan eous lipid og innhold utgivelse. Fluorescens signaler fra lipid (blå) og innhold (rød) markør for en SUV-SBL fusjon hendelse (for mer informasjon se tekst). Snapshots fra hver kanal vises nederst (4,0 mikrometer brede). Tegneserier (i midten) illustrerer de ulike stadier. (1) SUV dokker, gjorde fluorescens er lav. (2) Fusion tillater overføring av VISSTe inn i SBL og gjorde fluorescens øker. SRB signalet øker også selvlukk er lettet ved rømning av SRB gjennom pore. (3) SRB signalet forblir stabil, mens gjorde molekyler diffunderer i SBL som indikerer en mulig resealing av pore. (4) SRB signaler avta meget hurtig, på grunn av rask fullstendig sammensmelting eller liposom sprengning. Sammensetningen av v-SUVer ble POPC: SAPE: DOPS: PEG2000-DOPE: gjorde (67: 15: 12: 5: 1 mol%), LP 200, mens T-SBLs var sammensatt av POPC: SAPE: DOPS: hjerne PI (4,5) P _2: PEG2000-DOPE: NBD-PE (64,5: 15: 12: 3: 5: 0,5 mol%) og LP = 20.000. = "_ Blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

FRAP_instructions.pdf -. Instruksjoner for å sette opp en FRAP sekvens Klikk her for å laste ned denne filen.

ReadMe_FRAP.txt -. Tekstfil som beskriver fremgangsmåten for å analysere FRAP gjenopprettingsdata ved hjelp av Matlab-kode som følger Klikk her for å laste ned denne filen.

EK_FRAPbatch.m - MATLAB filen til batch-analysere fluorescens gjenoppretting etter fotobleking. Denne filen kaller MATLAB subrutiner EK_getFRAPvals.m og EK_SoumpassisFit.m."_blank"> Klikk her for å laste ned denne filen.

EK_getFRAPvals.m -. MATLAB fil, subrutine kalt av EK_FRAPbatch.m Klikk her for å laste ned denne filen.

EK_SoumpassisFit.m -. MATLAB fil, subrutine kalt av EK_FRAPbatch.m Klikk her for å laste ned denne filen.

JN150923c1_FRAP_list.txt -. Et eksempel på en liste over filnavn å være batch-analysert av hoved MATLAB script EK_FRAPbatch.m Klikk her for å laste ned denne filen.

DeFølgende filer kan TIF stabler og de tilhørende tekstfiler for fem eksempler på FRAP sekvenser som kan analyseres ved å kjøre EK_FRAPbatch.m og velge JN150923c1_FRAP_list.txt filen når du blir bedt om å velge en liste fil.

JN150923c1_F1_MMStack_Pos0.ome.tif -. FRAP bildestakk Klikk her for å laste ned denne filen.

JN150923c1_F1_MMStack_Pos0_metadata.txt -. Tilsvar tekstfil med metadata Klikk her for å laste ned denne filen.

JN150923c1_F2_MMStack_Pos0.ome.tif -. FRAP bildestakk Pllette klikk her for å laste ned denne filen.

JN150923c1_F2_MMStack_Pos0_metadata.txt -. Tilsvar tekstfil med metadata Klikk her for å laste ned denne filen.

JN150923c1_F3_MMStack_Pos0.ome.tif -. FRAP bildestakk Klikk her for å laste ned denne filen.

JN150923c1_F3_MMStack_Pos0_metadata.txt -. Tilsvar tekstfil med metadata Klikk her for å laste ned denne filen.

JN150923c1_F4_MMStack_Pos0.ome.tif - FRAP bildestakk. Klikk her for å laste ned denne filen.

JN150923c1_F4_MMStack_Pos0_metadata.txt -. Tilsvar tekstfil med metadata Klikk her for å laste ned denne filen.

JN150923c1_F5_MMStack_Pos0.ome.tif -. FRAP bildestakk Klikk her for å laste ned denne filen.

JN150923c1_F5_MMStack_Pos0_metadata.txt -. Tilsvar tekstfil med metadata Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Vellykket gjennomføring av SUV-SBL fusjon analysen beskrevet her, avhenger kritisk av flere viktige skritt, for eksempel funksjonell tilberedning av proteiner i liposomer, få god kvalitet SBLs, og velge de riktige bildeparameterne for å oppdage enkle molekyler. Selv om det kan ta litt tid og krefter på å lykkes, når analysen er gjennomført med suksess, gir det et vell av informasjon om fusjonsprosessen ikke er tilgjengelig fra noen annen in vitro fusjon analysen diskutert i Introduksjon. Satsene ved hvilke SUVer forankre på og sikring med SBL, fordelingen av forankrings-til-fusjons ganger, lipid diffusivitet, størrelsen av hver fikserings liposom, og enten lipid frigivelse for en gitt fusjon arrangement er diffusion- eller pore-kontrollerte kan vær bestemt. Hvis utgivelsen er mye tregere enn forventet fra diffusjon, en modell som foruts pore flimring ligger under retardasjon av lipid utslipp gir, P _0, brøkdel av tiden pore jeger åpen om fusjon ^27.

Tidligere arbeid sondering enkelt SUV-SUV fusjon ^18-20,28 eller fusjon av liposomer og viruspartikler til SBLs ^{15-17,21,22,33,44} støttet seg på gnage og selvlukk mellom fargestoffer. I motsetning til dette har vi i stor grad unngå fargestoff dequenching å undersøke kinetikken av lipid etikett overføringen til SBL, av to grunner. Først er FRET effektivitet et sterkt ikke-lineær reporter av lipid utgivelse. Små endringer i den inter-dye avstand d føre til store endringer i FRET effektivitet, men bare for et begrenset utvalg av D / R _0-verdier, hvor R ₀ er Forster avstand. Det vil si, en forsinkelsestid mellom faktisk fargestoff fortynning og en observert økning i dequenching signal kan forekomme, på grunn av den tid som kreves for å slippe til en verdi i nærheten av _0-R. Tilsvarende er det liten endring i den dequenching signal når fargestoffet tettheten avtar i tilstrekkelig grad ved lipid frigjøring slik at 0 1,4, selv om en betydelig mengde av fargestoff fremdeles forblir i vesikkel. Disse egenskapene gjør dequenching et godt verktøy for å få en topp i signalet for å oppdage fusjonsbegivenheter, men komplisere kvantitativ kinetisk analyse av lipid utgivelsen bruke høy tidsoppløsning. I motsetning til dette, endringer i intensitet på grunn av dipol reorientering og flyktig felt effekter som en fluorofor overføringer fra en SUV inn i SBL lineært relatert til brøkdel av fargestoff fremdeles er i SUV. For det andre, kan høye konsentrasjoner av lipid etiketter kreves for selvlukk påvirke fusjonsprosessen i seg selv.

For polarisert TIRF eksitasjon, en hjemme-bygget oppsett som i figur 4 er kostnadseffektivt og gir god kontroll over polariseringsegenskaper. Imidlertid er en hjemme-bygget oppsett ikke er nødvendig, som i det minste noen kommersielle TIRF mikroskop bruker polarisert eksitasjon og off-the-sokkelto-farge utslipp splitting moduler er tilgjengelige. En kommersiell mikroskop som bruker en polarisering-vedlikehold (PM) fiber til par polarisert eksitasjon lyset dukker opp fra laseren til mikroskopet ble brukt med hell tidligere ^25-27. I et slikt instrument, kan polarisasjonen bli rotert bare ved å rotere PM fiberinngangen til mikroskopet TIRF enhet. I motsetning til dette kan enkelte andre kommersielle oppsett anvender en polariserende strålesplitter-i TIRF enheten, noe som gjør polariserings justeringer mer vanskelig eller umulig. Dessverre, polariseringsegenskaper er ofte ikke spesifisert for kommersielle systemer. Dermed er det kritisk for brukere som ikke ønsker å konstruere en hjemme-bygget system for å diskutere polariseringsegenskaper og for å prøve en demo enhet før du investerer i en bestemt kommersiell alternativ.

Samtidig overvåkning av lipid og løselig last utgivelsen gir ytterligere informasjon om fusjonsprosessen. Mange porene synes å forsegle etter releAsing bare en brøkdel av det oppløselige etiketten innkapslet i en SUV ^27. Vanligvis alle lipid etikettene er utgitt av den tiden pore forsegler, slik pore resealing ble ikke mistenkt tidligere fra overvåking lipid utgivelse alene. Faktisk, overvåking lipid frigivelse alene, hadde Kiessling et al. ²⁹ antydet overføring av merkede lipider inn i SBL oppstått via ekstremt hurtig sammenbrudd av hele SUV membranen inn i SBL.

Forsegles av fusjon porene etter delvis frigivelse av innholdet ble tidligere observert i en liposom-tethered dobbeltlag patch fusjon analyse. Rawle et al. ⁵⁴ preparerte frittstående bilag patcher som ble tjoret på en dekk av ~ 8 nm lange DNA-avstandsstykker. De innføres så liposomer hvis fusjon til dobbeltlaget plasteret ble drevet ved hybridisering av komplementære enkelt-trådede DNA-lipid-konjugater forankret til liposom og patch membraner. 12% av alle hendelsene var forbigående fusjoner, noe som resulterer i en delial utgivelsen av liposom innholdet. Liposom sprengning hendelser, sett i noen tidligere SUV-SBL fusion-analyser ^44, var svært sjeldne. Forfatterne foreslo ~ 8 nm plass under bilaget lapp og hindrer bilaget-substrat interaksjoner, kan det tillates ikke-lekkende overføring av liposom-innholdet til rommet under bilaget. I tillegg ble diffusjon av de frigjorte oppløselige etikettene ikke i vesentlig grad hindret i rommet mellom den plane bilaget og glassubstratet. I analysen beskrevet her, er den plane bilaget på lignende måte holdt ~ 5 nm bort fra dekkglass ved nærvær av poly (etylenglykol) -lipid konjugater.

Den ekstra informasjon fra to-farge overvåking av løselig og lipid last kommer med noen avveininger. For det første er utarbeidelsen av SUVer med de to etiketter noe mer involvert enn inkludert lipid etiketter alene. For det andre er det en viss uunngåelig tap av signal-til-støy ved overvåking av signaler fra lipid etikettene ved than samme oppkjøp takt som i ensfargede lipid utslipp eksperimenter (15-20 millisekunder per ramme). Noe av dette tapet skyldes det faktum som gjorde, brukes som en lipid etikett sammen med løselig SRB markør, er ikke så lyssterk som LR-PE brukes i ensfargede eksperimenter. Ytterligere tap som skyldes høyere bakgrunnen på grunn av simultan to-laser eksitasjon og ytterligere komponenter i den optiske bane (figur 4). Så langt lavere signal-til-støy hindret oss fra pålitelig sporing av enkelt VISSTe etiketter i to-farge eksperimenter. Dette igjen hindret en grundig analyse for å trekke ut all informasjon som kan være med ensfargede LR-PE målinger. Denne utfordringen kan løses i fremtiden ved å optimalisere anskaffelses forhold og teste andre par av kompatible etiketter med forbedrede egenskaper.

Samtidig overvåkning av løselig og lipid last utgivelsen kan også oppdage hemifusion, en tilstand der de proksimale brosjyrer har smeltet, men den distalebrosjyrer har ikke. Faktisk kan slike to-farge eksperimenter gir den eneste avgjørende vurdering av tilstedeværelse av hemifusion i andre in vitro-analyser fusjons ^18,20. Imidlertid kan hemifusion pålitelig påvises i én farge SUV-SBL eksperimenter overvåking lipid utgivelsen alene ^22,44. I slike forsøk, ca 1/2 opprinnelige lipid etiketten intensiteten av en SUV forblir ved fusjon sted. De resterende intensitet kan forsvinne når de fjerne flygeblader smelte litt tid senere, hvis stedet har ennå ikke bleket.

Bruk med pegylert lipider å innføre en myk pute mellom SBL og glass støtten har vært avgjørende i å gjengi den SNAP25 kravet om eksocytose. Protokoll resulterer i en PEG børste som dekker den siden av SBL som vender mot strømningskanalen i tillegg. Dette har noen fordeler, for eksempel redusere uspesifikke interaksjoner mellom SUV og SBL, som forklart i Introduksjon. Hvis proteiner som samhandler med fosfolipider avSBL innføres i analysen, vil imidlertid PEG børsten presentere en sterisk barriere mot slike interaksjoner. Således kan for noen anvendelser vil det være ønskelig å inkludere PEG lag asymmetrisk, bare mellom SBL og dekkglass. Den side av SBL vender mot strømningskanalen vil da være i stand til å samhandle med fosfolipid-bindende proteiner, så som synaptotagmin. Dette kan oppnås ved hjelp av bifunksjonelle PEG-kjeder som kan bli covalent bundet til dekkglass ved en ende og bærer en lipid anker i den andre. Langmuir-Blodgett metoder kan så anvendes for å avsette et lipid monolag på PEG laget ^55. Liposomer som innføres over denne hydrofob overflate sikring med det, som danner et to-lags ^56. Håpet er at denne tilnærmingen vil bli kombinert med MicroFluidics i fremtiden.

Det er forventet at SUV-SBL analysen som presenteres her vil være nyttig i å utforske rollen som ekstra proteiner som samhandler med snarer,slik som Munc18 / Sec1 familie, kalsium føleren synaptotagmin-1, og complexin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Milli-Q (MQ) water	Millipore
KOH	J.T. Baker	3040-05
Ethanol 190 Proof	Decon
Isopropanol	Fisher Chemical	A416P4
HEPES	AmericanBio	AB00892
Sodium Cholride (KCl)	AmericanBio	AB01915
Dithiothreitol	AmericanBio	AB00490
N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	AmericanBio	AB00892
EGTA	Acros Organics	409911000
Buffers
HEPES-KOH buffer (pH 7.4)			25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 μM EGTA, 1 mM DTT
Solvents
Chloroform	J.T. Baker	9180-01	in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Methanol	J.T. Baker	9070-03	in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Liposome preparation
Gastight Hamilton syringe	Hamilton	var. sizes	only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)
Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm screw cap culture tube	Pyrex	70825-16	clean thoroughly, rinse with chloroform
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC)	Avanti Polar Lipids	850457	Lipids come dissolved in CHCl3 or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 °C. Keep stocks in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at -20 °C. let come to RT before opening
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS)	Avanti Polar Lipids	840035	Same as above.
1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE)	Avanti Polar Lipids	850804	Same as above.
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2	Avanti Polar Lipids	840046	Same as above.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE	Avanti Polar Lipids	810145	Same as above.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE	Avanti Polar Lipids	880130	Same as above.
cholesterol (ovine wool, >98%)	Avanti Polar Lipids	700000	Same as above.
DiD' oil; DiIC18(5) oil (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate)	Molecular Probes	D-307
Rotavapor R-210	Buchi	R-210	heat bath above Tm of lipids used
OG n-Octyl-β-D-Glucopyranoside	Affymetrix	0311	store at -20 °C, let come to RT before opening
Shaker - Eppendorf Thermomixer R	Eppendorf
Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20k MWCO, 3 ml	life technologies	66003
Bio-Beads SM-2 Adsorbents	Bio-Rad	1523920
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556
Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	41121703
Beckman SW41 Ti rotor
SuflorhodamineB	Molecular Probes	S-1307
Econo-Column Chromatography Columns, 2.5 × 10 cm	Bio-Rad	7372512
Sepharose CL-4B	GE Healthcare	17-0150-01
SYPRO Orange Protein Gel Stain	Molecular Probes	S-6650	5,000x Concentrate in DMSO
PDMS block
Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS	Dow Corning	3097358-1004
Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover	Corning	3160-152
Hole puncher - Reusable Biopsy Punch, 0.75 mm	World Precision Instruments	504529
Manual Hole Punching Machine	SYNEO	MHPM-UNV
Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch	SYNEO	CR0350265N20R4	drill diameter: 0.9 mm, punch bore size: 0.74 mm
Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD	Cole-Parmer	06419-00	0.010" ID, 0.030" OD
Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD	Cole-Parmer	95802-00	0.020" ID, 0.083" OD
Cover glass - cleanroom cleaned
Schott Nexterion cover slip glass D	Schott	1472305
plasma cleaner	Harrick	PDC-32G
pTIRF setup and accessories
IX81 microscope body	Olympus	IX81
EM CCD camera	Andor	ixon-ultra-897
Thermo Plate, heated microscope stage	Tokai Hit	MATS-U52RA26
1 ml hamilton glass syringes (4x)	Hamilton	81365
syringe pump	kd Scientific	KDS-230