Summary
Hier presenteren we een Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol om moleculaire veranderingen studeren in Fos-uiting van neuronale ensembles van zowel verse als bevroren hersenweefsel. Het gebruik van bevroren weefsel maakt FACS isoleren van vele hersengebieden over meerdere zittingen aan het gebruik van kostbare proefdieren maximaliseren.
Abstract
De studie van neuroplasticiteit en moleculaire veranderingen in aangeleerd gedrag schakelt uit de studie van hele hersenen van de studie van specifieke sets van dun verspreid geactiveerde neuronen genaamd neuronale ensembles bemiddelen geleerd associaties. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is onlangs geoptimaliseerd voor volwassen rat hersenweefsel en liet isolatie van geactiveerde neuronen met behulp van antilichamen tegen neuronale merker NeuN en Fos eiwit, een marker van sterk geactiveerd neuronen. Tot nu toe werden Fos expressie brengende neuronen en andere celtypen geïsoleerd uit vers weefsel, dat lange verwerking dagen en men liet zeer beperkt aantal hersenmonsters worden bepaald na langdurige en complexe gedragsprocedures meebrengt. Hier vonden we dat de rendementen van Fos expressie neuronen en Fos mRNA uit dorsale striatum waren vergelijkbaar tussen vers ontleed weefsel en weefsel bevroren bij -80 ° C gedurende 3-21 dagen. Daarnaast bevestigde we het fenotypevan de Neun-positieve en NeuN-negatieve gesorteerde cellen door het bepalen van genexpressie van neuronale (NeuN), astrocyten (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) en microgial (Iba1) markers, wat aangeeft dat ingevroren weefsel kan ook worden gebruikt voor FACS isoleren gliale celsoorten. Kortom, het is mogelijk te verzamelen, ontleden en vries hersenweefsel voor meerdere FACS sessies. Dit maximaliseert de hoeveelheid gegevens verkregen van waardevolle dierlijke patiënten die vaak ondergaan lange en ingewikkelde gedragsprocedures.
Introduction
Tijdens het leren, dieren vormen associaties tussen complexe sets van zeer specifieke stimuli. Deze hoge-resolutie-informatie wordt gedacht te worden gecodeerd door wijzigingen binnen specifieke patronen van dun verspreid neuronen genaamd neuronale ensembles. Neuronale ensembles zijn onlangs geïdentificeerd door de inductie van onmiddellijk vroege genen (IEG 's), zoals Fos, Arc en Zif268 en hun eiwitproducten in neuronen die sterk in gedrag of cue exposure werden geactiveerd. Fos-expressie neuronen in het bijzonder is aangetoond dat oorzakelijke rol in context en cue-specifieke aangeleerd gedrag 1-4. Aldus unieke moleculaire neuroadaptations binnen deze geactiveerde Fos expressie brengende neuronen top kandidaten voor de neurale mechanismen die coderen geleerd verenigingen gevormd tijdens normale en abnormale leren leerstoornissen, zoals verslaving en posttraumatische stressstoornis (PTSS) 5.
fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) heeft onlangs toegestaan analyse van unieke moleculaire neuroadaptations in Fos expressie neuronen. Flowcytometrie en celsortering werden ontwikkeld in 1960 6,7 cellen te karakteriseren en te isoleren op basis van hun lichtverstrooiing eigenschappen en immunofluorescentie en zijn lang gebruikt in immunologie en kankeronderzoek. Echter flowcytometrie en FACS vereist gedissocieerde losse cellen die moeilijk te verkrijgen uit volwassen hersenweefsel zijn. FACS werd eerst gebruikt voor het isoleren en analyseren van Green Fluorescent Protein (GFP) tot expressie brengen striatale neuronen van transgene muizen die geen antilichaam labeling 8,9 vergde. We ontwikkelden een antilichaam gebaseerde FACS werkwijze 10 voor het isoleren en moleculaire veranderingen beoordelen Fos expressie brengende neuronen geactiveerd door drugs en / of aanwijzingen in wildtype dieren 11-15. In deze werkwijze worden neuronen gelabeld met een antilichaam tegen het algemene neurale marker NeuN, terwijl sterk geactiveerd neuronenzijn gemerkt met een antilichaam tegen Fos. Hoewel onze eerste werkwijze vereist bundeling tot 10 ratten per monster voor vers weefsel, verdere wijziging van protocol toegestane FACS isolatie van Fos-expressie (qPCR) analyse van discrete hersengebieden neuronen en kwantitatieve polymerasekettingreactie vanaf één rat 13-15 . In totaal werden unieke moleculaire veranderingen gevonden in Fos expressie neuronen geactiveerd tijdens een verscheidenheid aan context- en cue geactiveerd gedrag in de verslavingszorg onderzoek 12,14,15.
Een groot logistiek probleem bij het uitvoeren van FACS op verse weefsel is dat het een hele dag aan het weefsel en proces FACS dissociëren. Bovendien kan slechts vier monsters per dag worden verwerkt. Dit betekent gewoonlijk dat slechts een hersengebied van elke hersenen mogelijk is en de resterende hersengebieden moeten worden weggegooid. Dit is een groot probleem voor de lage throughput gedrags-procedures, zoals self-administratie en uitsterven training dat een operatie en vele weken van intensieve training vereist. Verder lang en ingewikkeld gedragsprocedures op testdag bemoeilijkt FACS voeren op dezelfde dag. Het zou een aanzienlijk voordeel kunnen de hersenen bevriezen van de dieren direct na gedragstesten en daarna uit een of meer hersengebieden isoleren Fos expressie neuronen op verschillende tijdstippen van de keuze onderzoekers.
Hier laten we zien dat onze FACS protocol kan worden gebruikt voor Fos expressie neuronen (en andere celtypen) van verse of bevroren hersenweefsel isoleren. Als voorbeeld, geïsoleerde we Fos expressie neuronen van de rat striatum na een acuut methamphetamine injecties en van naïeve ratten zonder injecties (controle conditie). Dit kan echter FACS protocol worden gebruikt na elke gedragstherapie of farmacologische behandeling. Daaropvolgende qPCR analyse van onze monsters aangegeven dat de genexpressie van deze celtypen kon worden beoordeeld met SimiLAR efficiency van zowel verse als bevroren weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren 16.
Opmerking: hieronder wordt lage bindingsaffiniteit centrifugebuizen Alle stappen die op ijs werden bewaard, tenzij anders vermeld.
1. Voorbereiding voor Tissue Collection
- Stel de centrifuge 4 o C.
- Fire polish een set van drie glazen Pasteurpipetten met afnemende diameters van ongeveer 1,3, 0,8 en 0,4 mm voor elk monster.
- Bereid gelabelde 1,7 ml-buisjes met 1 ml koude buffer A en houd de buizen op ijs.
- Bereid een ijs lade met de hersenen snijden matrix, spatels en glasplaten (of omgekeerd glas petrischaal) waarop de dissectie uit te voeren. Pre-chill twee of meer scheermesjes op de glasplaten en het gebruik tissues papier om alle instrumenten die de t raken drogenkwestie.
- Ontdooi de enzymoplossing bij kamertemperatuur (KT) gedurende 30 minuten voor weefselverzameltoestel.
2. Tissue Collection en Dissection
- Start de gedrags- of farmacologische behandeling 90 min voordat weefsel collectie.
LET OP: Voor de hier getoonde resultaten, acute intraperitoneale injecties van 5 mg / kg methamfetamine op ratten in een nieuwe omgeving (test conditie) en naïeve ratten bewaard in hun kooien (controle conditie) werden uitgevoerd. - Verdoven van de rat door het te plaatsen in een glazen pot met exsiccator verzadigd isofluraan en onthoofden de rat 30 - 60 sec later met behulp van een guillotine.
Gebruik een schaar om de huid en de spieren van het hoofd te verwijderen en bloot de schedel. Gebruik rongeurs aan de schedel te snijden en het openstellen van de foramen magnum en verwijder het achterste deel van de schedel. Gebruik rongeurs langs de bovenranden van de schedel te snijden naar de hersenen bloot. Zorg ervoor dat de hersenen niet beschadigt. Gebruik een kleine spatel om voorzichtig schep onder eend verheffen de hersenen. Verhoog de hersenen en snijd de zenuwen, totdat de hersenen is gratis 17. - Ontleden weefsel met behulp van scheermesjes.
LET OP: Zorg voor weefselmonsters met een van de volgende manieren: (2.3.1) vers ontleed weefsel; (2.3.2) ingevroren weefsel na dissectie; of (2.3.3) ingevroren weefsel ontleed uit bevroren hele brein. Houd de hersenen snijden matrix, scheermesjes en glasplaat droog gedurende de dissectie en fijnhakken processen gecondenseerde water kan leiden tot hypotoon lyseren van de cellen. Gebruik een vergrootglas om nauwkeurige dissectie te waarborgen.- Voor vers ontleed weefsel, plaatst de vers gewonnen hersenen in een brain slicing matrix (een rat brain-vormige metalen mal met sleuven voor de scheermesjes met tussenpozen 1 mm) die is gekoeld op ijs. Plaats twee of meer vooraf gekoelde scheermesjes in de groeven aan coronale plakjes dat hersengebied (s) van belang bevat snijden. Leg de gesneden slice op de gekoeld glas plaat.
Let op: Ontleden de hersenen regions van de rente op een gekoeld glas plaat. - Bevroren weefsel na sectie ontleden het hersengebied (s) plaats van segmenten van vers gewonnen hersenen, overeenkomstig aan die boven beschreven in 2.3.1. Plaats de ontleed weefsel in een microbuis en het weefsel snel bevriezen door onderdompeling in de microbuis -40 ° C voor 20 sec isopentaan. Houd ontleed weefsel bevroren te allen tijde in een -80 ° C vriezer tot verdere verwerking.
- Voor ingevroren weefsel, onmiddellijk te bevriezen de vers gewonnen hersenen bij -40 ºC isopentaan en op te slaan in een verzegelde zak bij -80 ° C gedurende maximaal 6 maanden.
- Op de dag van dissectie, De bevroren hersenen in een cryostaat ingesteld op ongeveer -20 ° C (niet warmer dan -18 ° C) gedurende ongeveer 2 uur om de temperatuur evenwicht.
OPMERKING: Hersenen kunnen gemakkelijk worden gesneden bij deze temperatuur, terwijl veel lagere temperaturen maakt de hersenen te bros veilig worden gesneden. - Gebruik scheermesjes tot 1 cut - 2 mm coronale plakjesde bevroren hersenen in een cryostaat. Gebruik een stomp 12- tot 16-gauge naald om weefsel te stoten uit deze schijfjes onder het vriespunt voorwaarden is voldaan. Houd ontleed weefsel bevroren allen tijde tot verdere verwerking.
- Op de dag van dissectie, De bevroren hersenen in een cryostaat ingesteld op ongeveer -20 ° C (niet warmer dan -18 ° C) gedurende ongeveer 2 uur om de temperatuur evenwicht.
- Voor vers ontleed weefsel, plaatst de vers gewonnen hersenen in een brain slicing matrix (een rat brain-vormige metalen mal met sleuven voor de scheermesjes met tussenpozen 1 mm) die is gekoeld op ijs. Plaats twee of meer vooraf gekoelde scheermesjes in de groeven aan coronale plakjes dat hersengebied (s) van belang bevat snijden. Leg de gesneden slice op de gekoeld glas plaat.
- Voeg 1-2 druppels buffer A aan de ontleed weefsel te bedekken voordat hakken. Ontrekken veel witte stof van het weefsel met twee scheermesjes tot verlies van neuronen tijdens de rest van het proces te voorkomen trituratie. Als ab ingevroren weefsel, dan laat het weefsel te ontdooien op de koude glasplaat niet meer dan 1 minuut voordat Buffer A oplossing.
- Gehakt het weefsel 100 keer in elke orthogonale richting met een scheermesje op een gekoelde glasplaat. Houd het scheermesje verticaal op de glasplaat bij het hakken.
NB: Grondige hakken is van cruciaal belang voor alle protocol stappen. - Scheermesjes aan gehakt weefsel over in microcentrifuge buisjes die 1 ml koude buffer A. Inverteer de buis 3-5 keer Keep alle gehakt weefsel in de oplossing.
3. Cel Dissociatie
LET OP: Gebruik zacht uiteinde over uiteinde mengen alle volgende stappen. Gebruik geen vortex mixer en vermijd luchtbellen die celschade veroorzaken.
- Centrifugeer de monsterbuizen bij 110 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Teruggooi supernatant. Voeg langzaam 1 ml koud vers ontdooid enzymoplossing (die een mix van proteolytische enzymen) door de binnenwand van de microbuis. Onmiddellijk zuigen de gehele pellet en voorzichtig pipet op en neer slechts 4 keer met een redelijk grote tip diameter pipet om het gehakt weefsel pellet verspreiden.
- Inverteer de microbuizen onmiddellijk te voorkomen dat de pellet plakken aan de bodem en incubeer de monsters met eind-over-eind mengen gedurende 30 minuten bij 4 ° C
- Na enzymatische digestie weefsel Centrifugeer de buizen bij 960 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en voeg 0,6 ml koude buffer A. immediately na het toevoegen van de buffer A, maken gebruik van dezelfde pipet tip om de pellet te verspreiden door te zuigen de gehele pellet en voorzichtig pipet op en neer 5 keer.
- Mechanisch vermaal het verteerde weefsel en verzamelen in 15 ml buizen met behulp van de volgende stappen. Voor elk monster, gebruik maken van een aparte set van 3-brand gepolijst glas Pasteur pipetten met aflopende diameters van gehecht aan latex bollen ongeveer 1,3, 0,8 en 0,4 mm.
- Zachtjes vermaal elk monster 10 maal met de 1,3 mm glazen pipet. Laat het monster genoegen nemen met 2 minuten op ijs (het puin en gedissocieerde cellen zullen naar de bodem). Verzamel de bovenstaande vloeistof (~ 0,6 ml) en transfer naar een 15 ml conische buis (buis # 1).
- Voeg 0,6 ml Buffer Een oplossing van de overblijvende pellet. Vermaal het monster 10 maal met de 0,8 mm glazen pipet. Laat het monster genoegen nemen met 2 minuten op ijs. Verzamel de bovenstaande vloeistof (~ 0,6 ml) en transfer naar dezelfde 15 ml conische buis # 1.
- Voeg 0,6 ml Buffer Een oplossing voor de resterende Pellet. Vermaal het monster 10 maal met de 0,4 mm glazen pipet. Laat het monster genoegen nemen met 2 minuten op ijs. Verzamel de bovenstaande vloeistof (~ 0,6 ml, zonder het aanraken van de pellet met niet-gesplitste cellen) en over te dragen aan dezelfde 15 ml conische buis # 1.
LET OP: Houd de diameter pipet 0,4 mm in de buis # 1 voor de volgende tritureren stappen. - Herhaal stap 3.4.3 drie keer met de kleinste glazen pipet (~ 0,4 mm diameter) en verzamel de bovenstaande vloeistof in een afzonderlijke 15 ml conische buis (buis # 2).
- Vermaal de verzamelde celsuspensies in buizen # 1 en # 2 voor 10 keer met de 0,4 mm glazen pipet en op ijs bewaren.
4. Cell Fixatie en Permeabilisatie
- Bereid 4 microbuisjes per monster (twee microbuisjes voor cellen van de buis # 1 en twee voor cellen van buis 2 #) door het toevoegen van 800 pi van 100% koude ethanol (bewaard bij -20 ° C voor gebruik) in elke buis en houd ze op ijs . Opmerking: De laatste ethanolconcentratie 50% bedragen.
- Pipetteer ~ 800 ul van de celsuspensies (van buis # 1 en # 2 tube) in elk van de 4 buizen met koude ethanol en keren de buizen naar de monsters te mengen.
- Incubeer buizen op ijs gedurende 15 minuten terwijl het omkeren van de buizen elke 5 min.
- Na fixatie / permeabilisatie, centrifuge de buizen bij 1.700 xg gedurende 4 minuten bij 4 ° C en gooi de supernatant. Reactie 50 pi oplossing van celverlies voorkomen.
OPMERKING: De korrels in dit stadium zijn wit en plak minder aan de wand van de buizen dan voorheen permeabilisatie. Daarom is de bovenstaande vloeistof voorzichtig door de wand van de microbuis te raken waar er geen pellet en het opstellen van de bovenstaande langzaam met behulp van een micropipet.
5. Cell Filtration
- Resuspendeer de pellets uit stap 4.4 met koude PBS als volgt:
- Voeg 550 ul koud PBS tot een van de twee microbuisjes uit buis # 1 en gebruik een redelijk grote diameter piPette tip om voorzichtig pipet de celsuspensie op en neer 5 keer. Herhaal hetzelfde voor één Microbuis afkomstig van de buis # 2.
- Voor cellen van buis # 1 met dezelfde pipet eerste celsuspensie tweede pellet. Resuspendeer de tweede pellet door voorzichtig pipetteren de gecombineerde celsuspensie op en neer 5 keer.
- Voor cellen van buis # 2, resuspendeer en voeg de pellets (dat wil zeggen, derde en vierde microbuizen) zoals beschreven in 5.1.2.
- Filtreer beide celsuspensies van stap 5.1.2 en 5.1.3 afzonderlijk met twee verschillende paren cellen zeven (100 urn en 40 urn poriegrootte) als volgt:
- Pre-nat elke cel zeef door toevoeging van PBS aan de binnenkant van de zeef. Gebruik een pipet om de overmaat PBS vanaf de buitenzijde van de zeef te verwijderen.
- Pipetteer de celsuspensie uit stap 5.1.2 gelijkmatig op de eerste cel zeef van 100 urn poriegrootte. Verzamel de doorstroming in een 50 ml buis op ijs. Gebruik de piPette de flow verzamelen via bevestigd aan de buitenzijde van de onderste cel zeef.
- Gebruik dezelfde pipet om de doorstroom te brengen van de cel 100 urn zeef om de 40 urn cel zeef. Verzamelen deze doorstroming in een 50 ml buis op ijs. Wanneer door middel van het overbrengen van de doorstroming van 40 micrometer cel zeef, veranderen om nieuwe pipet tips om besmetting van 100 micrometer cel zeef voorkomen.
- Herhaal deze stappen voor de celsuspensie uit stap 5.1.3 met een nieuwe set filters.
- Combineer de twee doorstroom van elk monster voor een eindvolume van ongeveer 1 ml per monster.
6. Incubatie met Antilichamen
LET OP: Gebruik maken van kleine hoeveelheden van de hersenen celsuspensies om meerdere controlemonsters voor te bereiden voor het instellen van de juiste flowcytometer instellingen voorafgaand aan het uitvoeren van de belangrijkste monster. Voor elk antilichaam labeling, voorbereiden controlemonsters die geen antistoffen, maar de se omvattencondary antilichaam (of ander fluorescerend label), en dan zowel de primaire en secundaire antilichamen (of andere fluorescerend label). Met deze bedieningselementen de poorten die specifieke versus niet-specifieke labeling in de flowcytometer scheiden ingesteld. Gebruik indien mogelijk fluorochromen die geen compensatie niet verplicht is. Verhoog het eindvolume van de gating controlemonsters een eindvolume van 700 pl door toevoeging van PBS voorafgaand aan het toevoegen van de primaire antilichamen.
- Bereid lichtverstrooiing en DAPI controlemonster door de overdracht van een 100 pi monster van de gefiltreerde cellen aan een 1,7 ml microbuisjes. Voeg 600 ul koude PBS met 1 ug / ml DAPI kleuring van kernen. Incubeer gedurende 10 min met een end-over-end mengen, en was (zoals aangegeven in de stappen 6.4.2 tot 6.4.5) alvorens door de flowcytometer.
LET OP: Dit monster wordt alleen gebruikt om de cel / kernen gate voorafgaand aan het sorteren van de resterende cellen in de FACS apparaat instellen. - Bereid enkele controlemonsters immunolabeled door de overdracht van 100 & #181, l van de gefiltreerde cellen aan een 1,7 ml microbuisjes. Voeg 600 ul koud PBS met een antilichaam (bijvoorbeeld antilichaam NeuN). Voeg 600 ul koud PBS tot een microbuis met een ander antilichaam (bv Fos antilichaam). Voeg de overeenkomstige secundaire antilichaam als het niet direct geconjugeerd primair antilichaam.
Opmerking: Deze monsters worden gebruikt om de juiste fotomultiplicatorbuis (PMT) spanning bepalen, en de overlap van de twee fluorescentiesignalen beoordelen indien nodig. Antilichaamconcentraties worden getitreerd om de beste signaal-ruisverhouding in alle kanalen bereiken. Overlappende fluorescentiesignalen kunnen worden gecompenseerd door interne ijking van verschillende fluorescentie kanalen in de flowcytometer. - Bereid double fluorescent gelabelde negatieve controlemonster door overdracht 100 ul van de gefiltreerde cellen aan een 1,7 ml microbuisjes. Voeg 600 ul koud PBS met de secundaire antilichamen alleen of IgG direct geconjugeerde primaire antilichamen.
LET OP: This controle monster kan worden gebruikt elke keer vóór sortering om de achtergrond fluorescentie voor elke fluorofoor te bepalen. - Bereid belangrijkste monster worden opgelost.
- Transfer 700 ul van de gefiltreerde cellen in een 1,7 ml microbuisjes. Voeg 7 pl (1: 100) van primair Fos antilichaam direct geconjugeerd met Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) en 1,4 pl (1: 500) van primair NeuN antilichaam direct geconjugeerd aan fycoerytrine (anti-NeuN-PE). Incubeer buizen gedurende 30 minuten bij 4 ° C met eind-over-eind mengen.
- Aan het einde van de incubatie, voeg 800 ul koud PBS aan elke microbuis, waaronder hoofdmonster en controlemonsters en meng door inversie.
- Centrifuge microbuisjes op 1.300 g gedurende 3 minuten bij 4 ºC. Verwijder het supernatant, waardoor 50 gl supernatant celverlies voorkomen.
- Voeg 1 ml koude PBS voor de pellet en resuspendeer cellen met een pipet met een redelijk grote tip diameter.
- Centrifugeer bij 1300 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. Discard het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 500 ul koud PBS (eindvolume passen afhankelijk van de grootte van het pellet).
- Overdracht en filteren de suspensie in een ronde bodem FACS monster buis met een cel zeef dop (40 pm). Houd de immunolabeled cellen op ijs en onmiddellijk uit te voeren FACS. Opmerking: Voor het filteren, raakt u de pipet tip verticaal op de zeef dop en duw de celsuspensie doorheen.
- Stel flowcytometer poorten met behulp van controlemonsters.
- Gebruik de lichtverstrooiende en DAPI controlemonster om de neuronale celpopulatie te identificeren van de totale gebeurtenissen en celresten.
LET OP: Cel lichamen in dit preparaat zijn slechts 1-2% van de totale gebeurtenissen (de rest zijn puin en gebroken cellulaire processen). Gebaseerd op DAPI fluorescentiesignaal (aangeeft kernen) en voorwaartse verstrooiing (grootte van de cel) is het mogelijk om cellichamen en poort achteren basis van de voorwaartse en zijwaartse lokaliseren lichtverstrooiende eigenschappen vande cellen (zoals getoond in figuur 1 A, B). - Gebruik de enkele controlemonsters immunolabeled naar het PMT voltage instellingen bepalen, en spillover van de emissie te analyseren vanuit één specifieke fluorochroom in een ander filter / kanaal (bijv Alexa Fluor 488 / FITC of Phycoerythrine). Als fluorescerende signalen overlappen, corrigeer de overlap door het handmatig aanpassen van de vergoeding niveaus.
- Gebruik de dubbele fluorescent-gelabelde negatieve controle voor het opzetten van de drempel voor de positieve populatie.
Opmerking: Het signaal afkomstig van dit monster wordt gedacht veroorzaakt door auto-fluorescentie en de cellen van het hoofdmonster boven deze drempel ligt kan als positief worden beschouwd. Typisch is de drempel voor het classificeren strenger en ongeveer boven 2/3 van de gemerkte cellen boven de negatieve controle daadwerkelijk gesorteerd.
- Gebruik de lichtverstrooiende en DAPI controlemonster om de neuronale celpopulatie te identificeren van de totale gebeurtenissen en celresten.
- Sorteer de neuronen van de belangrijkste monster door FACS in 1,7 ml microbuisjes. Verzamel de cellen in 50 ui RNAextractiebuffer. Na het sorteren vortex en centrifugeer de buis en meng de suspensie door en neer te pipetteren 10 maal alle gesorteerde cellen herstellen van de wanden van de buis.
- Incubeer de gesorteerde celsuspensie bij 42 ° C gedurende 30 minuten om ervoor te zorgen dat alle cellen voorafgaand aan RNA-extractie worden gelyseerd en centrifugeer bij 2800 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
- Breng de bovenstaande vloeistof over in een RNase-vrije buis voor langdurige opslag bij -80 ° C of onmiddellijk verwerken monster voor RNA-isolatie, cDNA synthese doelgen pre-amplificatie en qPCR, zoals eerder 13-15 beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sorteren van Fos-positieve en Fos-negatieve neuronen van verse en diepgevroren dorsale striatum weefsel van enkele ratten na acute methamphetamine injecties.
Het hierboven beschreven protocol werd gebruikt voor Fos-positieve en negatieve Fos-neuronen van een rat dorsale striatum 90 min direct na een intraperitoneale injectie van methamfetamine (5 mg / kg). Naïeve ratten in hun kooien werden gebruikt als controles. Dorsale hetzij onmiddellijk na haar collectie (vers weefsel) of verwerkt nadat ze ingevroren en opgeslagen in -80 ° C gedurende 1, 7 of 21 dagen striatum weefsel werd verwerkt. De resultaten van deze bevriezen tijdstippen waren niet significant verschillend van elkaar, zodat de gegevens werden samengevoegd.
Het opzetten van de sortering voorwaarden op het instrument, controlemonsters (hierboven beschreven) van hetzij de controle of methampheta kooi-Mine geïnjecteerde groepen werden gebruikt. Wanneer elk deeltje of evenement in deze monsters gaat door de doorstroomcel in de cytometer, krijgen ze een identificatienummer dat is gekoppeld aan lichtverstrooiing en fluorescentie-eigenschappen van het evenement en vastgelegd in een spreadsheet. De gebeurtenissen in dit blad kan dan in spreidingsdiagrammen of dichtheid percelen voor deze kenmerken (figuur 1) worden georganiseerd. Gebeurtenissen met gelijke eigenschappen kunnen vervolgens gegroepeerd of "gated" door verschillende paren van kenmerken die de poorten te bepalen zoals die welke cellen, neuronen, of Fos-positieve neuronen. Zodra de poorten worden bepaald met de controlemonsters hierboven beschreven, wordt het hoofdmonster geïnjecteerd in de stromingscytometer en gesorteerd volgens deze poorten. De cel populatie werd afgesloten van alle evenementen (cellen en puin) op basis van hun voorwaartse lichtverstrooiing (FSC, een indicatie van de grootte van het deeltje) en aan de zijkant lichtverstrooiing (SSC, een indicatie van G van het deeltjeranularity). Zoals getoond in de FSC versus SSC puntdiagram (Figuur 1A en 1B), de dichtheid plot van alle gebeurtenissen onthult een kleine homogene populatie met vergelijkbare grootte en granulariteit, naast een grote heterogene populatie (Figuur 1A en 1B). Een kleine homogene populatie die cel lichamen bevat werd geïdentificeerd en afgesloten als 'Cellen', op basis van FSC en SSC kenmerken uit eerdere studies 11,13-15 en labeling met DAPI. Een iets hoger percentage cellen werden verkregen uit bevroren weefsel (2,6%) dan met vers weefsel (1,9%). De grote heterogene populatie is meestal puin, vermoedelijk van dendrieten en axonale processen.
Vervolgens werden enkele cellen van de "cellen" gate geïdentificeerd op basis van hun grootte, die is aangegeven door de breedte van de FSC signaal voor elke gebeurtenis op de x-as. Gebeurtenissen die groter waren dan enkele cellen werden beschouwd als mobiele aggregaten en uitgesloten van de "Single cel gate. Alle daaropvolgende stappen analyses werden uitgevoerd binnen deze" Enkele cel "gate (figuur 1C en 1D). De meerderheid van deze enkele cel populatie (> 92%) was positief voor DAPI kleuring (gegevens niet getoond).
Eerst werden neuronen geïdentificeerd op basis van de PE fluorescentie-intensiteit die welke NeuN-immunoreactiviteit (figuur 1E en 1F). Neuronen omvatte ongeveer 24% van alle gebeurtenissen uit de "Single cell" gate voor verse weefsel en 38% voor bevroren weefsel. Bijna alle gebeurtenissen in deze "Neuron" gate (98% in verse weefsel en 99% in bevroren weefsel) waren positief voor DAPI kleuring van DNA in celkernen (figuur 1G en 1H). De overige DAPI-gelabeld gebeurtenissen in de Enkelvoudige cel gate zijn NeuN-negatieve en omvatten glia, oligodendrocyten en microglia, zoals bevestigd door qPCR in figuur 3.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Daarna werden neuronen geclassificeerd als Fos-positieve of negatieve Fos-neuronen basis van hun Alexa Fluor 647 fluorescentiesignaal (Fos-immunoreactiviteit) Unlike celtype markers, Fos. expressieniveaus in neuronen geleidelijk toe als gevolg van verschillende niveaus van neurale activiteit en tijdsduur. Daarom zal er geen opeenvolgende drempel tussen Fos-positieve versus Fos-negatief neuronen. in de eerste stap (alleen bij off-line analyses berekenen percentages Fos-positieve neuronen) definieerden we de drempel voor Fos-positieve neuronen gebaseerd op de maximale Alexa-647 fluorescentie (voor Fos) vanaf het NeuN-negatieve populatie in de naïeve kooi controleratten. Fos-positieve neuronen aangegeven in de blauwe vierkanten van verschillende experimentele omstandigheden in figuur 2 zowel verse en ingevroren weefsels, de percentage-Fos positieve neuronen van methamfetamine-geïnjecteerde ratten. (1,9-2,2%, figuur 2C en 2D) werd tweemaal medempared naar kooi ratten (0,7-0,8%, Figuur 2A en 2B).Bevestiging celtype specifieke genen van FACS gesorteerde cellen middels doelgen voorversterking en RT-PCR.
In de tweede stap, te garanderen sorteren van slechts Fos-positieve neuronen in de steekproef voor latere mRNA analyses en verminderen de opname van Fos-negatieve cellen, werd de Alexa-647 fluorescentie drempel verhoogd zodat alleen de bovenste tweederde van Fos -positieve gebeurtenissen in de blauwe vierkanten werden gesorteerd en verzameld. Deze drempel heeft ten minste 10-voudig hoger fluorescentie (hogere Fos expressie per cel) is dan de drempel waarboven gebruikt om het percentage van Fos-positieve neuronen in de monsters te berekenen. Vier populaties van cellen werden gesorteerd van een enkel weefselmonster, inclusief Neun-negatieve + Fos-negatief (~ 5000 evenementen), Neun-negatieve + Fos-positieve (varieerde 25-83 evenementen), Neun-positieve + Fos-negtieve (~ 5000 evenementen) en Neun-positieve + Fos-positieve (varieerde 44-133 evenementen voor de hoofdgroep, 185-450 evenementen voor de Methamphetamine groep). Ten eerste, de expressie van celtype-specifieke genen in NeuN-positieve (zowel Fos-positieve en Fos-negatief) en NeuN-negatieve populatie (zowel Fos-positieve en Fos-negatief) werd bevestigd (figuur 3). GAPDH was als referentie / huishoudgen, gebaseerd op de resultaten van onze vorige studie 13. Te controleren voor verschillende RNA in het monster en cDNA in de PCR-reacties werden duplex qPCR reacties uitgevoerd onder toepassing van primers voor zowel het doelgen en GAPDH cDNA. Ct-waarden voor het huishoud-gen GAPDH werden tussen 15 en 31 gedurende nauwkeurige metingen. Voor zowel verse als bevroren weefsel, NeuN mRNA niveaus waren significant groter (ongeveer 8-voudig) in de Neun-positieve populatie dan in NeuN-negatieve populatie (p <0,05; figuur 3A GFAP (glial cell marker Figuur 3B) en Oligo2 (oligodendrocyt celmarker Figuur 3C) mRNA niveaus waren hoger in de NeuN-negatieve populatie dan in de Neun-positieve populatie (p <0,05 ). Eenzelfde trend van hogere Iba1 (microglia celmarker Figuur 3D) mRNA werd waargenomen in de NeuN-negatieve populatie, maar dit was niet statistisch significant. Sommige monsters bevatten zeer lage specifieke mRNA's die niet nauwkeurig kon worden gemeten in een bepaald celtype (bijvoorbeeld GFAP mRNA in NeuN-gelabelde neuronen). Maximale Ct-waarden werden gedefinieerd als 35 waarden die te laag nauwkeurig te detecteren waren elimineren. Hogere Ct-waarden overschreden de limiet vertrouwen in onze qPCR assays.
Fos mRNA expressie wasonderzocht in de Neun-positieve neuronale populatie ratten die een enkele injectie van methamfetamine ontvangen (figuur 4). Voor zowel verse als bevroren weefsel, Fos mRNA niveaus waren hoger in de Fos-positieve neuronen dan in de Fos-negatieve neuronen (p <0,05). Bovendien, terwijl er was een 3-voudige toename van mRNA Fos in Fos-positieve neuronen van de verse weefsel, een 11-voudige toename van mRNA Fos in Fos-positieve neuronen van het bevroren weefsel werd waargenomen. Samengevat, deze mRNA resultaten bevestigen de identiteit van de Fos-positieve neuronen, Fos-negatieve neuronen en niet-neuronale populatie van verse en ingevroren weefsel. Bovendien celtype-specifieke genen en andere genen van belang eveneens geanalyseerd gesorteerd cellen onder verse of bevroren omstandigheden.
Figuur 1. Gating van Dispelde en gelabelde cellen van verse en diepgevroren Rat Dorsale striatum. De poort 'Cells' werd bepaald door de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing eigenschappen (AD) en bevestigd door positieve labeling met nucleaire DAPI kleuring (GH). De poort 'Neuronen "in de populatie' Cells 'werd bepaald met behulp van fluorescentie voor Neun (PE; EF). (A - B) Cell gate: Linear plot van alle gebeurtenissen, op basis van hun voorwaartse verstrooiing (X-as, cel grootte) en zijwaartse verstrooiing (Y-as, granulariteit). (C - D) Single cellen poort lineaire plot van voorwaartse verstrooiing hoogte (Y-as) en breedte (X-as) in de cel poort getoond in AB. (E - F) Neuron poort logaritmische immunofluorescentie voor PE-gelabelde NeuN (Y-as) in de afzonderlijke cellen poort getoond in CD laat neuronen in de bovenste cluster van gebeurtenissen en niet-neuronale cellen in de onderste cluster. (G H) kernen kleuring: logaritmische grafiek van de fluorescentie voor DAPI-gelabelde kernen (Y-as) in de neuronale cel gate. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Gating van Fos-positieve en Fos-negatieve neuronen van verse en diepgevroren Rat dorsale striatum Op basis van dubbele etikettering voor Neun en Fos. De verse en diepgevroren dorsale striatum van ratten (rechtstreeks uit hun huis kooi of 90 min genomen na een enkele intraperitoneale injectie van methamfetamine) werden gedissocieerd en gelabeld met de direct geconjugeerde antilichamen tegen NeuN en Fos- en gesorteerd met behulp van een FACS-machine. Sortering was gebaseerd op fycoerytrine (PE) -gelabeld NeuN immunofluorescentie (X-as) en Alexa 647-gelabeld Fos immunofluocerend (Y-as). Fos-positieve (blauwe stippen) en fos-negatieve (rode stippen) neuronen in de bovenste en onderste rechter kwadrant respectievelijk. De dot plots tonen Neun-positieve cellen (neuronen) en Neun-negatieve cellen (grijze stippen); de blauwe vierkanten geven neuronen met boven-drempel Fos expressie. (A - B) groep Home: naïve ratten direct vanaf hun huis kooien gehouden. (C - D) Methamfetamine groep: ratten die enkele injecties van methamphetamine ontvangen. De drempels voor Fos-positieve neuronen werden geselecteerd om net boven de maximale Alexa-647 fluorescentie (Fos-IR) waargenomen voor Neun-negatieve cellen in de home control kooi groep. Terwijl 0,7-0,8% van alle neuronen Fos-positief in de hoofdgroep, 1,9-2,2% van alle neuronen Fos-positief in de methamphetamine groep.
Figuur 3. Cell-type specifieke genexpressie in FACS gesorteerde Cellen van verse en diepgevroren Rat Dorsale striatum. Neun-positieve neuronen (Fos-positieve en Fos-negatief) en Neun-negatieve cellen (Fos-positieve en Fos-negatief) zijn gesorteerd met het beschreven protocol en mRNA expressie van celtype specifieke genen werden gebruikt om celsortering bevestigen. (a) NeuN is een marker voor neuronale cellen. (B) GFAP is een merker voor glia cellen. (C) Oligo2 een merker voor oligodendrocyt cellen. (D) Iba1 is een merker voor microgliale cellen. Voor NeuN mRNA worden gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM vouw waarden ten opzichte expressieniveaus in NeuN-negatieve cellen uit de verse weefsel (n = 9-14). Voor GFAP (n = 6-12), Oligo2 (n = 9-11) en Iba1 (n = 5-8) mRNA, gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM vouw waarden ten opzichte expressieniveaus in NeuN-positieve cellen uit de verse weefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Fos mRNA niveaus in FACS-gesorteerd neuronen van vers of bevroren rat dorsale striatum na methamfetamine injectie. Fos-positieve en negatieve Fos-neuronen werden gesorteerd zoals beschreven in het protocol hierboven en mRNA niveaus van Fos bevestigd. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SEM vouw waarden ten opzichte expressieniveaus in Fos-negatieve neuronen van de verse weefsel (n = 3-4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FACS kan worden gebruikt om neuronen en andere celtypen uit verse of ingevroren volwassen hersenweefsel sorteren. Zoals vermeld in de inleiding, de mogelijkheid om bevroren weefsel te gebruiken maakt optimaal gebruik van monsters van dieren die complexe en langdurige gedrags- procedures, zoals zelf-administratie en terugval studies in de verslavingszorg onderzoek hebben ondergaan. Deze gedrags-procedures duurt meestal 1-2 uur of langer, en vereisen dat alle dieren (10 - 20 in totaal) worden getest op dezelfde dag 13,18. Het duurt ongeveer 4 uur tot 4 vers ontleed hersenweefsel monsters, die de hersenen dissectie, cel dissociatie, permeabilisatie en immunokleuring omvat verwerken. Na verwerking sortering elk monster door FACS duurt tussen 20 - 30 min. De laatste stap van het verwarmen van de gesorteerde cellen in lysisbuffer schrijft de 30 min. In totaal ~ 7 uur vereist van hersenen dissectie tot de uiteindelijke RNA-bevattende cel-lysis stap oplossing. Echter, is het nu mogelijk om hele brai bevriezenns of vers ontleed hersenen onmiddellijk na het testen, en later verwerken. Dit vereenvoudigt het testen en maakt verschillende hersengebieden worden gesorteerd op een andere dag. Bevriezen van het weefsel voorafgaand aan FACS kan ook de resultaten te verbeteren. Meer Neun-positieve neuronen worden verkregen uit bevroren weefselmonsters. Dit kan gedeeltelijk worden verklaard door een verhoogde NeuN-labeling door verstoring van celmembranen tijdens invriezen en vervolgens ontdooien, die toegang antilichaam tegen intracellulaire eiwitten zoals NeuN en Fos zou toenemen. Soortgelijke effecten zijn waargenomen met fibroblast, epitheelcellen en HeLa-cellen 19.
De opbrengst van cellen en neuronen kan worden gemaximaliseerd met behulp van de volgende stappen. Tijdens dissectie van het weefsel te verwijderen meeste witte stof (corpus callosum en anterieure commissuur het dorsale striatum en de nucleus accumbens, respectievelijk). Dit voorkomt dat weefsel van het naleven van de plastic uiteinden en glas pipetten in de daaropvolgende steps. Gebruik Buffer A (zie specificatie tabel van materialen en reagentia) om de ontleed weefsel bedekt te houden. Dit verbetert de kwaliteit van de cellen gedurende hakken van het weefsel met het scheermesblad (stap 2,5). De extra set van 3 aanwrijven stappen met de kleinste glazen pipet (stap 3.9) en de daaropvolgende filtering met een tweede set van de cel zeven (stap 5) verdubbelt de opbrengst van cellen en neuronen. Hergebruik van de cel zeven zal de filters en lagere opbrengst cel verstoppen. Wees voorzichtig met de cellen wanneer resuspenderen de pellets en tijdens aanwrijven. Het gebruik van een middelmatig grote pipetpunt tijdens deze stappen celbeschadiging door afschuifspanning verminderen. kijk voorzichtig de pellet bij het verwijderen van supernatant na permeabilisatie met ethanol (stap 4.4). De pellet minder compact en kunnen worden verdeeld over de wand van de microcentrifugebuis. Ruwe berekeningen blijkt dat de opbrengst van Fos-positieve neuronen ongeveer 10% van het uitgangsmateriaal getal in het striatale ontleed weefselmonster. Het huidige protocol kan worden aangepast om andere experimentele doeleinden geschikt. In het huidige protocol werd weefsels verzameld 90 minuten na injectie van methamfetamine omdat Fos expressie maximale niveaus in deze tijd, die belangrijk is voor effectieve sortering van Fos-expressie neuronen bereikt. Echter, kan weefsel worden verzameld op elk moment voor FACS, afhankelijk van het specifieke doel van het experiment. Voor de eerste weefselmonster opslag, hebben we met succes gebruikt vers ontleed weefsel, ingevroren weefsel na dissectie, of bevroren weefsel ontleed uit bevroren hele hersenen naar Fos expressie neuronen met behulp van FACS gevolgd door qPCR analyse van genexpressie te isoleren. Voor fixatie en permeabilisatie, de duur en de temperatuur van het protocol (4 * C gedurende 15 min) werd geoptimaliseerd om zowel cytoplasmische en nucleaire membranen doorlaatbaar, alsmede het weefsel vast. Variaties in duur en / of temperatuur kan de eindresultaten wijzigen. Andere fixatie oplossingen zoals paraformaldehyde en niet-ionische detergentia zoals saponine, die gewerkt embryonale en postnatale neuronen 20, mogelijk ook voor neuronen van volwassen hersenen. Bovendien kunnen myeline verwijderen kralen gebruikt worden als een variant van het huidige protocol zoals recent aangetoond voor FACS van hersenweefsel 21.
Het huidige protocol heeft twee belangrijke beperkingen te overwegen. Ten eerste is dit protocol niet geschikt voor het detecteren celfenotype merkers die voornamelijk tot expressie gebracht in synapsen (bijvoorbeeld dopamine of glutamaatreceptoren) omdat deze cellulaire processen van de cellichamen in de trituratie en dissociatie stappen verwijderd. Een tweede mogelijke beperking is dat de RNA lengten verkregen FACS gesorteerde cellen niet genoeg voor alle RNA analysemethoden kunnen worden. RNA integriteit nummers (RIN) voor RNA verkregen van FACS gesorteerde cellen tussen 2,5- 3,5, hetgeen overeenkomt met gemiddeld kortere RNA lengtes. Hier is de kortere RNA maat gecompenseerdmet relatief korte qPCR amplicons van 80-100 bp, zoals eerder beschreven 13-15. We hebben ook deze kortere RNA's met succes microarray analyse 11. Toch kunnen korte RNA lengten verkregen ongeschikt voor RNA- analyse methoden. Er zij op gewezen dat PCR primers die specifiek gericht exon-exon overgangen in het cytosol alleen volledig gesplitst mRNA gevonden werden. Deze primers niet detecteren-intron bevattende RNA van de kern. Verder hebben we het eerder gebruikte protocol met antilichamen en verse hersenweefsel tyrosine hydroxylase detecteren in het cytosol en D1 dopamine receptoren in het celmembraan 10. Detectie van deze cytosolische en celmembraan merkers aangegeven dat de dissociatie procedure produceert grotendeels intacte cellen, en niet alleen kernen.
Overall, FACS isoleren van neuronen uit bevroren monsters opent andere toepassingen. Geen verschillen in het sorteren of gen Expresie werden waargenomen (gegevens niet getoond) indien monsters 3 dagen en 3 weken werden bewaard bij -80 ºC. Drie weken een redelijke tijd om alle monsters van een bepaald experiment sorteren (20 - 40 monsters) en het isoleren van RNA genexpressie. Bruikbare RNA werd ook verkregen uit hersenweefsel opgeslagen gedurende 6 maanden bij -80 ° C (gegevens niet afgebeeld). Aldus zou dit protocol nuttig voor FACS isoleren postmortale ingevroren menselijke hersenen monsters die werden gedurende meerdere maanden of zelfs jaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
References
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
- Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
- Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
- Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R.
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
- Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
- Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
- US National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
- Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
- Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
- Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).
