Introduction
המחקר של רקמות, איברים או מערכות במבחנה הוא ניסיון לפשט את היחסים המורכבים מאוד הקיים בין תת הסלולר מספר המרכיבות יצורים רב-תאיים. ואכן, מחקרים במבחנה מאפשרים לרכוש הבנה מפורטת של אוכלוסיות תא בודדות. ישנם שני יתרונות גדולים של עורכת ניסויים במבחנה: 1) מופחתים אינטראקציות הסלולר, ו -2) את היכולת לתפעל את הסביבה התאית בקלות. לפיכך, שני יתרונות אלה מדענים מותר לחזות את ההתנהגות של סוגי תאים מסוימים in vivo, שמוביל את היכולת לווסת תוצאות של השפעות חיצוניות באורגניזמים כולו. במובן זה, תרבית תאים במבחנה בדרך כלל עובדת כגשר מחבר מדעי חיים בסיסיים ויישומים. עם זאת, ישנם גם כמה חסרונות של עבודה במבחנה, אחד החשוב ביותר להיות כי הזמנה מסוימת עשויה לשכון הפיזיולוגיאל הרלוונטיות של פנוטיפים שנצפו. ואכן, כאשר סוג תא בודד הוא גדל בתוך סיר, התרבות מאבדת במידה שונה, קשרים בין התאים עם סוגי תאים אחרים, תרומתה לסביבת הלחות מן רקמות האורגניזם מוצא, ואת העוגנים בתוך הרקמה, שאיפשרה לו לקיים מבנה תלת ממדי בפרט לפעמים חיוני לתפקוד התא.
שאל יחסים בין תאים טופל על ידי הפיתוח של טכניקות תרבות מעורבות. בשיטה זו, שתיים או יותר אוכלוסיות תאים גדלות יחד באותו כלי התרבות. עם זאת, תרבויות המעורבות אלה לשאת טרדות חשובות. מצד אחד, תת תא מסוים אינו אינטראקציה פיזית עם אחד אחר בתוך הרקמה ממוצא ולהסתמך אך ורק על תקשורת paracrine שנגרמה גורמים מסיסים מופרשים קולטנים סמוכים. זהו המקרה במשך כמה תהליכים דלקתיים שתלויים איתות ציטוקינים הפרוקסימלי. ב- C מעורבתultures, אינטראקציות פיסיות הם בלתי נמנעות ולעשות את זה אי אפשר ללמוד תקשורת paracrine בהעדר קשר תאי תאים שיכולים להניב תוצאות שינו. מצד שני, השגת פרשנויות תא ספציפי מתוך אוכלוסייה מעורבת הופך ישים ללא שימוש בטכניקות הפרדה קשים שיש בהם כדי להשפיע באופן משמעותי תוצאות.
כדי לפתור סוגיות חשובות אלה, השימוש בתקשורת מותנית פותח כטכניקה המאפשרת תרבויות ממודרות וחקר האיתות אוטוקריני. שיטה זו דורשת העברת supernatant של סוג תא אחד, ובכך בשם בינוני מותנה, כדי בארות המכילות אוכלוסייה אחרת של תאים. עם זאת, חיסרון שחשוב זה מולקולות קצרת אינם שורדים מספיק זמן במדיום מותנה שיועברו הבארות של האוכלוסייה השנייה של תאים. גם מולקולות האריכה ימים ידוללו באופן משמעותי לאורך זמן עקב דיפוזיה. יתר על כן, הן תאאוכלוסיות להשתתף רק בתקשורת paracrine חד כיווני ולא בתקשורת דו-כיוונית פעילה. זה מוביל בהעדר איתות כי משוב הוא חיוני מחדש יחסים רב-תאיים מדויק ככל שהם קיימים in vivo.
כתוצאה מכך מונע על ידי הצורך לדמות את המקורי טוב יותר בתנאי vivo בסביבת הסלולר במבחנה, כמה התקדמות טכניקות תרבית תאים הושגה במהלך השנים. אחד הפיתוחים המשמעותיים ביותר כבר בשימוש תומך חדיר עם ממברנות microporous עבור מידור בתרביות תאים, השתמשו בפעם הראשונה על ידי Grobstein בשנת 1953 1. תומך חדיר כאלה כבר מותאם לאורך השנים כדי להתאים סוגי תאים רבים כדי לשמש בכמה יישומים שונים. כיום, עזרה כזאת להתקיים כתוספות חלולות אשר נועדו לנוח בבארות מתוך צלחת תרבות multiwell רקמות או circuמנות Lar. במערכת שיתוף תרבות, את הכנס מכיל סוג תא אחד ואילו הבאר או צלחת מכילה האוכלוסייה התאית האחרת, מה שמאפשר ללמוד את התרומה של שתי אוכלוסיות שונות של תאים על סביבת הלחות שלהם (איור 1). כתוצאה מכך, קוטביות הסלולר (basolateral vs הפרשת פסגה או קבלת אות) נשמרה, ובכך מקנה מערכות שיתוף תרבות כנס יתרון חשוב על פני תרבויות מעורבות וטכניקות בינוניות מותנות. ישנם מספר סוגים של חומרי קרום זמינים, אלה הנפוצים ביותר פוליאסטר להיות (PET), פוליקרבונט (PC) או מצופה קולגן polytetrafluoroethylene (PTFE), והם קיימים בגדלים נקבוביים שונים הנעים בין 0.4 מיקרומטר 12.0 מיקרומטר. אלו סוגים של חומרים וגדלים נקבוביים מציעים קשת של הוסיף הפעלת תכונות משתנות רלוונטיות תכונות אופטיות, עובי קרום ודבק תא שהופכים אותם מעשיות ברמות שונות עבור השימושים הבאים לא מוגבלים ל:
-studyingהתמיינות תאים, התפתחות עוברית, גרורות של גידולים ותיקון פצע על ידי מבחני chemotaxic דרך ממברנות חדירות;
-evaluating חדירה התרופה על ידי הערכת התחבורה שלהם באמצעות monolayers אפיתל או אנדותל בתרבית על תומך חדיר, ו;
תא שיתוף תרבויות -ביצוע לנתח מודולציות התנהגות התא הנגרמת על ידי גורמים מסיסים מופרש בהעדר מגע תאים תאים.
מטרת מאמר זה היא לתאר שיקולים מתודיים הרחב למלא את הפונקציה השלישית כאמור לעיל, כי היא להעריך שינויים הסלולר בתיווך גורמים מסיסים מופרש בהעדר מגע תאים תאים באמצעות מערכת שיתוף תרבות הכנס. שדות שונים של מחקר לעשות שימוש במערכות שיתוף תרבות הכנס על מנת לענות על שאלות רלוונטיות שפעת גורמים מסיסים המופרשים על אוכלוסיות של תאים. ואכן, איתות אוטוקריני כי מודולציה התנהגות הסלולר ברמות שונות היא רלוונטית בכל הרקמותומערכות, מה שהופך מערכות שיתוף תרבות הכנס הכרחית כדי להבטיח התקדמות בתחומים אלה. לעומת זאת, השימוש מוסיף יכול לאשר כי תמרת אות על ידי מגע תאי תאים ישיר ולא על ידי גורמים מופרשים. אחד השימושים החשובים ביותר של מוסיף הוא במחקרי דלקת 2-14 בם ההשפעה של ציטוקינים מופרשים מוערכת ב שחקנים הסלולר שונים של חסינות. בפרט, המחקר של דלקת במערכת העצבים המרכזית (CNS) הרוויח מאוד ממחקרי שיתוף תרבות כנס, אשר אפשרו עדיפה בהגדרת תפקידי paracrine הברור של נוירונים המיקרוגליאה נהיגת neuroinflammation 15-21. מערכות אלו תוכננו גם ללמוד את הפוטנציאל האנטי-דלקתיות של מולקולות המסתמכת על יכולתם להפחית או למנוע את הפרשת גורמים פרו-דלקתיים 22-26. מחקר הנוגע סרטן 27-31, בפרט מנגנוני אנגיוגנזה 32-34 ו inflammatiעל 35-42 ב tumorigenesis, נהנה גם מערכות שיתוף תרבות הכנס. יתר על כן, גורמים מסיסים הם בעלות חשיבות עליונה בתהליכים שמניעי הבידול מספר מחקרים השתמשו מוסיף לענות על שאלות בדרך מסוימת שדה 43-50. במערכת העצבים המרכזית, כמו לראות רקמה עצבית יש פוטנציאל התחדשות מוגבלת מאוד, חקר neurotrophism ו neuroprotection הוא יסודי כבר הבטיחו נרחב על ידי שימוש בתאי גזע במערכות שיתוף התרבות 51-56. בנוסף, מוסיף גם מנוצלים בתחומים מגוונים כמו נפרולוגיה 57,58, אינטראקציות האנדותל אנגיוגנזה 59-62, אפופטוזיס איתות 63-65, דלקת השמנה ותסמונת מטבולית 22,23,66-67, אוזן פנימית הגנה על תאי שיער 68,69, ואפילו ארסי פטריית 70,71 ופרזיטולוגיה 72,73.
מאמר זה מציע קווים מנחי מתודולוגיים כללי כדי להקים experimאף אוזן גרון לאור הערכת שינויים הסלולר בתיווך גורמים מסיסים מופרשים באמצעות מערכת שיתוף תרבות הכנס. בפרט, נוכל למקד את תשומת הלב שלנו על תרבויות-שיתוף תא העצב ואת השימושים שלהם בלימוד תהליך neuroinflammatory. בהתחשב הספקטרום רחב מאוד של ניסויים מוסיף לאפשר לטייס, זה בלתי נסבל לכסות כל היבט של טכניקת תרבית תאים זה. כדוגמא, פרוטוקול ספציפי כדי למדוד את ההשפעות של ציטוקינים המופרשים על ידי lipopolysaccharide (LPS) -activated microglia N9 על תאי PC12 עצביים שיפורט, מציע הבנה בטון של המתודולוגיה שיתוף תרבות כנס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נ.ב: כל אחד מן השלבים הבאים צריך להתבצע בתנאים סטריליים במנדף זרימה למינרית כנדרש על תרבית תאים יונקת. בנוסף, ההנחיות הכלליות לגידול תאים סטריליים אופטימליים להחיל, למשל., השלכת טיפים בכל עת שהם עלולים לגרום זיהום צולב, הפחתת כמות תאי הזמן נחשפים לאוויר בעת ביצוע שינויים התקשורת כולו, כמו שצריך, אבל בעדינות כדי ערבוב את כל המתלים תא כדי להבטיח pipetting הומוגנית שלהם, ועוד יותר מכך, מוסיף הם סוג של plasticware הדורשים טיפול מיוחד. ראשית, בכל פעם מוסיפה הם מניפולציה, אל תיגע קרום השביר, הקורעת בקלות ולכן עלול לסכן את הניסוי. כמו כן, אין זה נכון להציג ואקום שאיפה של מדיום תרבית תאים, כפי קיים סיכון של ניקוב הקרום או מתנערים תאים חסידים. לאחר מכן, מוסיף לתלות רופפת בצלחת תרבות multiwell רקמות, ולכן יש להיזהר מועסק כאשר מווינג plasticware או כאשר pipetting להימנע מתנערים תאים חסידים. בנוסף, בעת שימוש מוסיף עם גדלים נקבוביים גדולים, קיימת אפשרות כי מדיום תרבית תאים מחלחל דרך הממברנה, ולכן חשוב לעקוב אחר רמת נוזל לעתים קרובות. לבסוף, יש לציין כי הפרוטוקול הבא מיועד תאים חסידים ודורש שינויים קלים כדי להיות מתאים תאי השעיה.
1. הנחיות כלליות לביצוע ניסויי שיתוף התרבות כנס
- סוג תא מתזמן # 1 מוסיף
- לגולל את מוסיף מהאריזה שלהם.
- מניחים את מוסיף ב צלחת בתרבית רקמה multiwell ריק של הממד הנכון. לשם כך, אחיזה בקצה העליון של הכנס באמצעות פינצטה.
- כדי לשפר את ההתקשרות והפצת תאים חסידים, להתנות מחדיר עם תרבית תאים בינוני לפני הזריעה. לשם כך, לכסות את כל פני השטח של הממברנה עם mediu תרבית תאיםמ באמצעות micropipette.
הערה: בצע פעולה זו עבור רבים מוסיפים כנדרש. - החלף את המכסה על הצלחת דגירה במשך לפחות שעה 1 או O / N באותם תנאים (בדרך כלל 37 מעלות צלזיוס, 5-10% CO 2).
- כאשר מוסיף מותנים, להסיר את כל מדיום תרבית תאים באמצעות micropipette. מחק את המדיום בשימוש.
- סוג תא זרע # 1 במדיום תרבית תאים טרי באותו אופן כמו צלחת multiwell. לשם כך, לצייר נפח מתאים של השעיה התא עם micropipette לוותר הנוזל להכניס את.
הערה: כן כמו רבים מוסיפים כנדרש. - לאחר זריעת כל המוסיף, נער בעדינות את הצלחת על ימין ועל שמאל, אז קדימה ואחורה כדי לפזר את התאים באופן שווה. הימנע בתנועות סיבוביות, כמו זה יגרום לתאים לצבור במרכז מוסיף.
- מניחים את המכסה על הצלחת דגירה כפי שצוין על ידי בהתאם לדרישות הסלולר (בדרך כלל 37 מעלות צלזיוס, 5-10% CO
- סוג תא מתזמן # 2 צלחות בתרבית רקמה multiwell
- סוג תא זרע # 2 במדיום תרבית תאים טרי לפי סעיף 1.
- הכן כמה בארות כנדרש עבור מספר מוסיף. Rock the צלחת כמו בשלב 1.1.7) על מנת להבטיח כי התאים מופצים בצורה אחידה בתוך הבארות.
- מניחים את המכסה על הצלחת דגירה באותם תנאים (בדרך כלל 37 מעלות צלזיוס, 5-10% CO 2).
- בינוני מרענן מוסיף
- שימוש micropipette, להסיר חלק או את כל תרבית תאים בינוניים, ב מחדיר המכיל סוג תא # 1. מחק את המדיום בשימוש.
- צייר נפח מתאים של תרבית תאים בינוניים טריים. בעדינות לנוח הקצה על הקיר הפנימי של להכניס ולאט לאט לוותר על תרבית תאים בינונית.
- מניחים את המכסה על הצלחת דגירה לפי צעד 1.1.4.
- בינוני מרעננת צלחות בתרבית רקמה multiwell
- באמצעות micropipette, להסיר חלק או את כל מדיום תרבות תאי הבארות המכילות סוג התא # 2. מחק את המדיום בשימוש.
- צייר נפח מתאים של תרבית תאים בינוניים טריים. הנח את הקצה על הקיר הפנימי של הבאר לאט לוותר על תרבית תאים בינונית.
- מניח את המכסה על הצלחת דגירה על פי פרוטוקולי תרבית תאים הוקמו בעבר.
- העברת מוסיף המכיל סוג תא # 1 צלחות תרבות multiwell רקמה המכילה תאים מסוג # 2.
הערה: בצע פעולה זו כאשר סוגי התאים הן הגיעו לשלב הצמיחה המתאים.- לפני ההעברה מוסיפה לתוך בארות, לבצע שינויים בינוניים צורך, כפי שתואר לעיל בצעדים 1.3) ו -1.4).
הערה: בשלב זה, חשוב לוותר הכרכים המתאימים של תקשורת בשני התאים כפי שצוין על ידי ל'הוסף של היצרן. - בעזרת פינצטה, אחיזה בקצה העליון של אינסרט המכיל תאי Type # 1 ובעדינות למקם אותו # סוג התא המתאים היטב המכיל 2.
- לאחר העביר כל המוסיף, לבדוק את קיומו של בועות אוויר מתחת הקרום של מוסיף.
הערה: בועות אוויר למנוע כל חילופי דרך הממברנה של הכנס ויכולות לסכן את הניסוי כולו. - אם בועות אוויר נוכחים, מאוד בעדינות להרים את הכנס מהמלקחיים באמצעות היטב לצלול בחזרה לתוך המדיום תרבית תאים. הבועות תיעלמנה. אם הם עדיין יהיו קיימים, כדאי לטבול בעדינות מוסיף בחזרה לתוך המדיום תרבית תאים בזווית.
הערה: אין לדבר סר או לעורר מוסיפים להימנע מתנערים תאים חסידים. - לאחר הסרת כל בועות האוויר והבדיקה כי הכרכים של תקשורת בתאי שניהם, לשים את המכסה על הצלחת דגירה.
- לפני ההעברה מוסיפה לתוך בארות, לבצע שינויים בינוניים צורך, כפי שתואר לעיל בצעדים 1.3) ו -1.4).
- תקשורת מרעננת מערכת שיתוף התרבות
הערה: למרות הממברנה בקלות מאפשר חילופי תקשורת בין הכנס היטב, מרענן המדיום נעשההן תאים מאז הזמן הנדרש כדי להגיע לשיווי משקל במדורים העליונים והתחתונים ידי דיפוזיה לבד יכול להיות ארוך למדי.- בינוני מרענן הוסיף המכיל סוג תא # 1 נעשה באותה הדרך כמו בשלב 1.3).
- כדי לרענן בינוני בבארות התא המכיל סוג # 2, החלק בעדינות את הכנס לצד ליצור מרחב רחב מספיק כדי להכיל קצה פיפטה. רענן המדיום כמו בשלב 1.4).
- לבדוק את קיומו של בועות אוויר ולאמת הכרכים לפי 1.5.3 צעדים) דרך 1.5.5).
דוגמה 2: מדידת ההשפעות של ציטוקינים המופרשים על ידי microglia N9 המופעל LPS בתאי PC12 העצבית
הערה: השלבים הבאים יועד בקבוק ספציפי, גם וגדל צלחת. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות מותאם אישית עבור כל ממד plasticware. לגבי המדיה רכב ראה טבלת חומרים.
- זריעה ומבדל תאי PC12 ב רבגם צלחות בתרבית רקמה
- בינוני PC12 תרבית תאים שגרה חם, בינוני בידול PC12 טריפסין-EDTA באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- השתמש בתאי PC12 בנקודת מפגש 60-80% מבקבוקון 2 75 סנטימטר.
- עם טפטף 15 מ"מ פסטר, לבצע שאיפת ואקום של מדיום תרבית תאים כולו בבקבוק.
- לשטוף בעדינות את monolayer תא עם 5 מ"ל של בופר פוספט סטרילי ולהסיר את הנוזל עם פיפטה פסטר. היזהר שלא לנתק תאים בשלב זה.
- מכסים את monolayer תא עם 3 מ"ל של טריפסין-EDTA דגירה במשך 2-3 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- ודא כי כל התאים מנותקים תחת מיקרוסקופ. אם תאי מעטים הם צפים, דגירה לתקופה ארוכה לתקופה מקסימלית של 5 דקות.
- הוסף 10 מ"ל של מדיום תרבית תאים שגרת PC12 כדי לנטרל את טריפסין-EDTA.
- עם פיפטה 10 מ"ל, בעדינות triturate תוך שהוא מוודא כי רוב התאים הם ניתק מלמטה of הבקבוק. הימנע מיצירת בועות אוויר השעית התא.
- עם אותה פיפטה 10 מ"ל, ולהעביר את ההשעיה תא צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
- צנטריפוגה 1 דקות ב 3,200 XG
- בטל supernatant עם פיפטה פסטר תוך הקפדה שלא להפריע גלולה.
- הוסף 10 מ"ל של מדיום תרבית תאים שגרת PC12 עם טפטפת 10 מ"ל.
הערה: נפח זה יכול להיות מותאם אם הגלולה היא יוצאת דופן קטנה או גדולה. - Triturate עם פיפטה 10 מ"ל אותו כדי homogenize גלולה. PC12 תאים לעתים קרובות גוש ביחד כך לפחות 20 pipetting למעלה downare הצורך.
הערה: בעוד triturating הנמרץ הוא הכרחי, למנוע יצירת בועות אוויר השעית התא. - בתוך צינור 1.5 מיליליטר, להכין דילול מתאים השעית תא trypan הכחולה. ספירת התאים באמצעות hemocytometer על פי פרוטוקולים הוקמו בעבר 74.
- בתוך צינור 50 מ"ל נפרד, לפצל את ההשעיה תאעם בינוני בידול PC12 להשיג מתאים השעית תא בדילול זריעת בארות מתוך צלחת 24 גם (30,000 ¢ / 2 סנטימטר, 0.6 מיליליטר לכל טוב פי הפרוטוקול של היצרן).
הערה: צלחת 24 גם חייב להיות מצופה בעבר עם קולגן כפי שצוין על ידי פרוטוקולים הוקמה בעבר 75. - הפץ 0.6 מ"ל של ההשעיה תא לכל טוב באמצעות micropipette.
- כאשר כל הבארות הם זורעים, לטלטל את הצלחת כמו בשלב 1.1.7).
- כדי לאפשר הבידול התקין של תאי PC12, דגירת 24 גם הצלחות עבור 7-9 ימים ב 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה 5% CO 2 במדיום בידול PC12 15,16 לפני ביצוע ניסויי תרבות המשותפת.
- בצע שינויים בינוניים כל כמה ימים על ידי הסרת מחצית הנוזל והחלפתו נפח שווה של בינוני בידול PC12 טרי.
- זריעת microglia N9 ב מחדיר וטיפול עם LPS
- יום אחד לפני ביצוע ניסויי התרבות-שיתוף, טרום לטפל PTFE 0.4 מוסיף מיקרומטר נקבובי עם תרבית תאים בינוני שגרת N9 לייעל דבקות תא, ביצוע שלבי 1.1.1) דרך 1.1.4)
- בינוני N9 תרבית תאים שגרה חם טריפסין-EDTA באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- בינתיים, שוקל כ 10 מ"ג של LPS צינור 1.5 מיליליטר לשימוש מאוחר יותר.
הערה: מאז LPS הוא רעלן פנימי הפר דלקתי חזק דורש אמצעי זהירות מסוימת, משקפים, כפפות, ומכשיר נשמת חלקיקים מומלץ בחום. - השתמש בתאים N9 בנקודת המפגש 80-90% מבקבוקון 2 75 ס"מ.
- בצע את השלבים 2.1.3) כדי 2.1.14). השתמש תמיד בינוני N9 תרבית תאים שגרתית במקום בינוני תרבות PC12 תא שגרתית. כמו כן שים לב microglia N9 לא להתגודד יחדיו ככל תאי PC12 לעשות, כך פחות pipetting למעלה ולמטה עשוי להיות נחוץ בשלב 2.1.13).
- בתוך צינור 50 מ"ל נפרד, לפצל את ההשעיה תא עם תרבית תאים בינוניים N9 כדי obtain השעית תא בדילול מתאימה זריעה מוסיפה נועד להחזיק ב 24 גם צלחות (60,000 ¢ / 2 סנטימטר, 0.05 מיליליטר לכל כנס פי הפרוטוקול של היצרן, עבור שטח פן קרום לראות מידע יצרן).
הערה: מוסיף אלה כבר מצופה קולגן על ידי היצרן והם אופטימיזציה עבור הידבקות התא. - פזר 0.05 מ"ל של ההשעיה תא לכל הכנס באמצעות micropipette.
- כשכל מוסיף הם זורעים, לטלטל את הצלחת כמו בשלב 1.1.7).
- בצע דילולים סדרתי של LPS באמצעות מדיום טיפול N9 להשיג 4 מיקרוגרם / מ"ל, 2 מיקרוגרם / מ"ל ו 1 מיקרוגרם / מ"ל פתרונות עובד.
- פיפטה 0.05 מ"ל של הפתרון עובד 4 מיקרוגרם / מ"ל באחד הסט של מוסיף על מנת להניב דילול הסופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל.
- חזור על שלב 2.2.10) עבור פתרונות עובד בשתי אחרים מוסיף קבוצות שונות, מניב דילולים סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל ו 0.5 מיקרוגרם / מ"ל בהתאמה.
- בcubate צלחות המכילות מחדיר למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה 5% CO 2 כדי לאפשר הפעלת microglia N9 עם LPS לפני ביצוע ניסויי התרבות המשותפת.
- Co-טיפוח PC12 תאים עצביים עם microglia N9
- בשעה 7-9 ימים של הבחנה PC12 תאים, להפעיל את microglia N9 לאחר 24 שעות של דגירה עם LPS ידי בינוני טיפול N9 חם ובינוניים טיפול PC12 באמבט המים 37 מעלות צלזיוס.
- בצע שינוי בינוני הכולל microglia N9 כמו בשלב 1.3), החלפת בינוני משומשים כולה ב -0.1 מ"ל של מדיום טיפול N9. האם זה עבור כל insert.This יש צורך להסיר את כל עקבות של LPS, עוזב microglia N9 מופעל רק מוסיף.
- בצע שינוי בינוני הכולל תאי PC12 עצביים כמו בשלב 1.4). מעבירים את מוסיף לתוך 24 גם הצלחות כמו בשלב 1.5) .Incubate N9-PC12 שיתוף תרבויות למשך 24 שעות או 48 שעות ב 37 ° C באווירה לח 5% CO 2.
- אחרי 24hr או 48 שעות, לקצור את supernatant ו / או תאים עבור cytotoxicity, assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA), כתם המערבי, או מבחני אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השימוש במערכות שיתוף תרבות כנס רלוונטי במיוחד בחקר של תהליכי neuroinflammatory שופכי אור יחסי paracrine בין שחקנים סלולריים השונים של מערכת העצבים המרכזית. חסינות של מערכת העצבים המרכזי מושגת בעיקר על ידי תאי תושב קרואי מיקרוגליאה מנטר סביבתם במצב מסועף הנח שלהם (איור 2 א) ומסוגלים הפרעות חישה שיכול להטריד את הומאוסטזיס יקרה מאוד הכרחית לתפקוד עצבי ראוי 76-78. הפעלת microglial, המאופיינת אימוץ צורה אמבואידית (תרשים 2B) ואת הכפל של אוכלוסיית תא כינת microgliosis (איור 3), ואחריו השחרור מתווך פרו-דלקתי, כגון ציטוקינים, מהווה את ההיבט הראשי של neuroinflammation 79 . שחרור ציטוקינים משרת את המטרה האצילית של הגנה נוירונים נגד תקיפות מזיקות הוא קלהאיליי פיקוח. עם זאת, כאשר neuroinflammation בורח פיקוח הדוק זה, היא המאמצת בעל אופי הרסני ועלולה לפגוע קשות במערכת העצבים המרכזית. הואיל ברקמות עצביות יש פוטנציאל התחדשות מוגבל מאוד, מערכת העצבים המרכזית היא כל רגיש יותר תגובות דלקתיות אוטומטיות הרסנית כאלה. לימוד crosstalk, שקיים בין נוירונים microglia הכרחי הבהרת המנגנונים של neuroinflammation. בניגוד תרבויות מעורבות, מערכות שיתוף תרבות להכניס לאפשר לחוקר לזהות אילו אוכלוסיית תא מייצר את ההשפעות הרעילות ואיזה מהם הוא להיות מושפעת.
הנה, תאים PC12 הבדיל עבור 7-9 ימים עם גורם הגדילה העצבי היו שיתוף תרבותי עם LPS המופעל microglia N9 במטרה אפקטים רעילים quantifyingthe גורמים מסיסים הנגזרות דלקת על נוירונים. לשם כך, תאי PC12 עצביים עובדו 24 גם צלחות תוך microglia N9 היה זורע ב מוסיף. N9 microgliטופלו במשך 24 שעות עם LPS, רעלן פנימי חזק מאוד פרו-דלקתיים מורכבת של ממברנות החיצונית של חיידקים גראם שליליים. LPS ידוע להפעיל קולטן לחיוג כמו 4 ובכך לעורר תגובה דלקתית חזקה במגוון רחב של תאי מפעיל חיסוניים, כוללים שורת התאים בעכברים הנציח microglia N9 80,81. תוצאות נציג הבאים מראים כי microglia N9 מופעל עם LPS יש נטייה להגדיל את אוכלוסייתם (איור 3) ו להפריש ציטוקינים מסיסים פרו-דלקתיים, כגון interleukin-6 (IL-6), גמא אינטרפרון (IFN-γ) ו נמק הגידול אלפא גורם (TNF-α), כי בקלות לחצות את הממברנה של מוסיף שיתוף התרבות ולגרום נזק ציטוטוקסי לתאים PC12 העצבית גדל בתא התחתון.
החשש ובראשונה לפני העברת microglia N9 המופעל LPS אל הבארות המכילות תאי PC12 עצביים מורכב המאשר thaך * PC12 הם מובחנים כמו שצריך. שבעת ימי בדיל PC12 תאים צריכים להפגין פנוטיפים עצבי ברור כמו גוף תא להחמיא, אשר מספר פרויקטי neurites הארוך לפעמים עצמם מוצגים ורידים (איור 4). לאחר המחסום הזה מתבצע, N9 מוסיף microglia המכילים בינוני טרי נטול LPS ניתן להעביר לתוך הבארות המכילות PC12 בדיל. לאחר תקופת דגירה של 24 שעות או 48 שעות, supernatant בתא התחתון שנקטף וכן assay cytotoxicity, המבוססים על שחרור לקטט דהידרוגנאז 15,16, וכן ELISA 15, למדוד ציטוקינים מבוצעים. חשוב לקצור את supernatant בתא התחתון על מנת למדוד את ציטוקינים כי אכן חצו את קרום חדיר שעשויים להפעלת הקולטנים על פני השטח של תאי PC12. תוצאות מראות כי LPS המופעל microglia N9 מהתא העליון ליצור CYT dose- והזמן תלויאפקט otoxic על תאי PC12 עצביים הבדיל להגדיר בתא התחתון (איור 5). התנאי 0.5 מיקרוגרם / מ"ל LPS הוא אולם לא ציטוטוקסיות משמעותית ב 24 שעות או 48 שעות. רמות רעילות נמצאו להגיע כמעט 100% במצב hr 2 מיקרוגרם / מ"ל LPS 48. יתר על כן, התוצאות מראות כי ריכוז של הפרו דלקתי ציטוקינים IL-6, IFN-γ ו- TNF-α ב העליות supernatant במקביל cytotoxicity נצפים. באופן ספציפי, IL-6 ריכוזים עולים במידה ניכרת לאחר 24 שעות בלבד עבור תנאי 2 מיקרוגרם / מיליליטר, ואילו 1 מיקרוגרם / מיליליטר של LPS גם תשואות מעלים באופן משמעותי רמות של ציטוקינים לאחר 48 שעות (איור 6). Microglia להפריש IFN-γ המגיעה בתא התחתון באופן גדל באופן משמעותי כאשר הם מטופלים עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ו -2 מיקרוגרם / מ"ל, ו מודגרת עם תאי PC12 עצביים הבדיל לאף 24 שעות או 48 שעות (איור 7). 0.5 מיקרוגרם / מ"למצב LPS שוב אינו מעלה רמות IFN-γ באופן משמעותי. לבסוף, ריכוזיים-α TNF בתא התחתון היו לכמת ידי ELISA ונמצאו להיות augmented ביותר על ידי LPS לפעולתה של המיקרוגליה, רמות לכת כמעט פי שבעה יותר חשוב מאשר המצב המלא (איור 8). בפרט, הן דגירת 24 שעות ו -48 שעות תקופות שנגרמו עליות חשובות ברמות-α TNF ב supernatant. עם זאת, תנאי LPS 1 מיקרוגרם / מיליליטר ניב עלייה משמעותית של רמות-α TNF רק לאחר 48 שעות. ככלל, תוצאות אלו מראות כי ציטוקינים פרו-דלקתיים המופרשים לפחות אחראים במידה מסוימת השפעות ציטוטוקסיות שנצפו PC12 תאים עצביים בדיל לאחר תקופת דגירה 24 שעות או 48 שעות עם microglia מופעל על ידי ריכוזים שונים של LPS.
הכנס מערכות שיתוף התרבות של תאים המיקרוגליה PC12 LPS המופעל N9 הוכחולהיות שימושי במיוחד בחקר neuroinflammation והן לפרט אסטרטגיות כדי לנטרל אותו. הקבוצה שלנו הראו לאחרונה כי microglia N9 המופעל LPS הגדלים בתרבית תאים מוסיף שעתוק מוגבר התערוכה של ציטוקינים פרו-דלקתיים, אשר בתורו לגרום אפופטוזיס של תאי PC12 גורם הבדיל גדילה עצבי על ידי חציית micropores של הכנס 15, 16. באותה פרדיגמה, טרום טיפול באוכלוסיית microglial עם רזברטרול מתחם polyphenolic (0.1 מיקרומטר, 3 שעות) מונע שעתוק של ציטוקינים פרו-דלקתיים ובכך אפופטוזיס הקשתה של תאי PC12 עצביים הבדילו על ידי חסימת הפעלת caspase-3 ו, לאחר מכן , מחשוף DNA. קבוצה נוספת גם הוכיחה את ההשפעות נוירו של ויטמין E בתוך N9-PC12 שיתוף תרבות 26. בנוסף תרבויות-שיתוף N9-PC12, שורות תאים הנציחו שונות או תרבויות עיקריות גם להיות מועסקות בהקשר של neuroinflammation. לדוגמה,שורת תאים microglia BV2 murine היה שיתוף תרבותי עם תאים SH-SY5Y נוירובלסטומה אדם להראות את אפקט אנטי אפופטוטיים של לוטאולין polyphenolic בתיווך ככל הנראה על ידי 17 פוטנציאל אנטי דלקתיות שלה. כמו כן, microglia BV2 מופעל על ידי תאי PC12 פצועים הוצג להשפעות אנטי אפופטוטיים בתאי גזע mesenchymal 18. איתות גומלין הודגמה להיות חשובים המנגנונים אנטי אפופטוטיים neuroprotection microglia העיקרי הבסיסי מוקנה נוירונים גרגיר cerebellar עיקריים 19. יתר על כן, נוירונים בהיפוקמפוס עיקריים היו שיתוף טפח עם microglia העיקרי מופעל על ידי חלבון מקדים עמילואיד מופרש על מנת להעריך את שחרורו של גלוטמט על ידי חילופי ציסטאין וההיחלשות הבאה של פונקציה הסינפטי 20. לבסוף, קבוצה אחת גם הראתה את crosstalk שקיים בין נוירונים בהיפוקמפוס הראשוניים microglia העיקרי הנוגע fractalkine איתות, כמוקין הבעת constitutivelysed על ידי נוירונים במערכת העצבים המרכזית קולטן אשר נמצא על פני השטח של microglia 21.
באיור 1. ייצוג סכמטי של מערכת שיתוף תרבות כנס. התא העליון מורכב של הכנס המחזיקה סוג תא אחד וסביבת לחות הפסגה שלה. המגירה התחתונה מורכבת באר או מאכל המכיל את סוג התא השני. את הכנס מוטלת בשולי הצלחת בתרבית רקמה multiwell או צלחת. את הכנס נועד לשקר ממש מעל לתחתית הבאר כדי לא לגעת אוכלוסיית התאים הגדלים להלן. המדיום בתא התחתון נמצא בקשר עם הן את משטח הבסיס של סוג בתא הראשון למשטח הפסגה של סוג התא השני. אנא לחץ כאן כדי להציג vers גדוליון של נתון זה.
איור 2. Microphotographs של microglia N9. (א) microglia N9 נח מטופל ב מוסיף להפגין מורפולוגיה הסלולר מסועפת, המאפשרים מעקב אחר סביבתם באופן פעיל. (ב) microglia N9 ב מוסיף שטופל lipopolysaccharide (LPS) עבור 24 תצוגת hr צורה אמבואידית טיפוסית של פנוטיפ מופעל. Microphotograph זו צולמה רק לפני ההעברה להכניס המכיל microglia N9 מופעל אלה על הבארות המכילות תאי PC12 בדיל כפי שמודגם באיור 4. בר סולם = 25 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. Microphotographs של תאי PC12 עצביים בדיל. גדילה עצבית שבעה ימים גורם בדיל PC12 תאים העצביים להראות פנוטיפים עצבי ברור כגון neurites ו ורידים ארוכים. Microphotograph זו צולמה רק לפני העברת מוסיף המכיל microglia N9 מופעל כמו בתמונה באיור 2. בר סולם = 25 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אפקט ציטוטוקסיות איור 5. של lipopolysaccharide (LPS) -activated microglia על תאי PC12 עצביים מובחנים. microglia N9 הופעל עם ריכוזים שונים של LPS עבור 24 שעות, ולאחר מכן הועבר בארות המכילות תאי PC12 עצביים בדיל למשך 24 שעות או 48 שעות. Cytotoxicity הוערכה באמצעות assay לשחרור לקטט דהידרוגנאז שבוצע על supernatant של המגירה התחתונה. הבדלים משמעותיים בין הקבוצות היו הוברר על ידי ניתוח חד סטרי השונות, ואחריו ניתוח פוסט-הוק של Tukey עם התוכנית Instat GraphPad, גרסה 3.06 עבור Windows (סן דייגו, קליפורניה; www.graphpad.com). כל הנתונים, ניתח בבית מרווח ביטחון של 95%, באים לידי ביטוי כאמצעי ± שגיאת התקן של הממוצע מתחילת 3 ניסויים בלתי תלויים בהם 6 בארות נחשבו. כוכביות מצביעות על הבדלים סטטיסטיים בין מצב הטיפול וביקורת (*** p <0.001). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ther.within-page = "1"> 
ריכוז איור 6. אני nterleukin-6 (IL-6) ב supernatant לאחר הפעלת N9 ידי lipopolysaccharide (LPS). Microglia N9 הופעל עם ריכוזים שונים של LPS עבור 24 שעות, ולאחר מכן הועבר בארות המכילות תאי PC12 עצביים בדיל עבור 24 שעות או 48 שעות. ריכוזי IL-6 ב supernatant המגירה התחתונה הוערכו באמצעות ELISA. הבדלים משמעותיים בין הקבוצות היו הוברר על ידי ניתוח חד סטרי השונות, ואחריו ניתוח פוסט-הוק של Tukey עם התוכנית Instat GraphPad, גרסה 3.06 עבור Windows (סן דייגו, קליפורניה; www.graphpad.com). כל הנתונים, ניתח בבית מרווח ביטחון של 95%, באים לידי ביטוי כאמצעי ± שגיאת התקן של הממוצע מתחילת 3 ניסויים בלתי תלויים בהם 6 בארות נחשבו. כוכביות מצביעות על הבדלים סטטיסטיים בין הטיפול ונגדמצב trol (*** p <0.001, ** p <0.01 ו * p <0.05). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. ריכוז של גמא אינטרפרון (IFN-γ) ב supernatant לאחר הפעלת N9 ידי lipopolysaccharide (LPS). Microglia N9 הופעל עם ריכוזים שונים של LPS עבור 24 שעות, ולאחר מכן הועבר בארות המכילות תאי PC12 עצביים בדיל למשך 24 שעות או 48 שעות. ריכוזי IFN-γ ב supernatant המגירה התחתונה הוערכו באמצעות ELISA. הבדלים משמעותיים בין הקבוצות היו הוברר על ידי ניתוח חד סטרי השונות, ואחריו ניתוח פוסט-הוק של Tukey עם התוכנית Instat GraphPad, גרסה 3.06עבור Windows (סן דייגו, קליפורניה; www.graphpad.com). כל הנתונים, ניתח בבית מרווח ביטחון של 95%, באים לידי ביטוי כאמצעי ± שגיאת התקן של הממוצע מתחילת 3 ניסויים בלתי תלויים בהם 6 בארות נחשבו. כוכביות מצביעות על הבדלים סטטיסטיים בין מצב הטיפול וביקורת (** p <0.01 ו * p <0.05). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8. ריכוז של אלפא tumor necrosis factor (TNF-α) ב supernatant לאחר הפעלת N9 ידי lipopolysaccharide (LPS). Microglia N9 הופעל עם ריכוזים שונים של LPS עבור 24 שעות, ולאחר מכן הועבר בארות המכילות תאי PC12 עצביים בדיל עבור 24 שעות או 48 שעות. TNF-αריכוזים ב supernatant המגירה התחתונה הוערכו באמצעות ELISA. הבדלים משמעותיים בין הקבוצות היו הוברר על ידי ניתוח חד סטרי השונות, ואחריו ניתוח פוסט-הוק של Tukey עם התוכנית Instat GraphPad, גרסה 3.06 עבור Windows (סן דייגו, קליפורניה; www.graphpad.com). כל הנתונים, ניתח בבית מרווח ביטחון של 95%, באים לידי ביטוי כאמצעי ± שגיאת התקן של הממוצע מתחילת 3 ניסויים בלתי תלויים בהם 6 בארות נחשבו. כוכביות מצביעות על הבדלים סטטיסטיים בין מצב הטיפול וביקורת (*** p <0.001). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלב הקריטי ביותר של כל ניסוי מערכת שיתוף תרבות כנס למעשה שוכן בבחירת הכנס הראוי לשימוש. גודל נקבובי וחומר קרום חייבים להילקח בחשבון יסודי, מבלי לשכוח לקחת בחשבון את הסוג של תא יהיה זורע ואת מטרת הניסוי. לדוגמה, מבחני chemotaxic עשויים להשתמש באותו סוג של קרום מ שיתוף תרבויות התא לנתח מודולציות התנהגות התא הנגרמת על ידי גורמים מסיסים מופרש בהעדר מגע תאים תאים. עם זאת, שני סוגי ניסויים דורשים גדלים נקבוביים שונים: בגדולים עבור לשעבר, כדי לאפשר נדידת תאים, ואת קטנים באפשרות השנייה, כדי למנוע נדידת תאים ומגע תאי תאים. להערכת שינויים הסלולר בתיווך גורמים מסיסים מופרשים בהעדר מגע תאי תאים, נקבובי בגדלים של 0.4 מיקרומטר או 3 מיקרומטר הם בדרך כלל מתאימים, מאחר שהם מאפשרים למולקולות גדולות, כגון חלבונים, לחצות אבל למנוע את רוב התאים מלעשות כך. קְרוּםחומר תלוי בעיקר בסוג התא ואת הטכניקות לשמש בסוף פרוטוקול תרבית תאים. בקצרה, ממברנות PET תצענה חשיפת תא טובה כפי שהם ברורים אך אינם מצופים קולגן, אשר יכולים להוות בעיה עבור תאים חסידים הנדרשים כיום להקמתן שתתייחס התמיכה. יש להם גם את העמידות הכימית הטובה ביותר fixatives כי, לצד התכונות האופטיות הטובות שלהם, שהופכת אותם אידיאליים עבור מחקרים היסטולוגית. מצד השני, ממברנות PC תצענה חשיפת תא עניה כפי שהם שקופים ואינם מצופים קולגן. עם זאת, יש להם הצפיפות הגבוהה של נקבוביים ואת הזמינות המגוונת ביותר של גודל נקבובי. לבסוף, ממברנות PTFE ברורות כאשר רטוב אבל רק לאפשר ויזואליזציה של תא מתארת במיקרוסקופ. כתוצאת יתרון עיקרי, הם קולגן מצופים, אשר גם עושה אותם קצת עבה. חשוב לציין כי ציפוי או PET מוסיף PC הממברנה עם קולגן עלול להסתיר את הנקבוביות ומסכלים חלוף מסיסים פקטוRS. בכל מקרה, היצרנים התותבים ביותר מציעים מדריכים מקיפים לסיוע חוקר בבחירת הכנס הנכון. בפרדיגמה הספציפי שלנו, הבחירות של צפיפות ציפוי, תקשורת, ריכוז בסרום, ימים של בידול, ימי הפעלת LPS, ריכוזים של LPS, וציפוי של צלוחיות עבור תאי PC12 מוטבו על שנים של עבודה עם מערכות שיתוף התרבות אלה 15 , 16. ראוי לציון, צפיפות הציפוי של microglia N9 ב המחדיר נבחרה ב 60,000 ¢ / 2 סנטימטר על מנת לקבל מפגש 40-50% ברגע תחילת שיתוף התרבות, ולכן, כדי לתת להם מרחב להתרבות על הפעלת על ידי LPS. מצבים אחרים כאשר עלול מותאם גם להניב תוצאות משביעות רצון, כגון החלפת קולגן על ידי L ליזין ב צלוחיות מיועד תחזוקה PC12 הילידים.
על מנת להגדיל את הקיימות של התוצאות, מספר פקדים שונים יכולים להתבצע. כאשר מנסה להוכיח כי גורמים מסיסיםאחראי ההשפעות שנצפו, תרבויות מעורבות מפגין מגע תאי תאים ישיר וניסויים בינוניים מותנים צריכות להתנהל במקביל. יתר על כן, תוך כדי ניצול של נוגדנים מנטרלים גורם מופרש מבוקש יסייע בזיהוי המולקולה האחראית אפקט paracrine כי נתפס. במידת האפשר, לחסום קולטן או חלק של מסלול איתות שלה כדי לאתר את זהות המדויק של הקולטן להיות מופעל. אם מולקולה המשמשת להפעלת אוכלוסיית תא אחד לפני ניסוי שיתוף התרבות עם סוג תא שני, כגון בדוגמא שתוארה לעיל, חשוב לקחת בחשבון את נוכחותו של המולקולה במערכת. כאפשרות ראשונה, המדיום צריך להיות שונה לחלוטין לפני ניסוי שיתוף התרבות על מנת להבטיח כי המולקולה נעדרת מהמערכת לגמרי. כאופציה שניה, מצב יש להוסיף שם המולקולה לבד הוא מודגרות עם סוג התא השני כדילאמוד את השלכותיה בהעדר בסוג התא הראשון. אם אין השפעה של המולקולה בסוג התא השני, לא יהיה צורך לשנות את המדיום לפני ניסוי שיתוף התרבות. כמו כן, אם סוגי התאים הן לא צומחים במדיום התרבות באותו תא, אמצעי זהירות דומה יש לנקוט כדי לוודא כי ההבדלים בהרכב בינוני אינם משפיעים אחד או אוכלוסיית התאים האחרת. למרות שגם התקשורת תופרד באמצעות הממברנה להכניס בהתחלה, דיפוזיה הוא כבול על מנת להבטיח כי הם יוכלו לערבב לאורך תקופות דגירה כבר. יתר על כן, מספר בעיות יכולות לנבוע הפרעה סוטה של יחסים גורמים קולטן מסיסים. בין מספר גורמי שגיאה, השימוש המופרז של דיסוציאציה האנזימטית בנוכחות ריכוזים החשובים של בסרום יכולים להפריע קולטנים בתא שטח. סיבות נוספות של שגיאה במערכות שיתוף תרבות הכנס כוללים, אך אינם מוגבלים ל -1) טכניקות תרבית תאים פסולים, כגון הסרת מכלול של התאמדיום תרבות בארות רבות מדי בעת ובעונה אחת גורם תאים להתייבש, 2) בשכבה כי הוא ומחובר מדי להוסיף, אחראי אטימת קרום הכנס ומניעת מולקולות מופרשות apically כדי להגיע לתא התחתון, ו -3) misadjusted מפגש תא, אשר גורם יתר או תת-ביטוי של מסיס גורמים המובילים תוצאות לא רלוונטיות פיסיולוגי או עדר כל השפעה.
בעוד רק תרחיש אחד של תרבות משותפת הכנס הוצג כאן, יש דרכים רבות לעשות שימוש בטכניקה מאוד תכליתי זה. הנה, סוג תא אחד היה טרום שטופל מולקולת משרי הפרשת גורם מסיס, עם העביר את הכנס אל הבאר, משפיע על ההתנהגות של סוג התא השני. אפשר גם כדי לדגור שני סוגי התאים יחד במערכת תרבות שיתוף לפני הפרידה להם לזהות את הפגיעות או התנגדות המוגברות של אחד או שתי אוכלוסיות תאים כדי טיפול נסתר. הוwever, כאשר בוחנים בצורה גולמית ביותר שלה, טכניקה זו יכולה לעשות שימוש שתי אוכלוסיות של תאים מודגרות יחד ללא כל טיפול, כאשר המטרה היא להעריך איתות גומלין paracrine הבזליים.
המגבלה החשובה ביותר של שיטה זו היא כי מאוד קצרות מועד ישויות מולקולריות כגון מיני חמצן תגובתי אינן שורדות את המרחק שמפריד אוכלוסיית התא גדלה בתא העליון ואת האחד בתא התחתון 82. ההתפתחות האחרונה טכניקות שיתוף התרבות ניסתה לענות בעיה זו באמצעות מצע תרבות microfabricated מסוגל לקיים שתי אוכלוסיות תאים בסמיכות microscale 83. בנוסף נושא את כל היתרונות של מערכות שיתוף תרבות כנס, כגון זיהוי אוכלוסייה הספציפית של שינויים ואיתות דו-כיוונית, מסך microfabricated זה הודגם גם כדי לאפשר זיהוי של אינטראקציות קצר טווח שלא היו לפני דetectable בשל הריקבון של גורמים מסיסים למרחקים. פלטפורמת תרבית תאים זהו החידוש האחרון בתא שיתוף התרבות ומבטיחה לסייע לפענח מנגנוני איתות בין תאים שהיו התעלמו לפני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8755 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma | D6421 | Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine |
| Horse serum | ATCC | 30-2040 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | MultiCell | 80350 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland | Sigma | N0513 | Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | Toxic |
| Cell culture inserts for use with 24-well plates | BD Falcon | 353095 | 0.4 μm pores |
| 24-well plates | TrueLine | TR5002 | Coat with collagen before use |
| Routine PC12 cell culture medium | Routine N9 cell culture medium | ||
| - 85% RPMI medium | - 90% DMEM-F12 medium | ||
| - 10% heat-inactivated horse serum | - 10% heat-inactivated horse serum | ||
| - 5% heat-inactivated fetal bovine serum | |||
| PC12 differentiation medium | N9 treatment medium | ||
| - 99% RPMI medium | - 99% DMEM-F12 medium | ||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | ||
| - 50 ng/mL nerve growth factor | |||
| PC12 treatment medium | |||
| - 99% RPMI medium | |||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum |
References
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Hoffman, R. A. Intraepithelial lymphocytes coinduce nitric oxide synthase in intestinalepithelial cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278 (6), G886-G894 (2000).
- Zhang, W. C., et al. Regulatory T cells protect fine particulate matter-induced inflammatory responses in human umbilical vein endothelial cells. Mediators Inflamm. 2014, 869148 (2014).
- Vasileiadou, K., et al. alpha1-Acid glycoprotein production in rat dorsal air pouch in response to inflammatory stimuli, dexamethasone and honey bee venom. Exp. Mol. Pathol. 89 (1), 63-71 (2010).
- Talayev, V. Y., et al. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T cell stimulating ability of dendritics cells in vitro. Clin. Exp. Immunol. 162 (1), 91-99 (2010).
- Elishmereni, M., et al. Physical interactions between mast cells and eosinophils: a novel mechanism enhancing eosinophil survival in vitro. Allergy. 66 (3), 376-385 (2011).
- Ishihara, Y., et al. Regulation of immunoglobulin G2 production by prostaglandin E(2) and platelet-activating factor. Infect. Immun. 68 (3), 1563-1568 (2000).
- Kranzer, K., Bauer, M., Lipford, G. B., Heeg, K., Wagner, H., Lang, R. CpG-oligodeoxynucleotides enhance T-cell receptor-triggered interferon- gamma production and up-regulation of CD69 via induction of antigen- presenting cell-derived interferon type I and interleukin-12. Immunology. 99 (2), 170-178 (2000).
- Vendetti, S., Chai, J. G., Dyson, J., Simpson, E., Lombardi, G., Lechler, R. Anergic T cells inhibit the antigen-presenting function of dendritic cells. J. Immunol. 165 (3), 1175-1181 (2000).
- Haller, D., Bode, C., Hammes, W. P., Pfeifer, A. M., Schiffrin, E. J., Blum, S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Dono, M., et al. In vitro stimulation of human tonsillar subepithelial B cells: requirement for interaction with activated T cells. Eur. J. Immunol. 31 (3), 752-756 (2001).
- Yu, Y., et al. Enhancement of human cord blood CD34+ cell-derived NK cell cytotoxicity by dendritic cells. J. Immunol. 166 (3), 1590-1600 (2001).
- Watanabe, T., Tokuyama, S., Yasuda, M., Sasaki, T., Yamamoto, T. Changes of tissue factor-dependent coagulant activity mediated by adhesion between polymorphonuclear leukocytes and endothelial cells. Jpn J. Pharmacol. 86 (4), 399-404 (2001).
- Krampera, M., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 101 (9), 3722-3729 (2003).
- Bournival, J., Plouffe, M., Renaud, J., Provencher, C., Martinoli, M. G. Quercetin and sesamin protect dopaminergic cells from MPP+-induced neuroinflammation in a microglial (N9)-neuronal (PC12) coculture system. Oxid. Med. Cell. Longev. 2012, 921941 (2012).
- Bureau, G., Longpré, F., Martinoli, M. G. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, reduce apoptotic neuronal cell death induced by neuroinflammation. J. Neurosci. Res. 86 (2), 403-410 (2008).
- Zhu, L., Bi, W., Lu, D., Zhang, C., Shu, X., Lu, D. Luteolin inhibits SH-SY5Y cell apoptosis through suppression of the nuclear transcription factor-κB, mitogen-activated protein kinase and protein kinase B pathways in lipopolysaccharide-stimulated cocultured BV2 cells. Exp. Ther. Med. 7 (5), 1065-1070 (2014).
- Luo, X., et al. BV2 enhanced the neurotrophic functions of mesenchymal stem cells after being stimulated with injured PC12. Neuroimmunomodulation. 16 (1), 28-34 (2009).
- Polazzi, E., Gianni, T., Contestabile, A. Microglial cells protect cerebellar granule neurons from apoptosis: evidence for reciprocal signaling. Glia. 36 (3), 271-280 (2001).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid precursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic function. J. Neurochem. 76 (3), 846-854 (2001).
- Zujovic, V., Taupin, V. Use of cocultured cell systems to elucidate chemokine-dependent neuronal/microglial interactions: control of microglial activation. Methods. 29 (4), 345-350 (2003).
- Iwashita, M., et al. Valsartan, independently of AT1 receptor or PPARγ, suppresses LPS-induced macrophage activation and improves insulin resistance in cocultured adipocytes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302 (3), E286-E296 (2012).
- Oliver, E., et al. Docosahexaenoic acid attenuates macrophage-induced inflammation and improves insulin sensitivity in adipocytes-specific differential effects between LC n-3 PUFA. J. Nutr. Biochem. 23 (9), 1192-1200 (2012).
- Tang, S. Y., Cheah, I. K., Wang, H., Halliwell, B. Notopterygium forbesii Boiss extract and its active constituent phenethyl ferulate attenuate pro-inflammatory responses to lipopolysaccharide in RAW 264.7 macrophages. A "protective" role for oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (8), 1473-1482 (2009).
- De Boer, A. A., Monk, J. M., Robinson, L. E. Docosahexaenoic acid decreases pro-inflammatory mediators in an in vitro murine adipocyte macrophage co-culture model. PLoS One. 9 (1), e85037 (2014).
- Li, Y., Liu, L., Barger, S. W., Mrak, R. E., Griffin, W. S. Vitamin E suppression of microglial activation is neuroprotective. J. Neurosci. Res. 66 (2), 163-170 (2001).
- Brizuela, L., et al. Osteoblast-derived sphingosine 1-phosphate to induce proliferation and confer resistance to therapeutics to bone metastasis-derived prostate cancer cells. Mol. Oncol. 8 (7), 1181-1195 (2014).
- Yuan, L., Chan, G. C., Fung, K. L., Chim, C. S. RANKL expression in myeloma cells is regulated by a network involving RANKL promoter methylation, DNMT1, microRNA and TNFα in the microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 1834-1838 (2014).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E., Jacobs, I. J., Dafou, D., Gayther, S. A. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12 (4), 317-325 (2010).
- Liu, J., et al. BCR-ABL mutants spread resistance to non-mutated cells through a paracrine mechanism. Leukemia. 22 (4), 791-799 (2008).
- Giuliani, N., et al. Proangiogenic properties of human myeloma cells: production of angiopoietin-1 and its potential relationship to myeloma-induced angiogenesis. Blood. 102 (2), 638-645 (2003).
- Gupta, D., et al. Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion: therapeutic applications. Leukemia. 15 (12), 1950-1961 (2001).
- Anderson, I. C., Mari, S. E., Broderick, R. J., Mari, B. P., Shipp, M. A. The angiogenic factor interleukin 8 is induced in non-small cell lung cancer/pulmonary fibroblast cocultures. Cancer Res. 60 (2), 269-272 (2000).
- Hoechst, B., et al. A new population of myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients induces C4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells. Gastroenterology. 135 (1), 234-243 (2008).
- Karadag, A., Oyajobi, B. O., Apperley, J. F., Russell, R. G., Croucher, P. I. Human myeloma cells promote the production of interleukin 6 by primary human osteoblasts. Br. J. Haematol. 108 (2), 383-390 (2000).
- Garrido, S. M., Appelbaum, F. R., Willman, C. L., Banker, D. E. Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug- induced apoptosis by direct contact with a human bone marrow stromal cell line (HS-5). Exp. Hematol. 29 (4), 448-457 (2001).
- Heissig, B., Pasternak, G., Horner, S., Schwerdtfeger, R., Rossol, S., Hehlmann, R. CD14+ peripheral blood mononuclear cells from chronic myeloid leukemia and normal donors are inhibitory to short- and long-term cultured colony-forming cells. Leuk. Res. 24 (3), 217-231 (2000).
- Moore, M. B., Kurago, Z. B., Fullenkamp, C. A., Lutz, C. T. Squamous cell carcinoma cells differentially stimulate NK cell effector functions: the role of IL-18. Cancer Immunol Immunother. 52 (2), 107-115 (2003).
- Giuliana, N., et al. Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor- kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes: a potential role in multiple myeloma bone disease. Blood. 100 (13), 4615-4621 (2002).
- Ye, Z., Haley, S., Gee, A. P., Henslee-Downey, P. J., Lamb, L. S. Jr In vitro interactions between gamma deltaT cells, DC, and CD4+ T cells; implications for the immunotherapy of leukemia. Cytotherapy. 4 (3), 293-304 (2002).
- Zhang, X. M., Xu, Q. Metastatic melanoma cells escape from immunosurveillance through the novel mechanism of releasing nitric oxide to induce dysfunction of immunocytes. Melanoma Res. 11 (6), 559-567 (2001).
- Zhang, M., et al. The differentiation of human adipose-derived stem cells towards a urothelium-like phenotype in vitro and the dynamic temporal changes of related cytokines by both paracrine and autocrine signal regulation. PLoS One. 9 (4), e95583 (2014).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Krassowska, A., et al. Promotion of haematopoietic activity in embryonic stem cells by the aorta-gonad-mesonephros microenvironment. Exp. Cell. Res. 312 (18), 3595-3603 (2006).
- Darcy, K. M., et al. Mammary fibroblasts stimulate growth, alveolar morphogenesis, and functional differentiation of normal rat mammary epithelial cells. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36 (9), 578-592 (2000).
- Spector, J. A. Co-culture of osteoblasts with immature dural cells causes an increased rate and degree of osteoblast differentiation. Plast. Reconstr. Surg. 109 (2), 631-642 (2002).
- Khanolkar, A., Fu, Z., Underwood, L. J., Bondurant, K. L., Rochford, R., Cannon, M. J. CD4+ T cell-induced differentiation of EBV-transformed lymphoblastoid cells is associated with diminished recognition by EBV-specific CD8+ cytotoxic T cells. J. Immunol. 170 (6), 3187-3194 (2003).
- Fritsch, C. Epimorphin expression in intestinal myofibroblasts induces epithelial morphogenesis. J. Clin. Invest. 110 (11), 1629-1641 (2002).
- Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohumra, E. Morphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain Res. 1029 (1), 114-119 (2004).
- Llado, J., Haenggeli, C., Maragakis, N., Snyder, E., Rothstein, J. Neural stem cells protect against glutamate-induced excitotoxicitiy and promote survival of injured motor neurons through the secretion of neurotrophic factors. Mol. Cell. Neurosci. 27 (3), 322-331 (2004).
- Fong, S. P., et al. Trophism of neural progenitor cells to embryonic stem cells: Neural induction and transplantation in a mouse ischemic stroke model. J. Neurosci. Res. 85 (9), 1851-1862 (2007).
- Gordon-Keylock, S. A., et al. Induction of hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells by an AGM-derived stromal cell line is not further enhanced by overexpression of HOXB4. Stem Cells. 19 (11), 1687-1698 (2010).
- Yang, T., Tsang, K. S., Poon, W. S., Ng, H. K. Neurotrophism of bone marrow stromal cells to embryonic stem cells: noncontact induction and transplantation to a mouse ischemic stroke model. Cell transplant. 18 (4), 391-404 (2009).
- Kim, J. Y., et al. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect amyloid-β42 neurotoxicity via paracrine. World J. Stem Cells. 4 (11), 110-116 (2012).
- Mauri, M., et al. Mesenchymal stem cells enhance GABAergic transmission in co-cultured hippocampal neurons. Mol. Cell Neurosci. 49 (4), 395-405 (2012).
- Ichikawa, J., et al. Increased crystal-cell interaction in vitro under co-culture of renal tubular cells and adipocytes by in vitro co-culture paracrine systems simulating metabolic syndrome. Urolithiasis. 42 (1), 17-28 (2014).
- Zuo, L., et al. A Paracrine mechanism involving renal tubular cells, adipocytes and macrophages promotes kidney stone formation in a simulated metabolic syndrome environment. J. Urol. 191 (6), 1906-1912 (2014).
- Fan, W., Zheng, J. J., McLaughlin, B. J. An in vitro model of the back of the eye for studying retinal pigment epithelial-choroidal endothelial interactions. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 38 (4), 228-234 (2002).
- Mierke, C. T., Ballmaier, M., Werner, U., Manns, M. P., Welte, K., Bischoff, S. C. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. J. Exp. Med. 192 (6), 801-811 (2000).
- Beckner, M. E., Jagannathan, S., Peterson, V. A. Extracellular angio-associated migratory cell protein plays a positive role in angiogenesis and is regulated by astrocytes in coculture. Microvasc. Res. 63 (3), 259-269 (2002).
- Damon, D. H. VSM growth is stimulated in sympathetic neuron/VSM cocultures: role of TGF-beta2 and endothelin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278 (2), H404-H411 (2000).
- Anna De Berardinis, M., Ciotti, M. T., Amadoro, G., Galli, C., Calissano, P. Transfer of the apoptotic message in sister cultures of cerebellar neurons. Neuroreport. 12 (10), 2137-2140 (2001).
- Lange-Sperandio, B., Fulda, S., Vandewalle, A., Chevalier, R. L. Macrophages induce apoptosis in proximal tubule cells. Pediatr. Nephrol. 18 (4), 335-341 (2003).
- Vjetrovic, J., Shankaranarayanan, P., Mendoza-Parra, M. A., Gronemeyer, H. Senescence-secreted factors activate Myc and sensitize pretransformed cells to TRAIL-induced apoptosis. Aging Cell. 13 (3), 487-496 (2014).
- Fujiya, A., et al. The role of S100B in the interaction between adipocytes and macrophages. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 371-379 (2014).
- Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25 (10), 2062-2068 (2005).
- Yoshida, A., Kitajiri, S., Nakagawa, T., Hashido, K., Inaoka, T., Ito, J. Adipose tissue-derived stromal cells protect hair cells from aminoglycoside. Laryngoscope. 121 (6), 1281-1286 (2011).
- May, L. A., et al. Inner ear supporting cells protect hair cells by secreting HSP70. J. Clin. Invest. 123 (8), 3577-3587 (2013).
- Jarosz, L. M., Deng, D. M., vander Mei, H. C., Crielaard, W., Krom, B. P. Streptococcus mutans competence-stimulating peptide inhibits Candida albicans hypha formation. Eukaryot Cell. 8 (11), 1658-1664 (2009).
- Dagenais, T. R., Giles, S. S., Aimanianda, V., Latgé, J. P., Hull, C. M., Keller, N. P. Aspergillus fumigatus LaeA-mediated phagocytosis is associated with a decreased hydrophobin layer. Infect. Immun. 78 (2), 823-829 (2010).
- Spiliotis, M., Lechner, S., Tappe, D., Scheller, C., Krohne, G., Brehm, K. Transient transfection of Echinococcus multilocularis primary cells and complete in vitro regeneration of metacestode vesicles. Int. J. Parasitol. 38 (8-9), 1025-1039 (2008).
- Scholzen, A., Mittag, D., Rogerson, S. J., Cooke, B. M., Plebanski, M. Plasmodium falciparum-mediated induction of human CD25Foxp3 CD4 T cells is independent of direct TCR stimulation and requires IL-2, IL-10 and TGFbeta. PLoS Pathog. 5 (8), e1000543 (2009).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Quantification of Cells in Culture. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 333-335 (2001).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 88-89 (2001).
- Kreutzberg, G. W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci. 19 (8), 312-318 (1996).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
- Qureshi, S. T., Larivière, L., Leveque, G., Clermont, S., Moore, K. J., Gros, P., Malo, D. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4 (Tlr4). J. Exp. Med. 189, 615-625 (1999).
- Sabroe, I., Jones, E. C., Usher, L. R., Whyte, M. K., Dower, S. K. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 in human peripheral blood granulocytes: a critical role for monocytes in leukocyte lipopolysaccharide responses. J. Immunol. 168, 4701-4710 (2002).
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Bio. 4 (5), 278-286 (2008).
- Spencer, K. H., Kim, M. Y., Hughes, C. C., Hui, E. E. A screen for short-range paracrine interactions. Integr. Biol. (Camb). 6 (4), 382-387 (2014).
