Summary
Her præsenterer vi en Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protokol til at studere molekylære ændringer i Fos-udtrykkende neuronale ensembler fra både fersk og frossen hjernevæv. Brugen af frosne væv tillader FACS isolering af mange områder i hjernen over flere sessioner for at maksimere brugen af værdifulde dyr fag.
Abstract
Studiet af neuroplasticitet og molekylære ændringer i lærde adfærd skifter fra undersøgelsen af hele områder af hjernen til studiet af specifikke sæt af tyndt fordelte aktiverede neuroner kaldet neuronale ensembler, der medierer lært foreninger. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) er for nylig blevet optimeret til voksne rotter hjernevæv og tilladt isolation af aktiverede neuroner under anvendelse af antistoffer mod den neuronale markør NeuN og Fos-protein, en markør for stærkt aktiverede neuroner. Indtil nu, blev Fos-udtrykkende neuroner og andre celletyper isoleret fra frisk væv, hvilket medførte lange behandlingstider dage og tilladt meget begrænset antal hjerne prøver, der skal vurderes efter langvarige og komplicerede adfærdsmæssige procedurer. Her fandt vi, at udbyttet af Fos-udtrykkende neuroner og Fos mRNA fra dorsale striatum var ens mellem frisk dissekeret væv og væv frosset ved -80 ºC i 3 - 21 dage. Desuden bekræftede vi fænotypenDe NeuN-positive og NeuN-negative sorterede celler ved at vurdere genekspression af neuronal (NeuN), astrocytiske (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) og microgial (Iba1) markører, hvilket indikerer, at frosne væv også kan anvendes til FACS isolering af gliale celletyper. Samlet set er det muligt at indsamle, dissekere og fryse hjernevæv for flere FACS sessioner. Dette maksimerer mængden af data fra værdifulde dyr emner, der ofte har gennemgået lange og komplekse adfærdsmæssige procedurer.
Introduction
Under læring, dyr danne foreninger mellem komplekse sæt af meget specifikke stimuli. Denne høj opløsning information menes at være kodet af ændringer inden for specifikke mønstre af tyndt fordelte neuroner kaldet neuronale ensembler. Neuronale ensembler er for nylig blevet identificeret af induktion af umiddelbart tidlige gener (IEGs) såsom Fos, Arc, og Zif268 og deres proteinprodukter i neuroner, der var stærkt aktiveres under opførsel eller cue eksponering. Fos-udtrykkende neuroner i særdeleshed har vist sig at spille kausale roller i sammenhæng og cue-specifik indlært adfærd 1-4. Således unikke molekylære neuroadaptations inden for disse aktiverede Fos-udtrykkende neuroner er top kandidater til de neurale mekanismer, der koder lært sammenslutninger under normale læring og unormal læring lidelser, såsom afhængighed og post-traumatisk stress disorder (PTSD) 5.
Fluorescence cellesortering (FACS) for nylig tillod analyse af unikke molekylære neuroadaptations inden Fos-udtrykkende neuroner. Flowcytometri og celle sortering blev udviklet i 1960'erne 6,7 til at karakterisere og isolere celler i henhold til deres lys-spredning og immunfluorescerende egenskaber, og har længe været anvendt i immunologi og kræftforskning. Imidlertid flowcytometri og FACS kræver dissocierede enkeltceller, der er vanskelige at få fra voksent hjernevæv. FACS blev første gang brugt til at isolere og analysere Green Fluorescent Protein (GFP) udtrykkende striatale neuroner fra transgene mus, der ikke krævede antistof mærkning 8,9. Vi udviklede et antistof-baserede FACS metode 10 til isolering og vurdere molekylære ændringer i Fos-udtrykkende neuroner aktiveres af lægemiddel og / eller stikord i vildtypedyr 11-15. Ved denne fremgangsmåde er neuroner mærket med et antistof mod den generelle neuronal markør NeuN, mens stærkt aktiveret neuronerer mærket med et antistof mod Fos. Selvom vores indledende metode krævede sammenlægning af op til 10 rotter per prøve for frisk væv, efterfølgende ændringer af protokollen tillod FACS isolering af Fos-udtrykkende neuroner og kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) analyse af diskrete hjerneområder fra en enkelt rotte 13-15 . Samlet set blev der unikke molekylære forandringer fundet i Fos-udtrykkende neuroner aktiveres under en række kontekstafhængige og cue-aktiverede adfærd i afhængighed forskning 12,14,15.
En stor logistisk problem med at udføre FACS på frisk væv er, at det tager en hel dag til at adskille vævet og processen ved FACS. Desuden kan kun omkring fire prøver behandles per dag. Dette betyder sædvanligvis, at kun én hjerneområde kan vurderes fra hver hjerne og de resterende hjerneområder skal kasseres. Dette er et stort problem for lav gennemløb adfærdsmæssige procedurer såsom selvadministration og udslettelse training, der kræver operation og mange ugers intensiv træning. Endvidere lange og komplicerede adfærdsmæssige procedurer på testdagen gør det vanskeligt at udføre FACS på samme dag. Det ville være en betydelig fordel at kunne indefryse hjerner fra dyrene umiddelbart efter adfærdsmæssige test, og derefter isolere Fos-udtrykkende neuroner fra en eller flere områder i hjernen på forskellige tidspunkter af efterforskerne 'valg.
Her demonstrerer vi, at vores FACS protokol kan bruges til at isolere Fos-udtrykkende neuroner (og andre celletyper) fra både friske og frosne hjernevæv. Som et eksempel, vi isolerede Fos-udtrykkende neuroner fra rotte-striatum efter akut metamfetamin injektioner og fra naive rotter uden injektioner (kontrol betingelse). Dog kan denne FACS protokol anvendes efter enhver adfærdsmæssig eller farmakologisk behandling. Efterfølgende qPCR-analyse af vores prøver viste, at genekspression fra disse celletyper kunne vurderes med similar effektivitet fra både fersk og frossen væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr 16.
Bemærk: Alle nedenstående trin brug lav-bindende centrifugeglas, som blev holdt på is, medmindre andet er angivet.
1. Forberedelse Før Tissue Collection
- Indstil centrifugen til 4 ° C.
- Fire polish et sæt af tre glas Pasteur-pipetter med faldende diametre på ca. 1,3, 0,8 og 0,4 mm for hver prøve.
- Fremstilling af mærkede 1,7 ml-rør indeholdende 1 ml kold puffer A og holde rørene på is.
- Forbered en is bakke indeholdende hjernen udskæring matrix, spatler og glasplader (eller omvendt glas petriskål) på til at udføre dissektion. Pre-chill to eller flere barberblade på glasplader og bruge væv papir til at tørre alle instrumenter, der rører tspørgsmål.
- Optø enzymopløsningen ved stuetemperatur (RT) i 30 minutter før væv samling.
2. Tissue Collection og Dissection
- Indled adfærdsmæssige eller farmakologisk behandling 90 min før væv kollektion.
BEMÆRK: resultaterne vist her, akutte intraperitoneale injektioner af 5 mg / kg methamfetamin på rotter i en roman miljø (test tilstand) og naive rotter holdes i deres bure (kontrol betingelse) blev udført. - Bedøver rotten ved at placere den i et glas ekssikkator krukke med mættet isofluran og halshugge rotten 30-60 sek senere ved hjælp af en guillotine.
Brug en saks til at fjerne hud og muskler fra hovedet og eksponere kraniet. Brug rongeurs at skære kraniet og åbne foramen magnum og fjern den bageste del af kraniet. Brug rongeurs at skære langs de øverste kanter af kraniet for at blotlægge hjernen. Pas på ikke at beskadige hjernen. Brug en lille spatel til forsigtigt scoop under end løfte hjernen. Hæv hjernen og sender nerverne indtil hjernen er fri 17. - Dissekere væv under anvendelse barberblade.
BEMÆRK: Opnå vævsprøver ved hjælp af en af følgende metoder: (2.3.1) frisk dissekeret væv; (2.3.2) frosne væv efter dissektion; eller (2.3.3) frosne væv dissekeret fra frosne hele hjernen. Hold hjernen udskæring matrix, barberblade og glas plade tør hele dissektion og hakning processer som kondenseret vand kan føre til hypotonisk lysering af celler. Brug forstørrelsesglas til at sikre nøjagtig dissektion.- For frisk dissekeret væv, placere frisk udvundet hjerne ind i en hjerne udskæring matrix (en rotte hjerne-formet metal støber med slots til de barberblade på 1 mm mellemrum), som er afkølet på is. Sæt to eller flere præ-kølet barberblade i åbningerne til at skære koronale skiver, der indeholder hjernen region (er) af interesse. Den overskårne skive på den afkølede glasplade.
Bemærk: Dissekere hjernen regions af interesse på en kølet glas plade. - For frosne væv efter dissektion, dissekere hjernen region (er) af interesse fra skiver af frisk udvundet hjerne, svarende til den beskrevet ovenfor i 2.3.1. Placer dissekerede væv i et mikrorør og hurtigt fryse vævet ved nedsænkning mikrorør i -40 ºC isopentan i 20 sekunder. Hold dissekeret væv fastfrosset på alle tidspunkter i et -80 ºC fryser indtil yderligere behandling.
- For frosne væv, straks fryse frisk udvundet hjerne i -40 ºC isopentan og opbevares i en forseglet pose ved -80 ºC i op til 6 måneder.
- På dagen for dissektion, placere den frosne hjerne i en kryostat indstillet til ca. -20 ºC (ingen varmere end -18 ºC) i ca. 2 timer at ækvilibrere temperaturen.
BEMÆRK: Hjerner kan skæres let ved denne temperatur, mens meget køligere temperaturer gøre hjernen for skør til at blive skåret sikkert. - Brug barberblade til at skære 1 - 2 mm koronale skiverde frosne hjerner i en kryostat. Brug en afstumpet 12- til 16-gauge kanyle til at opnå væv slag fra disse skiver under frostvejr. Hold dissekeret væv fastfrosset på alle gange, indtil yderligere behandling.
- På dagen for dissektion, placere den frosne hjerne i en kryostat indstillet til ca. -20 ºC (ingen varmere end -18 ºC) i ca. 2 timer at ækvilibrere temperaturen.
- For frisk dissekeret væv, placere frisk udvundet hjerne ind i en hjerne udskæring matrix (en rotte hjerne-formet metal støber med slots til de barberblade på 1 mm mellemrum), som er afkølet på is. Sæt to eller flere præ-kølet barberblade i åbningerne til at skære koronale skiver, der indeholder hjernen region (er) af interesse. Den overskårne skive på den afkølede glasplade.
- Tilsæt 1 - 2 dråber buffer A for at dække det dissekerede væv inden hakningen. Fjerne det meste af den hvide substans fra vævet med to barberblade at forhindre tab af neuroner under resten af triturering processen. Hvis man starter med frosne væv og derefter tillade vævet at tø på den kolde glasplade for ikke mere end 1 min før påføring buffer A opløsning.
- Hakke vævet 100 gange i hver ortogonal retning med et barberblad på en kølet glasplade. Hold barberblad lodret til glaspladen, når hakning.
BEMÆRK: Grundig hakning er kritisk for alle protokol. - Brug barberblade til at overføre det hakkede væv ind mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml kold puffer A. Vend røret 3 - 5 gange for at keep alle hakket væv i opløsningen.
3. Cell Dissociation
BEMÆRK: Brug blide ende over ende blanding for alle de følgende trin. Brug ikke en vortex mixer og undgå luftbobler, der forårsager celleskader.
- Centrifugeres prøveglassene ved 110 xg i 2 min ved 4 * C. Supernatanten kasseres. Tilsæt langsomt 1 ml koldt frisk optøet enzymopløsning (indeholdende en blanding af proteolytiske enzymer) ned indervæg mikrorør. Umiddelbart suge hele pellet og forsigtigt pipetteres op og ned kun 4 gange med en pipette moderat store spids diameter at dispergere hakket vævspellet.
- Invertere mikrorør samme for at undgå pelleten klistrer til bunden, og inkuber prøverne med ende-over-ende blanding i 30 minutter ved 4 o C.
- Efter enzymatisk vævsfordøjelse, centrifugeres rørene ved 960 xg i 2 min ved 4 * C. Fjern supernatanten og tilsæt 0,6 ml kold buffer A. immediately efter tilsætning af puffer A, bruge den samme pipette spids at sprede pillen ved at suge op i hele pellet og forsigtigt pipette op og ned 5 gange.
- Mekanisk udriv fordøjede væv og indsamle i 15 ml rør ved hjælp af følgende trin. For hver prøve, bruge et separat sæt af 3 brand-poleret glas Pasteur-pipetter med faldende diametre på ca. 1,3, 0,8 og 0,4 mm knyttet til latex pærer.
- udriv forsigtigt hver prøve 10 gange med 1,3 mm glas pipette. Lad prøven nøjes med 2 minutter på is (resterne og udissocierede celler vil sedimentere til bunden). Opsaml supernatanten (~ 0,6 ml) og overføres til et 15 ml konisk rør (tube # 1).
- Tilføj 0,6 ml buffer A opløsning til den resterende pellet. Udriv prøve 10 gange med 0,8 mm glaspipette. Lad prøven nøjes med 2 minutter på is. Opsaml supernatanten (~ 0,6 ml) og overføres til de samme 15 ml konisk rør # 1.
- Tilføj 0,6 ml buffer A opløsning til den resterende pellet. Udriv prøve 10 gange med 0,4 mm glaspipette. Lad prøven nøjes med 2 minutter på is. Saml supernatanten (~ 0,6 ml; uden at røre pillen med ikke-dissocierede celler) og overførsel til de samme 15 ml konisk rør # 1.
BEMÆRK: Hold pipette 0,4 mm diameter i røret # 1 for følgende findeling trin. - Gentag trin 3.4.3 tre gange ved hjælp af den mindste glas pipette (~ 0,4 mm i diameter), og indsamle supernatanten til et separat 15 ml konisk rør (rør # 2).
- Tritureres de indsamlede cellesuspensioner i reagensglas # 1 og # 2 til 10 flere gange under anvendelse af 0,4 mm glaspipette og holde på is.
4. Cell Fiksering og Permeabilisering
- Forbered 4 mikrorør per prøve (to mikrorør til celler fra rør # 1 og to for celler fra rør # 2) ved tilsætning af 800 pi 100% kold ethanol (lagret ved -20 ° C før brug) i hvert rør og holde dem på is . Bemærk: Det endelige ethanolkoncentration vil være 50%.
- Pipette ~ 800 pi cellesuspensionerne (blandt rør # 1 og rør # 2) i hver af de 4 rør indeholdende kold ethanol og vend rørene for at blande prøverne.
- Inkuber rør på is i 15 minutter, medens inverterende rørene hver 5 min.
- Efter fiksering / permeabilisering, centrifugeres rørene ved 1700 xg i 4 min ved 4 ºC og kassér supernatanten. Efterlad 50 pi opløsning for at forhindre celletab.
BEMÆRK: pellets på dette tidspunkt er hvide og holde mindre til væggen af rørene end før permeabilisering. Derfor fjern supernatanten forsigtigt ved at røre væggen i mikrorør hvor der ikke er pellet og udarbejde supernatanten langsomt ved hjælp af en mikropipette.
5. Cell Filtrering
- Re-suspendere piller fra trin 4.4 med kold PBS som følger:
- Tilføj 550 pi kold PBS til en af de to mikrorør kommer fra røret # 1, og bruge en moderat stor diameter piPette tip til forsigtigt pipettere cellesuspensionen op og ned 5 gange. Gentag den samme for en mikrorør kommer fra røret # 2.
- For celler fra rør # 1 under anvendelse af samme pipette den første cellesuspension til den anden pellet. Resuspender den anden pellet ved forsigtigt at pipettere det kombinerede cellesuspension op og ned 5 gange.
- For celler fra rør # 2, resuspenderes og kombinere pellets (dvs. tredje og fjerde mikrorør) som beskrevet i 5.1.2.
- Filtrere to cellesuspensioner fra trin 5.1.2 og 5.1.3 separat under anvendelse af to forskellige par celle sier (100 um og 40 um porestørrelse) som følger:
- Pre-wet hver cellesigte ved tilsætning PBS til indersiden af sien. Brug en pipette til at fjerne den overskydende PBS fra ydersiden af sien.
- Pipetteres cellesuspensionen fra trin 5.1.2 jævnt på den første celle si med 100 um porestørrelse. Opsaml gennemløbet i et 50 ml rør på is. Brug piPette til opsamling af rindende gennem fastgjort på den ydre side bunden af cellen si.
- Brug samme pipette til at overføre gennemløbet fra 100 um cellefilter til 40 um cellefilter. Indsamle disse gennemstrømning i en anden 50 ml rør på is. Ved overførsel strømmen igennem fra 40 um celle si, skifte til nye pipettespidser for at undgå forurening fra 100 um celle si.
- Gentag disse trin for cellesuspensionen fra trin 5.1.3 ved hjælp af et nyt sæt filtre.
- Kombinere de to gennemløbet fra hver prøve til et slutvolumen på ca. 1 ml pr prøve.
6. Inkubation med antistoffer
BEMÆRK: Brug små portioner af hjernen cellesuspensioner at forberede flere kontrolprøver til indstilling passende flowcytometer indstillinger, inden du kører den vigtigste prøve. For hvert antistof mærkning, forberede kontrolprøver, der indeholder ingen antistoffer, kun SEcondary antistof (eller anden fluorescerende mærkning), og derefter både primære og sekundære antistoffer (eller andre fluorescerende mærke). Brug disse knapper til at indstille portene, der adskiller specifikke versus ikke-specifik mærkning i flowcytometeret. Når det er muligt, skal du bruge fluorokromer, der ikke kræver kompensation. Forøg slutvolumenet af gating kontrolprøver til et slutvolumen på 700 pi PBS ved tilsætning før tilsætning af de primære antistoffer.
- Forbered lysspredning og DAPI prøve kontrol ved at overføre en 100 pi prøve af de filtrerede celler til en 1,7 ml mikrorør. Tilsættes 600 pi kold PBS med 1 ug / ml DAPI for kerner farvning. Der inkuberes i 10 min med ende-over-ende blanding, og vask (som angivet i trin 6.4.2 til 6.4.5) inden de passerer gennem flowcytometeret.
BEMÆRK: Denne prøve bruges kun til at indstille cellen / kerner gate før sortering de resterende celler i FACS maskine. - Forbered enkelt immunolabeled kontrolprøver ved at overføre 100 & #181; l af de filtrerede celler til en 1,7 ml mikrorør. Tilsættes 600 pi kold PBS med ét antistof (f.eks NeuN antistof). Tilsættes 600 pi kold PBS til en mikrorør med et andet antistof (fx Fos-antistof). Tilsæt tilsvarende sekundære antistof, hvis det ikke er en direkte-konjugeret primært antistof.
BEMÆRK: Disse prøver anvendes til at bestemme den passende fotomultiplikatorrør (PMT) spænding, og for at vurdere overlapningen af de to fluorescerende signaler om nødvendigt. Antistof koncentrationer bør titreres for at opnå de bedste signal-til-støj-forhold i alle kanaler. Overlappende fluorescerende signaler kan også kompenseres ved intern kalibrering af forskellige fluorescerende kanaler i flowcytometeret. - Forbered dobbelt fluorescensmærket negativ kontrolprøve ved at overføre 100 pi de filtrerede celler til et 1,7 ml mikrorør. Tilsættes 600 pi kold PBS med de sekundære antistoffer alene eller IgG direkte-konjugerede primære antistoffer.
BEMÆRK: This kontrolprøve kan bruges hver gang før sorteringen til at bestemme baggrunden fluorescens for hver fluorofor. - Forbered vigtigste prøve, der skal sorteres.
- Overfør 700 ul af de filtrerede celler i et 1,7 ml mikrorør. Tilsættes 7 pi (1: 100) af det primære Fos-antistof konjugeret direkte til Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) og 1,4 pi (1: 500) af primære NeuN antistof konjugeret direkte til phycoerythrin (anti-NeuN-PE). Inkuber rørene i 30 minutter ved 4 ° C med ende-over-ende blanding.
- Ved afslutningen af inkubationen tilsættes 800 pi kold PBS til hver mikrorør, herunder hovedstikprøven og kontrolprøver, og bland ved inversion.
- Centrifuger mikrorør på 1300 xg i 3 min ved 4 ºC. Supernatanten fjernes, hvilket efterlader 50 gl supernatant at forhindre celletab.
- Der tilsættes 1 ml kold PBS til pelleten og resuspender cellerne ved anvendelse af en pipette med en moderat store spids diameter.
- Centrifuger ved 1300 xg i 3 min ved 4 ºC. Discard supernatanten.
- Resuspender pellet i 500 pi kold PBS (justere slutvolumen afhængigt af størrelsen af pellet).
- Overførsel og foretage suspensionen i en rundbundet FACS prøveglas med en cellesigte hætte (40 um). Hold immunolabeled celler på is og straks udføre FACS. Bemærk: filtrering, røre pipettespidsen lodret på si hætte og skub cellesuspensionen gennem det.
- Set flowcytometer porte ved hjælp af kontrolprøver.
- Brug lys-spredning og DAPI prøve kontrol for at identificere den neuroncellen befolkning fra de samlede hændelser og cellulært debris.
BEMÆRK: Cell organer i dette præparat er kun 1 - 2% af de samlede hændelser (resten er snavs og brudte cellulære processer). Baseret på DAPI fluorescerende signal (med angivelse kerner) og Forward scatter (størrelse af cellen) er det muligt at lokalisere celle organer og gate bagud baseret på Forward og Side lysspredende egenskabercellerne (som vist i figur 1 A, B). - Brug de enkelte immunolabeled kontrolprøver for at bestemme indstillingerne for PMT spænding, og analysere afsmitning af emission fra en bestemt fluorokrom til et andet filter / kanal (f.eks Alexa Fluor 488 / FITC eller phycoerythrin). Hvis fluorescerende signaler overlapper, korrigere overlapningen ved at justere erstatningsniveauet manuelt.
- Brug det dobbelte fluorescerende-mærkede negative kontrol til at oprette tærsklen for den positive population.
BEMÆRK: signal, der kommer fra denne prøve menes at skyldes autofluorescens og cellerne i hovedstikprøven placeret over denne tærskel kan betragtes som positive. Typisk de tærskelværdier parametre for sortering er strengere og ca. top 2/3 af de mærkede celler over den negative kontrol er faktisk sorteres.
- Brug lys-spredning og DAPI prøve kontrol for at identificere den neuroncellen befolkning fra de samlede hændelser og cellulært debris.
- Sorter neuronerne fra den vigtigste prøve ved FACS i 1,7 ml mikrorør. Opsamle cellerne i 50 pi RNAekstraktionspuffer. Efter sortering, vortex og centrifuger røret og bland suspensionen ved pipettering op og ned 10 gange for at få alle sorterede celler fra væggene i røret.
- Inkubér sorterede cellesuspension ved 42 ºC i 30 minutter for at sikre, at alle celler lyseres før RNA-ekstraktion, og centrifugeres ved 2.800 xg i 2 min ved 4 * C.
- Supernatanten overføres til et RNase-frit rør til langtidsopbevaring ved -80 ºC eller umiddelbart behandle prøven for RNA-isolering, cDNA-syntese, målgen pre-amplifikation og qPCR, som tidligere 13-15 beskrevne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sortering Fos-positive og Fos-negative neuroner fra fersk og frosset dorsale striatum væv fra enkelte rotter efter akut metamfetamin injektioner.
Den ovenfor beskrevne protokol blev anvendt til at sortere Fos-positive og Fos-negative neuroner fra en enkelt rotte dorsal striatum 90 min efter en intraperitoneal injektion af methamfetamin (5 mg / kg). Naive rotter i deres bure blev anvendt som kontroller. Dorsal striatum væv blev behandlet enten umiddelbart efter sin samling (frisk væv) eller behandles efter at være frosset og opbevaret i -80 ºC i 1, 7 eller 21 dage. Resultaterne fra disse frysning tidspunkter var ikke signifikant forskellige fra hinanden, så dataene blev samlet.
At oprette sorteringsbetingelserne på instrumentet, kontrolprøver (beskrevet ovenfor) fra enten hjemmet bur kontrol eller methamphetamine-injicerede grupper blev anvendt. Når hver partikel eller begivenhed i disse prøver passerer gennem flowcellen i cytometeret, får de et identifikationsnummer, der er tilknyttet begivenhedens lysspredning og fluorescens egenskaber og indført i et regneark. Begivenhederne i dette ark kan så organiseret i spredningsdiagrammer eller tæthed grunde til disse karakteristika (figur 1). Begivenheder med tilsvarende karakteristika kan derefter grupperes eller 'gated' ved forskellige par egenskaber til at bestemme portene såsom dem, der indeholder celler, neuroner, eller Fos-positive neuroner. Når portene bestemmes ved anvendelse kontrolprøverne ovenfor beskrevne, er den vigtigste prøve injiceres i flowcytometeret og sorteres efter disse porte. Cellepopulationen var gated fra alle hændelser (celler og rester) baseret på deres frontal lysspredning (FSC; en indikation af partiklens størrelse) og side lysspredning (SSC; en indikation af partiklens granularity). Som vist i FSC versus SSC punktdiagram (figur 1A og 1B), en massefylde plot af alle begivenheder afslører en lille homogen population med lignende størrelse og granularitet, foruden en stor heterogen population (figur 1A og 1B). En lille homogen befolkning, der indeholder cellelegemer blev identificeret og gated som "celler", baseret på FSC og SSC egenskaber fra tidligere undersøgelser 11,13-15 og mærkning med DAPI. En lidt større andel af celler blev opnået fra frosne væv (2,6%) end fra frisk væv (1,9%). Den store heterogen population er for det meste snavs, formentlig fra dendritter og axonale processer.
Dernæst enkelte celler fra "celler" gate blev identificeret baseret på deres størrelse, hvilket blev indikeret ved bredden af FSC signalet for hvert arrangement på x-aksen. Begivenheder, der var større end enkeltceller blev anset celleaggregater og udelukket fra "Enkelt celle gate. Alle de efterfølgende analysetrin blev udført inden for denne" Enkelt celle "gate (figur 1C og 1D). Flertal af denne enkelt celle population (> 92%) var positiv for DAPI farvning (data ikke vist).
Først blev neuroner identificeret på basis af deres PE fluorescensintensitet som angivet NeuN-immunreaktivitet (figur 1E og 1F). Neuroner omfattede ca. 24% af alle hændelser fra "Enkelt celle" gate for frisk væv og 38% for frosset væv. Næsten alle begivenhederne i denne "Neuron" gate (98% i frisk væv og 99% i frosne væv) var positive for DAPI farvning af DNA i cellekerner (Figur 1G og 1 H). De resterende DAPI-mærkede begivenheder i Enkelt celle gate er NeuN-negative og omfatter glia, oligodendrocytter og microglia, som bekræftet af qPCR i figur 3.
ove_content "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Så neuroner blev klassificeret som Fos-positive eller Fos-negative neuroner baseret på deres Alexa Fluor 647 fluorescenssignal (Fos-immunoreaktivitet) I modsætning til celle-type markører, Fos. ekspressionsniveauerne i neuroner øges gradvist på grund af forskellige niveauer af neurale aktivitet og tidsforløb. Derfor vil der ikke være nogen klar grænse mellem Fos-positive versus Fos-negative neuroner. i det første trin (bruges kun til off-line analyser beregne procenter af Fos-positive neuroner) definerede vi tærsklen for Fos-positive neuroner baseret på den maksimale Alexa-647 fluorescens (for Fos) fra NeuN-negative population i de naive kontrolrotter bur. Fos-positive neuroner er angivet i de blå firkanter fra forskellige eksperimentelle betingelser i Figur 2 i både friske og frosne væv, de procentvise Fos-positive neuroner fra metamfetamin-injicerede rotter. (1,9 - 2,2%, figur 2C og 2D) var dobbelt så compared til hjem bur rotter (0,7 - 0,8%, figur 2a og 2b).Bekræfter celletype-specifikke gener fra FACS-sorterede celler under anvendelse af målgen præ-opformering og RT-PCR.
I det andet trin, for at sikre sortering af kun Fos-positive neuroner fra hovedstikprøven for efterfølgende mRNA analyser og reducere optagelsen af Fos-negative celler, blev fluorescens tærskel Alexa-647 hæves, således at kun de øverste to tredjedele af Fos -positive begivenheder i de blå firkanter blev sorteret og indsamlet. Denne tærskel har mindst 10 gange højere fluorescens (højere Fos ekspression per celle) end tærskel anvendt ovenfor til at beregne procentdelen af Fos-positive neuroner i prøverne. Fire populationer af celler blev sorteret fra en enkelt vævsprøve, herunder NeuN-negative + Fos-negative (~ 5.000 hændelser), NeuN-negative + Fos-positive (varierede 25 - 83 events), NeuN-positive + Fos-negtiv (~ 5.000 hændelser) og NeuN-positive + Fos-positive (varierede 44 - 133 begivenheder for hjemmet gruppen, 185 - 450 begivenheder for metamfetamin gruppe). Først blev ekspression af celletype-specifikke gener i NeuN-positive (herunder både Fos-positive og Fos-negativ) og NeuN-negative population (herunder både Fos-positive og Fos-negative) bekræftet (figur 3). GAPDH var anvendes som reference / housekeeping-gen, baseret på resultater fra vores tidligere undersøgelse 13. For at kontrollere for forskellige niveauer af RNA i prøven og cDNA i PCR-reaktioner, blev duplex qPCR reaktioner udført ved anvendelse af primere for både målgenet og GAPDH cDNA. Ct-værdier for GAPDH housekeeping-genet blev holdt mellem 15 og 31 for nøjagtige målinger. For både friske og frosne væv, NeuN mRNA-niveauer var signifikant større (ca. 8 gange) i NeuN-positive population end i NeuN-negative population (p <0,05; Figur 3A GFAP (glial cellemarkør, figur 3B) og Oligo2 (oligodendrocyt cellemarkør, figur 3C) mRNA-niveauer var større i NeuN-negative population end i NeuN-positive population (p <0,05 ). En lignende tendens af højere Iba1 (mikroglial cellemarkør, figur 3D) mRNA-niveauer blev observeret i NeuN-negative population, men dette var ikke statistisk signifikant. Nogle prøver indeholdt ekstremt lave niveauer af bestemte mRNA'er, der ikke kunne måles nøjagtigt i en bestemt celletype (fx GFAP-mRNA i NeuN-mærkede neuroner). Maksimale Ct-værdier blev defineret som 35 til at fjerne værdier, der var for lav til at ske nøjagtig registrering. Højere Ct-værdier overskred konfidensgrænse i vores qPCR assays.
Fos-mRNA-ekspression varundersøgt i NeuN-positive neuronal population fra rotter, der modtog en enkelt injektion af methamfetamin (figur 4). For både fersk og frosset væv, Fos mRNA-niveauer var større i Fos-positive neuroner end i Fos-negative neuroner (p <0,05). Skønt der var en 3-fold forøgelse af Fos mRNA i Fos-positive neuroner fra frisk væv, en 11-dobling af Fos mRNA i Fos-positive neuroner fra det frosne væv blev påvist. Tilsammen disse mRNA resultater bekræfter identiteten af Fos-positive neuroner, Fos-negative neuroner og ikke-neuronal population fra både fersk og frossen væv. Endvidere kan celletype-specifikke gener og andre gener af interesse også analyseres fra sorterede celler under både friske og frosne betingelser.
Figur 1. Gating of Disknyttede og mærkede celler fra Fresh and Frozen Rat Dorsal striatum. Den "Celler" gate blev bestemt ved frem og side scatter egenskaber (AD) og bekræftet af positiv mærkning med nukleare DAPI farvning (GH). Den "Neuroner 'gate i den" celler "befolkning blev bestemt ved fluorescens for NeuN (PE, EF). (A - B), Cell gate: Lineær plot af alle hændelser, baseret på deres fremadrettet spredning (x-akse, cellestørrelse) og sidespredning (Y-akse, granulering). (C - D) enkeltceller gate: Lineær plot af fremadrettet lysspredning højde (Y-akse) og bredde (X-aksen) i cellen gate vist i AB. (E - F) Neuron gate: Logaritmisk plot af immunofluorescens for PE-mærket NeuN (Y-akse) inden gate den enkelte celler er vist i CD afslører neuroner i den øvre klynge af begivenheder og ikke-neuronale celler i den nedre klynge. (G H) Nuclei farvning: Logaritmisk plot af fluorescens for DAPI-mærkede kerner (Y-akse) inden for neuronal celle gate. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Gating af Fos-positive og Fos-negative Neuroner fra Fresh and Frozen Rat Dorsal striatum Baseret på Double Mærkning for NeuN og Fos. Den friske og frosne dorsale striatum fra rotter (taget direkte fra deres hjem bur eller 90 min efter en enkelt intraperitoneal injektion af metamfetamin) blev dissocieret og mærket med de direkte konjugerede antistoffer mod NeuN og Fos og sorteret under anvendelse af en FACS-maskine. Sortering var baseret på phycoerythrin (PE) -mærket NeuN immunofluorescens (X-aksen) og Alexa 647-mærket Fos immunofluorescence (Y-aksen). Fos-positive (blå prikker) og Fos-negative (røde prikker) neuroner blev placeret i de øvre og nedre højre kvadranter hhv. Dot plots viser NeuN-positive celler (neuroner) og NeuN-negative celler (grå prikker); de blå firkanter indikerer neuroner med ovennævnte tærskel Fos ekspression. (A - B) Hjem gruppe: naive rotter taget direkte fra deres bure. (C - D) Metamfetamin gruppe: rotter, der fik enkelte injektioner af metamfetamin. Tærskelværdierne for Fos-positive neuroner blev udvalgt til at være lige over maksimal Alexa-647 fluorescens (Fos-IR) observeret for NeuN-negative celler i hjemmet bur kontrolgruppen. Mens 0,7-0,8% af alle neuroner er Fos-positive i hjemmet gruppen, 1,9-2,2% af alle neuroner er Fos-positive i metamfetamin gruppen.
Figur 3. celletypespecifik genekspression i FACS-sorteres Celler fra Fresh and Frozen Rat Dorsal striatum. NeuN-positive neuroner (Fos-positive og Fos-negative) og NeuN-negative celler (Fos-positive og Fos-negative) blev sorteret anvendelse af den beskrevne protokol og mRNA ekspressionsniveauer af celletype-specifikke gener blev anvendt til at bekræfte cellesortering. (a) NeuN er en markør for neuronale celler. (B) GFAP er en markør for gliaceller. (C) Oligo2 er en markør for oligodendrocytceller. (D) Iba1 er en markør for mikrogliaceller. For NeuN mRNA, er data præsenteret som middelværdi ± SEM af fold værdier i forhold til ekspressionsniveauer i NeuN-negative celler fra frisk væv (n = 9 - 14). For GFAP (n = 6 - 12), Oligo2 (n = 9 - 11) og Iba1 (n = 5 - 8) mRNA, data er præsenteret som gennemsnit ± SEM af fold værdier i forhold til ekspressionsniveauer i NeuN-positive celler fra frisk væv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Fos mRNA Niveauer i FACS-sorteret Neuroner fra friske eller frosne Rat Dorsal striatum efter metamfetamin Injection. Fos-positive og Fos-negative neuroner blev sorteret som beskrevet i protokollen ovenfor, og mRNA-niveauer af Fos blev bekræftet. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM af fold værdier i forhold til ekspressionsniveauer i Fos-negative neuroner fra frisk væv (n = 3 - 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FACS kan anvendes til at sortere neuroner og andre celletyper fra enten friske eller frosne voksent hjernevæv. Som nævnt i indledningen, evnen til at bruge frosne væv giver optimal udnyttelse af prøver fra dyr, der har gennemgået komplicerede og langvarige adfærdsmæssige procedurer, såsom selv-administration og tilbagefald studier i afhængighed forskning. Disse adfærdsmæssige procedurer tager normalt 1 - 2 ud hr eller længere, og kræve, at alle dyr (10 - 20 i alt) blive testet på samme dag 13,18. Det tager ~ 4 hr at behandle 4 frisk dissekerede hjerne vævsprøver, som omfatter hjerne dissektion, celle dissociation, permeabilisering og immunolabeling. Efter bearbejdning, sortering hver prøve ved FACS tager mellem 20 - 30 min. Det sidste trin af opvarmning af de sorterede celler i lysisbuffer kræver yderligere 30 minutter. I alt ~ 7 timer er påkrævet fra hjerne dissektion til den endelige RNA-holdige celle-lysis opløsning trin. Imidlertid er det nu muligt at fryse hele brains eller frisk dissekeret hjerneområder umiddelbart efter testning, og behandle dem senere. Derved forenkles afprøvning og gælder for flere områder i hjernen, der skal sorteres på en anden dag. Frysning af vævet før FACS kan også forbedre resultaterne. Mere NeuN-positive neuroner opnås fra frosne vævsprøver. Dette kan delvis forklares ved øget NeuN-mærkning på grund af forstyrrelse af cellemembraner under frysning og efterfølgende optøning, hvilket ville øge antistof adgang til intracellulære proteiner såsom NeuN og Fos. Lignende virkninger er blevet observeret med fibroblast, epitelceller og HeLa celler 19.
Udbyttet af celler og neuroner kan maksimeres ved hjælp af følgende trin. Under dissektion af vævet, fjerne størstedelen af hvid substans (corpus callosum og anterior commissure for dorsale striatum og nucleus accumbens, henholdsvis). Dette forhindrer væv fra at overholde plast tips og glas pipetter i den efterfølgende steps. Brug Buffer A (se specifikation i Tabel over Materialer og reagenser) for at holde det dissekerede væv dækket. Dette forbedrer kvaliteten af celler under hakning af vævet med barberblad (trin 2.5). Den ekstra sæt af 3 triturering trin med den mindste glaspipette (trin 3.9) og efterfølgende filtrering med et andet sæt af celle- sier (trin 5) fordobler udbyttet af celler og neuroner. Genbrug celle sier vil tilstoppe filtre og lavere celle udbytte. Vær blid med cellerne, når resuspension af pellets og under findeling. Anvendelsen af en moderat store pipettespids under disse trin vil reducere cellebeskadigelse grund forskydningsspænding. se omhyggeligt pillen, når du fjerner supernatanten efter permeabilisering med ethanol (trin 4.4). Pelleten er mindre kompakt og kan distribueres langs væggen af mikrocentrifugerør. Overslagsberegninger antyder, at udbyttet af Fos-positive neuroner er ca. 10% af det første nummer i det dissekerede striatale vævsprøve. Den aktuelle protokol kan tilpasses til andre eksperimentelle formål. I den nuværende protokol, blev vævet opsamlet 90 minutter efter metamfetamin injektioner, fordi Fos udtryk når maksimale niveauer på dette tidspunkt, der er afgørende for en effektiv sortering af Fos-udtrykkende neuroner. Imidlertid kan væv indsamles på noget tidspunkt for FACS, afhængigt af det specifikke formål med forsøget. For indledende oplagring vævsprøve, har vi med succes anvendt frisk dissekeret væv, frosne væv efter dissektion, eller frosset væv dissekeret fra frosne hele hjernen at isolere Fos-udtrykkende neuroner under anvendelse af FACS efterfulgt af qPCR analyse af genekspression. For fiksering og permeabilisering, varighed og temperatur i denne protokol (4 ºC i 15 min) blev optimeret til at permeabilisere både cytoplasmatiske og nukleare membraner, samt at fastsætte vævet. Variationer i varighed og / eller temperatur kan ændre de endelige resultater. Andre fiksering løsninger såsom paraformaldehyde og nonioniske detergenter, såsom saponin, der har arbejdet for embryonale og postnatale neuroner 20, kan også arbejde for neuroner fra voksne hjerne. Desuden kan myelin fjernelse perler anvendes som en ændring af den nuværende protokol, som vist for nylig for FACS fra hjernevæv 21.
Den nuværende protokol har to vigtige begrænsninger at overveje. Første er denne protokol ikke egnet til detektering cellefænotype markører, der primært udtrykkes i synapser (f.eks, dopamin eller glutamatreceptorer), fordi disse cellulære processer fjernes fra cellen organer i Triturering og dissociation trin. En anden mulig begrænsning er, at RNA-længder, der fås fra FACS-sorterede celler ikke kan være tilstrækkeligt til alle RNA analysemetoder. RNA integritet numre (RIN) til RNA opnået fra FACS sorteret celler er mellem 2,5- 3,5, hvilket svarer til gennemsnitligt kortere RNA længder. Her blev kortere RNA størrelse kompenseret afanvendelse af relativt korte qPCR amplikoner på 80 - 100 bps, som tidligere 13-15 beskrevne. Vi har også brugt disse kortere længde RNA held til microarray analyse 11. Ikke desto mindre kan korte RNA længder opnåede ikke være hensigtsmæssige alle RNA analysemetoder. Det skal understreges, at PCR-primere, der specifikt målrettede exon-exon junctions kun findes i fuldt splejset mRNA i cytosolen blev anvendt. Disse primere ikke detektere intron-indeholdende RNA fra kernen. Desuden har vi tidligere brugt denne protokol med antistoffer og frisk hjernevæv til påvisning tyrosinhydroxylase i cytosolen og D1 dopaminreceptorer i cellemembranen 10. Påvisning af disse cytosoliske og cellemembran markører indikerede, at dissociation procedure forårsager stort set intakte celler, og ikke blot kerner.
Samlet, FACS isolation af neuroner fra frosne prøver åbner andre programmer. Ingen forskelle i sortering eller gen EXPREssion blev observeret (data ikke vist), når prøverne blev opbevaret 3 dage eller 3 uger ved -80 ºC. Tre uger er en rimelig tid til at sortere alle prøver fra et bestemt eksperiment (20 - 40 prøver) og isolere RNA for genekspression. Anvendeligt RNA er også blevet opnået ud fra hjernevæv opbevaret i 6 måneder ved -80 ºC (data ikke vist her). Således kunne denne protokol være nyttigt for FACS isolering af post mortem frosne menneskelige hjerne prøver, der blev opbevaret i flere måneder eller endda år.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
References
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
- Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
- Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
- Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R.
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
- Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
- Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
- US National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
- Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
- Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
- Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).
