Summary
Här presenterar vi en fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) protokoll för att studera molekylära förändringar i Fos-uttryckande neuronala ensembler från både färsk och fryst hjärnvävnad. Användningen av fryst vävnad kan FACS isolering av många områden i hjärnan över flera sessioner för att maximera användningen av värdefulla djur.
Abstract
Studiet av neuroplasticitet och molekylära förändringar i inlärda beteenden byter från studien av hela hjärnregioner till studiet av specifika uppsättningar av glest fördelade aktiverade neuroner som kallas neuronala ensembler som förmedlar inlärda associationer. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) har nyligen optimerats för vuxen råtta hjärnvävnad och tillät isolering av aktiverade neuroner med användning av antikroppar mot den neuronala markören Neun och Fos-protein, en markör av starkt aktiverade neuroner. Hittills har Fos-uttryckande nervceller och andra celltyper som isolerats från frisk vävnad, vilket innebar långa behandlingsdagar och får mycket begränsat antal av hjärnprover som ska bedömas efter långa och komplicerade beteende förfaranden. Här fann vi att utbyten av Fos-uttryckande neuroner och Fos-mRNA från dorsala striatum liknade mellan nyligen dissekeras vävnad och vävnad frystes vid -80 ° C under 3 - 21 dagar. Dessutom bekräftade vi fenotypenav NeuN-positiva och NeuN negativa sorterade celler genom att bedöma genexpression av neuronal (NeuN), astrocytisk (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) och microgial (Iba1) markörer, vilket tyder på att fryst vävnad också kan användas för FACS isolering av gliala celltyper. Totalt sett är det möjligt att samla in, analysera och frysa hjärnvävnad för flera FACS sessioner. Detta maximerar mängden data som erhållits från värdefulla djurindivider som ofta har genomgått långa och komplexa beteende förfaranden.
Introduction
Under inlärning, djur bilda föreningar mellan komplexa uppsättningar av mycket specifika stimuli. Denna höga upplösning informationen tros kodas av förändringar inom specifika mönster av glest fördelade nervceller kallade neuronala ensembler. Neuronala ensembler har nyligen identifierats genom induktion av omedelbart tidiga generna (IEGS) såsom Fos, Arc, och Zif268 och deras proteinprodukter i nervceller som var starkt aktiveras under uppförande eller cue exponering. Fos-uttryckande neuroner i synnerhet har visat sig spela kausala roller i sitt sammanhang och cue specifika inlärda beteenden 1-4. Således, unika molekylära neuroadaptations inom dessa aktiverade Fos-uttryckande nervceller är toppkandidater för neurala mekanismer som kodar lärt sammanslutningar under normala lärande och onormal inlärningsstörningar, såsom missbruk och posttraumatiskt stressyndrom (PTSD) 5.
Fluorescence aktiverad cellsortering (FACS) har nyligen tillåtit analys av unika molekylära neuroadaptations inom Fos-uttryckande neuroner. Flödescytometri och cellsortering utvecklades på 1960-talet 6,7 för att karakterisera och isolera celler enligt deras ljusspridande och immunofluorescenta egenskaper och har länge använts inom immunologi och cancerforskning. Dock flödescytometri och FACS kräver dissocierade enkla celler som är svåra att erhålla från adult hjärnvävnad. FACS användes först för att isolera och analysera grönt fluorescerande protein (GFP) uttryckande striatala neuroner från transgena möss som inte kräver märkning antikropp 8,9. Vi utvecklade ett antikroppsbaserad FACS-metoden 10 för att isolera och utvärdera molekylära förändringar i Fos-uttryckande nervceller aktiveras av läkemedel och / eller signaler i vild typ djur 11-15. I denna metod är neuroner märkta med en antikropp mot den allmänna neuronal markör Neun, medan kraftigt aktiverat nervcellerär märkta med en antikropp mot Fos. Även om våra initiala metod krävs sammanslagning av upp till 10 råttor per prov för färsk vävnad, senare ändringar i protokollet tillåts FACS isolering av Fos-uttryckande neuroner och kvantitativ Polymerase Chain Reaction (qPCR) analys av diskreta områden i hjärnan från en enda råtta 13-15 . Sammantaget var unika molekylära förändringar hittades i Fos-uttryckande nervceller aktiveras under en mängd av kontext- och cue-aktiverade beteenden i missbruk forskning 12,14,15.
En stor logistisk problem med att utföra FACS på färsk vävnad är att det tar en hel dag att dissociera vävnaden och processen genom FACS. Dessutom kan endast cirka fyra prover behandlas per dag. Detta innebär vanligtvis att endast en hjärna område kan bedömas från varje hjärna och de återstående hjärnområden måste kasseras. Detta är ett stort problem för låg genomströmning beteende procedurer såsom självadministrering och utrotning utbildning som kräver kirurgi och många veckors intensiv träning. Dessutom långa och komplicerade beteende förfaranden för testdag gör det svårt att utföra FACS på samma dag. Det skulle vara en stor fördel att kunna frysa hjärnor från djuren omedelbart efter beteendetestning, och sedan isolera Fos-uttryckande neuroner från ett eller flera områden i hjärnan vid olika tider på utredarnas val.
Här visar vi att vår FACS protokoll kan användas för att isolera Fos-uttryckande neuroner (och andra celltyper) från både färsk och frusen hjärnvävnad. Som ett exempel, vi isolerade Fos-uttryckande neuroner från råtta striatum efter akut metamfetamin injektioner och från naiva råttor utan injektioner (kontrolltillstånd). Detta kan dock FACS protokoll användas efter någon beteende eller farmakologisk behandling. Efterföljande qPCR analys av våra prover indikerade att genuttrycket från dessa celltyper skulle kunna bedömas med similar effektivitet från både färsk och fryst vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) av National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur 16.
Notera: Alla stegen nedan använda låga bindande centrifugrör som hölls på is om inte annat anges.
1. Förberedelse Innan Tissue Collection
- Ställ centrifugen till 4 ° C
- Brand polera en uppsättning av tre glaspasteurpipetter med minskande diametrar på cirka 1,3, 0,8, och 0,4 mm för varje prov.
- Framställa märkta 1,7 ml-rör innehållande 1 ml kall buffert A och hålla rören på is.
- Förbered en is fack som innehåller hjärnan skiva matris, spatlar och glasplattor (eller inverterad glas petriskål) som att utföra dissekering. Pre-chill två eller flera rakblad på glasplattor och använda vävnader papper att torka alla instrument som berör tproblem.
- Tina enzymlösningen vid rumstemperatur (RT) under 30 min innan vävnadssamling.
2. Tissue Collection och Dissection
- Initiera beteende eller farmakologisk behandling 90 minuter före vävnadssamling.
OBS: För de resultat som visas här, akuta intraperitoneala injektioner av 5 mg / kg metamfetamin på råttor i en ny miljö (testtillstånd) och naiva råttor hållna i deras hem burar (kontrollgrupp) utfördes. - Söva råttan genom att placera den i ett glas exsickator burk med mättad isofluran och decapitate råttan 30-60 sek senare med användning av en giljotin.
Använd sax för att ta bort hud och muskler från huvudet och exponera skallen. Använd rongeurs att skära skallen och öppna upp foramen magnum och ta bort den bakre delen av skallen. Använda rongeurs att skära längs de övre kanterna av skallen för att exponera hjärnan. Var noga med att inte skada hjärnan. Använd en liten spatel för att försiktigt skopa under end höja hjärnan. Höja hjärnan och skär nerverna tills hjärnan är fri 17. - Dissekera vävnad med hjälp av rakblad.
OBS: Skaffa vävnadsprover med någon av följande metoder: (2.3.1) nyligen dissekeras vävnad; (2.3.2) frusen vävnad efter dissektion; eller (2.3.3) fryst vävnad dissekerades från frysta hela hjärnan. Hålla hjärnan skivmatrisen, rakblad och glasskiva torr hela dissekering och mals processer som kondenserat vatten kan leda till hypoton lyse av celler. Använd förstoringsglas för att säkerställa korrekt dissekering.- För nyligen dissekerade vävnad, placera nyligen extraherade hjärnan i en hjärna skivmatris (en råtthjärna-formad metallform med slitsar för rakblad på 1 mm mellanrum) som har kylts på is. Infoga två eller flera för-kylda rakblad in i slitsarna för att skära koronala skivor som innehåller den hjärnregion (er) av intresse. Placera skär skiva på den kylda glasskiva.
Notera: Dissekera hjärnan regions av intresse på en kyld glasplatta. - För fryst vävnad efter dissektion, dissekera hjärnan region (s) av intresse från skivor av färsk extraherade hjärna, liknande det som beskrivits ovan i 2.3.1. Placera dissekerade vävnaden i ett mikrorör och snabbt frysa vävnaden genom nedsänkning av mikrorör i -40 ºC isopentan för 20 sek. Håll dissekerade vävnad fryst hela tiden i en -80 ° C frys tills vidare bearbetning.
- För fryst vävnad, omedelbart frysa nyligen extraherade hjärnan i -40 ºC isopentan och förvara i en förseglad påse vid -80 ° C i upp till 6 månader.
- På dagen för dissektion, placera frysta hjärnan i en kryostat inställd på ungefär -20 ° C (ingen varmare än -18 ° C) under ca 2 timmar att få samma temperatur.
OBS: Hjärnor kan lätt skäras vid denna temperatur, medan mycket svalare temperaturer gör hjärnan alltför spröda som skall skäras på ett säkert sätt. - Använd rakblad för att skära 1-2 mm koronala skivorde frusna hjärnor i en kryostat. Använd en trubbiga 12- till 16-nål för att erhålla vävnads slag från dessa skivor i noll. Håll dissekerade vävnad fryst hela tiden tills vidare bearbetning.
- På dagen för dissektion, placera frysta hjärnan i en kryostat inställd på ungefär -20 ° C (ingen varmare än -18 ° C) under ca 2 timmar att få samma temperatur.
- För nyligen dissekerade vävnad, placera nyligen extraherade hjärnan i en hjärna skivmatris (en råtthjärna-formad metallform med slitsar för rakblad på 1 mm mellanrum) som har kylts på is. Infoga två eller flera för-kylda rakblad in i slitsarna för att skära koronala skivor som innehåller den hjärnregion (er) av intresse. Placera skär skiva på den kylda glasskiva.
- Tillsätt 1 - 2 droppar buffert A för att täcka dissekerade vävnaden före malning. Avlägsna det mesta av den vita substansen från vävnaden med användning av två rakblad för att förhindra förlust av neuroner under resten av tritureringsprocessen. Om börjar med frusen vävnad, låt vävnaden att tina på den kalla glasskiva för högst en minut innan du använder buffert A lösning.
- Mala vävnaden 100 gånger i varje ortogonal riktning med ett rakblad på ett kylt glasplatta. Håll rakblad vinkelrätt mot glasskivan när malning.
OBS: Grundlig mals är avgörande för alla protokollsteg. - Använd rakblad att överföra malet vävnaden i mikrocentrifugrör innehållande 1 ml kall buffert A. Vänd röret 3 - 5 gånger för att keep alla malda vävnaden i lösningen.
3. Cell Dissociation
OBS: Använd mild ände över ände blandning under alla följande steg. Använd inte en vortexblandare och undvika luftbubblor som orsakar cellskador.
- Centrifugera provrören vid 110 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Släng supernatanten. Långsamt tillsätts 1 ml kallt färskt tinade Enzymlösning (innehållande en blandning av proteolytiska enzymer) ner den inre väggen av mikrorörs. Omedelbart suga upp hela pelleten och försiktigt pipettera upp och ner bara fyra gånger med en måttligt stor pipettspets diameter för att skingra malet vävnad.
- Invertera mikrorören omedelbart för att förhindra pelleten från fastnar i botten och inkubera proverna med end-over-end-blandning under 30 min vid 4 ° C
- Efter enzymatisk vävnad digestion, centrifugera rören vid 960 xg under 2 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och tillsätt 0,6 ml kall buffert A. Immediately efter tillsats av buffert A, använda samma pipettspets att skingra pelleten genom att suga upp hela pelleten och försiktigt pipettera upp och ned 5 gånger.
- Mekaniskt mal sönder rötas vävnad och samla in 15 ml rör med hjälp av följande steg. För varje prov, använda en separat uppsättning av 3 brand-polerat glas Pasteur pipetter med fallande diametrar av ungefär 1,3, 0,8 och 0,4 mm kopplade till latex glödlampor.
- finfördela försiktigt varje prov 10 gånger med 1,3 mm glaspipett. Låt provet nöja 2 min på is (skräp och icke dissocierade celler kommer att avgöra till botten). Samla supernatanten (~ 0,6 ml) och överför till en 15 ml koniskt rör (rör # 1).
- Lägga 0,6 ml buffert En lösning till den återstående pelleten. Finfördela provet 10 gånger med 0,8 mm glaspipett. Låt provet nöja två minuter på is. Samla supernatanten (~ 0,6 ml) och överföring till samma 15 ml koniska rör # 1.
- Lägga 0,6 ml buffert En lösning till den återstående pellet. Finfördela provet 10 gånger med 0,4 mm glaspipett. Låt provet nöja två minuter på is. Samla supernatanten (~ 0,6 ml, utan att röra pelleten med icke-differentierade celler) och överför till samma 15 ml koniska rör # 1.
OBS: Håll pipetten 0,4 mm diameter i röret # 1 för följande finfördelning steg. - Upprepa steg 3.4.3 tre gånger med minsta glaspipett (~ 0,4 mm i diameter), och samla supernatanten till en separat 15 ml koniskt rör (rör # 2).
- Finfördela de insamlade cellsuspensioner i rör # 1 och # 2 för ytterligare 10 gånger med 0,4 mm glaspipett och hålla på is.
4. Cell Fixering och Permeabilization
- Förbered 4 mikrorör per prov (två mikrorör för celler från röret # 1 och två för celler från röret # 2) genom att tillsätta 800 pl av 100% kall etanol (förvaras vid -20 ° C före användning) till varje rör och hålla dem på is . Obs: Den slutliga etanolkoncentrationen kommer att vara 50%.
- Pipettera ~ 800 | il av cellsuspensionerna (från röret # 1 och röret # 2) i var och en av de 4 rören innehållande kall etanol och invertera rören för att blanda proverna.
- Inkubera rören på is under 15 min medan vända rören varje 5 min.
- Efter fixering / permeabilization, centrifugera rören vid 1700 xg under 4 min vid 4 ° C och kassera supernatanten. Lämna 50 pl lösning för att förhindra cellförlust.
OBS! Pellets på detta stadium är vita och hålla mindre på väggen av rören än tidigare permeabilization. Därför avlägsna supernatanten noggrant genom att trycka på väggen i mikrorör där det inte finns någon pellet och upprätta supernatanten långsamt med hjälp av en mikropipett.
5. Cell Filtrering
- Åter suspendera pellets från steg 4,4 med kall PBS enligt följande:
- Lägg 550 | il kall PBS till en av de två mikrorör som kommer från röret # 1, och använda en pi måttligt stor diameterPette tips till försiktigt pipett cellsuspensionen upp och ner 5 gånger. Upprepa samma sak för ett mikrorör som kommer från röret # 2.
- För celler från röret # 1, med användning av samma pipett, överför första cellsuspension till den andra pelleten. Resuspendera den andra pelleten genom att försiktigt pipettera den kombinerade cellsuspensionen upp och ner 5 gånger.
- För celler från röret # 2, resuspendera och kombinera pellets (dvs. tredje och fjärde mikrorör) som beskrivs i 5.1.2.
- Filtrera de två cellsuspensioner från steg 5.1.2 och 5.1.3 separat med två olika par av cell silar (100 um och 40 um porstorlek) enligt följande:
- Pre-våt varje cell sil genom att lägga till PBS till insidan av silen. Använd en pipett för att ta bort överskott PBS från utsidan av silen.
- Pipett cellsuspensionen från steg 5.1.2 jämnt på den första cellen sil med 100 ^ m porstorlek. Samla genomflödet i en 50 ml rör på is. Använd piPette för uppsamling av flödes- genom fäst på den yttre sidan botten av cellen silen.
- Använd samma pipett för att överföra genomströmning från 100 | j, m cellfilter till 40 | im cellfilter. Samla in denna genomströmning i en annan 50 ml rör på is. Vid överföring flödet genom från 40 ìm cell sil, byt till nya pipettspetsar för att undvika kontaminering från 100 ìm cell sil.
- Upprepa stegen för cellsuspensionen från steg 5.1.3 med hjälp av en ny uppsättning av filter.
- Kombinera de två genomflöde från varje prov för en slutlig volym av ca 1 ml per prov.
6. Inkubation med Antikroppar
OBS: Använd små portioner av hjärnan cellsuspensioner att förbereda flera kontrollprover för att fastställa lämplig flödescytometer inställningar innan du kör huvud provet. För varje antikroppsmärkning, förbereda kontrollprover som inte innehåller några antikroppar, bara för sigcondary antikropp (eller annan fluorescerande märkning), och sedan både primära och sekundära antikroppar (eller andra fluorescerande märkning). Använd dessa kontroller för att ställa portarna som skiljer specifik kontra icke-specifik märkning i flödescytometern. När det är möjligt, använda fluorokromer som inte kräver ersättning. Öka den slutliga volymen av de grindkontrollprover till en slutlig volym av 700 | j, l genom tillsats av PBS före tillsats av primära antikroppar.
- Förbered ljusspridande och DAPI kontrollprov genom att överföra en 100 pl prov av de filtrerade cellerna till en 1,7 ml mikrorör. Tillsätt 600 | il kall PBS med 1 | ig / ml DAPI för kärnor färgning. Inkubera i 10 minuter med end-over-end blandning, och tvätta (som anges i steg 6.4.2 till 6.4.5) innan det passerar genom flödescytometern.
OBS: Detta prov används endast för att ställa in cell / kärnor gate före sortering de återstående cellerna i FACS maskinen. - Förbered enstaka immunolabeled kontrollprov genom att överföra 100 & #181; l de filtrerade cellerna till en 1,7 ml mikrorör. Lägg 600 pl kall PBS med en antikropp (t.ex. Neun antikropp). Lägg 600 pl kall PBS till ett mikrorör med en annan antikropp (t.ex. Fos antikropp). Lägga till motsvarande sekundära antikroppen om det inte är ett direkt-konjugerad primär antikropp.
OBS: Dessa prover användes för att bestämma den lämpliga fotomultiplikatorrör (PMT) spänning, och för att bedöma överlappningen av de två fluorescerande signaler vid behov. Antikropps koncentrationer bör titreras för att uppnå bästa signal-brusförhållanden i alla kanaler. Överlappande fluorescerande signaler kan också kompenseras genom intern kalibrering av olika fluorescerande kanaler inom flödescytometern. - Förbereda dubbel fluorescensmärkt negativa kontrollprovet genom att överföra 100 | il av de filtrerade cellerna till ett 1,7 ml mikrorör. Lägg 600 pl kall PBS med enbart de sekundära antikroppar eller IgG direkt konjugerade primära antikroppar.
OBS: Thiprov s kontroll kan användas varje gång före sortering för att fastställa bakgrundsfluorescensen för varje fluoroforen. - Förbered huvud prov som ska sorteras.
- Överför 700 | il av de filtrerade cellerna i en 1,7 ml mikrorör. Lägga 7 il (1: 100) av primär Fos-antikropp konjugerad direkt till Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) och 1,4 | j, l (1: 500) av primär NeuN antikropp konjugerad direkt till fykoerytrin (anti-NeuN-PE). Inkubera rören i 30 minuter vid 4 ° C med end-over-end blandning.
- Vid slutet av inkubationen, till 800 | il kall PBS till varje mikrorör, inklusive huvud provet och kontrollproverna, och blanda genom inversion.
- Centrifugera mikrorör vid 1300 xg under 3 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten, vilket lämnar 50 pl supernatant för att förhindra cellförlust.
- Tillsätt 1 ml kall PBS till pelleten och återsuspendera cellerna med användning av en pipett med en måttligt stor spetsdiameter.
- Centrifugera vid 1300 xg under 3 min vid 4 ° C. Discard supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 500 l kall PBS (justera slutvolymen beroende på storleken av pelleten).
- Överföring och filtrera suspensionen i en rundbottnad FACS provröret med en cellfilterlocket (40 | j, m). Håll immunolabeled cellerna på is och omedelbart utföra FACS. Obs! För filtrering trycker pipettspetsen vertikalt på filterlocket och tryck cellsuspensionen genom den.
- Ställ flödescytometer grindar med hjälp av kontrollprover.
- Använd ljusspridande och DAPI kontrollprov för att identifiera den neuronala cellpopulationen från de totala händelser och cellrester.
OBS: Cellkroppar i denna beredning är endast 1 - 2% av det totala antalet händelser (resten är skräp och brutna cellulära processer). Baserat på DAPI fluorescerande signal (som indikerar kärnor) och Forward Scatter (cellens storlek) är det möjligt att lokalisera cellkroppar och grind bakåt baseras på framåt- och sidoljusspridande egenskapercellerna (såsom visas i figur 1 A, B). - Använda de enskilda immunolabeled kontrollprover för att bestämma inställningarna för PMT spänning, och att analysera spridningseffekter av emission från en specifik fluorokrom till en annan filter / kanal (t.ex. Alexa Fluor 488 / FITC eller Phycoerythrine). Om fluorescerande signaler överlappar varandra, korrigera överlappningen genom att justera ersättningsnivåer manuellt.
- Använd dubbla fluorescensmärkt negativ kontroll för att ställa in tröskelvärdet för den positiva populationen.
OBS: Den signal som kommer från detta prov tros bero på auto-fluorescens och cellerna av den huvudsakliga provet ligger över denna tröskel kan betraktas som positiva. Typiskt tröskelparametrarna för sortering är strängare och ungefär topp 2/3 av de märkta cellerna ovanför den negativa kontrollen faktiskt sortering.
- Använd ljusspridande och DAPI kontrollprov för att identifiera den neuronala cellpopulationen från de totala händelser och cellrester.
- Sortera nervceller från huvud provet genom FACS till 1,7 ml mikrorör. Samla upp cellerna i 50 | il av RNAextraktionsbuffert. Efter sortering, virvel och centrifugera röret och blanda suspensionen genom att pipettera upp och ner 10 gånger för att återställa alla sorterade cellerna från väggarna i röret.
- Inkubera den sorterade cellsuspension vid 42 ° C under 30 minuter för att säkerställa att alla celler lyseras före RNA-extraktion, och centrifugera sedan vid 2.800 xg under 2 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till en RNas-fri rör för långtidslagring vid -80 ° C eller omedelbart behandla provet för RNA-isolering, cDNA-syntes, målgenen pre-amplifiering och qPCR, såsom beskrivits tidigare 13-15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sortering Fos-positiva och Fos-negativa neuroner från färsk och fryst rygg striatum vävnad från enskilda råttor efter akut metamfetamin injektioner.
Protokollet som beskrivs ovan användes för att sortera Fos-positiva och Fos-negativa neuroner från en enda råtta dorsala striatum 90 min efter en intraperitoneal injektion av metamfetamin (5 mg / kg). Naiva råttor i sina hemmaburar användes som kontroller. Rygg striatum vävnad bearbetades antingen omedelbart efter sin samling (färsk vävnad) eller bearbetas efter att frysas och lagras i -80 ° C för 1, 7 eller 21 dagar. Resultaten från dessa frysning tidpunkter var inte signifikant olika från varandra, så att data poolades.
Att ställa in sorterings förhållandena på instrumentet, kontrollprover (som beskrivits ovan) från antingen buren kontroll eller methamphetaminor injicerade grupper användes. När varje partikel eller händelse i dessa prover passerar genom flödescellen i cytometern, får de ett identifikationsnummer som är associerat med evenemangets ljusspridning och fluorescensegenskaper och registreras i ett kalkylblad. Händelserna i detta blad kan sedan organiseras i spridningsdiagram eller täthets tomter för dessa egenskaper (Figur 1). Händelser med liknande egenskaper kan sedan grupperas eller "gated" av olika par av egenskaper för att bestämma grindarna såsom de som innehåller celler, neuroner, eller Fos-positiva neuroner. När grindarna bestäms med användning av de kontrollprover beskrivna ovan, är det huvudsakliga provet injicerades i flödescytometern och sorterade enligt dessa grindar. Cellpopulationen var gated från alla händelser (celler och skräp) baserat på deras framåtljusspridning (FSC, en indikation på partikelns storlek) och sidoljusspridning (SSC, en indikation på partikelns granularity). Såsom visas i den FSC kontra SSC-plotten (Figur 1A och 1B), tätheten tomt på alla de händelser avslöjar en liten homogen population med liknande storlek och granularitet, förutom en stor heterogen population (Figur 1A och 1B). En liten homogen population som innehåller cellkroppar identifierades och gated som "celler", som bygger på FSC och SSC egenskaper från tidigare studier 11,13-15 och märkning med DAPI. En något högre andel av celler erhölls från frusen vävnad (2,6%) än från färsk vävnad (1,9%). Den stora heterogena populationen är mestadels skräp, förmodligen från dendriter och axonala processer.
Därefter enstaka celler från "Celler" gate var identifieras baserat på deras storlek, vilket indikeras av bredden på FSC-signalen för varje händelse på x-axeln. Händelser som var större än enskilda celler ansågs cellaggregat och undantas från "Single cell grind. Alla de efterföljande analysstegen utfördes inom denna" Single cell "gate (Figur 1C och 1D). Majoriteten av denna enda cell population (> 92%) var positiva för DAPI färgning (data visad).
Först var neuroner identifieras baserat på deras PE fluorescensintensiteten som anges Neun-immunreaktivitet (figur 1E och 1F). Nervceller omfattade cirka 24% av alla händelser från "Single cell" gate för frisk vävnad och 38% för fryst vävnad. Nästan alla av händelserna i denna "Neuron" gate (98% i färsk vävnad och 99% i fryst vävnad) var positiva för DAPI färgning av DNA i cellkärnan (Figur 1G och 1H). De återstående DAPI-märkta händelser på den inre cellgrinden är Neun-negativa och inkluderar glia, oligodendrocyter och mikroglia, vilket bekräftas av qPCR i figur 3.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Sedan neuroner klassificerades som Fos-positiv eller Fos-negativa nervceller baserat på deras Alexa Fluor 647 fluorescens signal (Fos-immunreaktivitet) Till skillnad från celltyp markörer, Fos. uttrycksnivåer i neuroner ökar gradvis på grund av olika nivåer av nervaktivitet och tidsförloppet. Därför kommer det inte att vara en entydig tröskel mellan Fos-positiva kontra Fos-negativa nervceller. i det första steget (används endast för off-line analyser procenträkning av Fos-positiva neuroner), definierade vi tröskeln för Fos-positiva neuroner baserade på högsta Alexa-647 fluorescens (för Fos) från Neun-negativa befolkningen i de naiva hem bur kontrollråttor. Fos-positiva neuroner indikeras i blå rutor från olika experimentella betingelser i figur 2 i både färska och frysta vävnader, de procentuella Fos-positiva neuroner från metamfetamin-injicerade råttor. (1,9-2,2%, figur 2C och 2D) var dubbelt så compared hem bur råttor (0,7-0,8%, Figur 2A och 2B).Bekräftar cell-typspecifika gener från FACS-sorterade celler med användning av målgenen pre-amplifiering och RT-PCR.
I det andra steget, för att säkerställa sortering av endast Fos-positiva neuroner från huvud provet för efterföljande mRNA analyser och minska införandet av Fos-negativa celler, fluorescens tröskel Alexa-647 höjs så att endast de övre två tredjedelar av Fos -positiva händelser i blå rutor sorterades och samlas. Denna tröskel har åtminstone 10 gånger högre fluorescens (högre Fos expression per cell) än tröskelvärdet som används ovan för att beräkna procentandelen av Fos-positiva neuroner i proven. Fyra populationer av celler sorterades från en enda vävnadsprov, inklusive Neun-negativa + Fos-negativa (~ 5000 händelser), Neun-negativa + Fos-positiva (varierade 25 - 83 händelser), Neun-positiva + Fos-negtivt (~ 5000 händelser) och Neun-positiva + Fos-positiva (varierade 44 - 133 händelser för hemgruppen, 185 - 450 händelser för Metamfetamin gruppen). Först uttrycket av celltyp specifika gener i Neun-positiva (både Fos-positiva och Fos-negativa) och Neun-negativ befolknings (både Fos-positiva och Fos-negativ) bekräftas (Figur 3). GAPDH var används som referens / housekeepinggen, baserat på resultat från vår tidigare studie 13. För att kontrollera för olika nivåer av RNA i provet och cDNA i PCR-reaktionerna var duplex qPCR reaktioner utfördes med användning av primers för både målgenen och GAPDH cDNA. Ct-värdena för housekeepinggen GAPDH hölls mellan 15 och 31 för noggranna mätningar. För både färsk och fryst vävnad, Neun mRNA-nivåer var signifikant större (ca 8-faldigt) i Neun-positiva befolkningen än i Neun-negativa populationen (p <0,05; figur 3A GFAP (glial cellmarkör, figur 3B) och Oligo2 (oligodendrocyt cellmarkör, Figur 3C) mRNA-nivåer var större i Neun-negativ befolknings än i Neun-positiva populationen (p <0,05 ). En liknande trend med högre Iba1 (microglial cellmarkör, figur 3D) mRNA-nivåer observerades i Neun-negativ befolknings, men detta var inte statistiskt signifikant. Några prover innehöll extremt låga nivåer av vissa mRNA som inte kunde mätas med exakthet i en viss celltyp (t.ex., GFAP mRNA i Neun-märkta neuroner). Maximala Ct-värden definierades som 35 för att eliminera värden som var för låg för att detekteras noggrant. Högre Ct-värden översteg konfidensintervallet i våra qPCR analyser.
Fos-mRNA-uttryck varundersöktes i Neun-positiva neuronala befolkningen från råttor som fick en enda injektion av metamfetamin (Figur 4). För både färsk och frusen vävnad, Fos-mRNA-nivåer var större i de Fos-positiva neuroner än i Fos-negativa neuroner (p <0,05). Dessutom, även om det fanns en 3-faldig ökning av Fos-mRNA i Fos-positiva neuron från färsk vävnad, en 11-faldig ökning av Fos-mRNA i Fos-positiva neuron från fryst vävnad detekterades. Sammantaget ger dessa mRNA resultat bekräftar identiteten av Fos-positiva neuroner, Fos-negativa neuroner och icke-neuronal population från både färsk och fryst vävnad. Dessutom kan cell typspecifika gener och andra gener av intresse även analyseras ur sorterade celler under både färska och frysta förhållanden.
Figur 1. Gating av Distressebolag och märkta celler från färsk och fryst Rat Rygg striatum. Den "Cells gate bestämdes genom framåt- och sidospridningsegenskaper (AD) och bekräftas av en positiv märkning med kärn DAPI färgning (GH). Den "Nervceller" gate inom "Cells befolkning bestämdes genom fluorescens för Neun (PE, EF). (A - B) Cell gate: Linjär tomt på alla händelser, baserat på deras framåtspridning (X-axeln, cellstorlek) och sidospridning (Y-axeln, kornighet). (C - D) Single celler gate: Linjär tomt på Forward Scatter höjd (Y-axeln) och bredden (X-axeln) i cellen gate visas i AB. (E - F) Neuron gate: Logaritmisk tomt på immunofluorescens för PE-märkt Neun (Y-axeln) i enskilda celler gate visas i CD avslöjar nervceller i övre kluster av händelser och icke-neuronala celler i nedre klustret. (G H) Nuclei färgning: Logaritmisk tomt av fluorescens för DAPI-märkta kärnor (Y-axeln) i den neuronala cellgrinden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Gating av Fos-positiva och Fos-negativa nervceller från färsk och fryst Rat Rygg striatum Baserat på dubbel märkning för Neun och Fos. Den färska och frysta rygg striatum från råttor (tagen direkt från sitt hem bur eller 90 minuter efter en enda intraperitoneal injektion av metamfetamin) dissocierades och märkta med direkt konjugerade antikroppar mot Neun och Fos och sorteras med hjälp av en FACS maskin. Sortering baserades på fykoerytrin (PE) -märkt NeuN immunofluorescens (X-axeln) och Alexa 647-märkt Fos immunofluorescence (Y-axeln). Fos-positiva (blå prickar) och Fos-negativa (röda prickar) neuroner belägna i de övre och nedre högra kvadranter, respektive. De punktdiagram visar Neun-positiva celler (neuroner) och Neun-negativa celler (grå prickar); de blå rutorna indikerar nervceller med ovan tröskeln Fos uttryck. (A - B) Hemgrupp: naiva råttor som tagits direkt från sina hem burar. (C - D) Metamfetamin grupp: råttor som fick enstaka injektioner av metamfetamin. Tröskelvärdena för Fos-positiva neuroner valdes för att vara precis ovanför maximal Alexa-647 fluorescens (Fos-IR) observerades för Neun-negativa celler i hemmaburen kontrollgruppen. Medan 0,7-0,8% av alla nervceller är Fos-positiva i hemgruppen, 1,9-2,2% av alla nervceller är Fos-positiva i metamfetamin grupp.
Figur 3. Cell-typspecifika genuttryck i FACS-sorterade celler från färsk och fryst Rat Dorsal striatum. Neun-positiva neuroner (Fos-positiva och Fos-negativa) och Neun-negativa celler (Fos-positiva och Fos-negativa) sorterades användning av den beskrivna protokollet och mRNA-expressionsnivåer av celltyp specifika gener användes för att bekräfta cellsortering. (A) NeuN är en markör för neuronala celler. (B) GFAP är en markör för gliaceller. (C) Oligo2 är en markör för oligodendrocytceller. (D) Iba1 är en markör för mikrogliaceller. För NeuN mRNA, är data som presenteras som medelvärde ± SEM av faldiga värden i förhållande till expressionsnivåer i NeuN-negativa celler från färsk vävnad (n = 9 - 14). För GFAP (n = 6-12), Oligo2 (n = 9-11) och Iba1 (n = 5-8) mRNA, Data presenteras som medel ± SEM av faldiga värden i förhållande till expressionsnivåer i NeuN-positiva celler från färsk vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Fos mRNA-nivåer i FACS-sorterade nervceller från färska eller frysta Rat Rygg striatum efter Metamfetamin Injection. Fos-positiva och Fos-negativa neuroner sorteras som beskrivs i protokollet ovan och mRNA-nivåer av Fos bekräftades. Data presenteras som medelvärde ± SEM av faldiga värden i förhållande till expressionsnivåer i Fos-negativa neuroner från färsk vävnad (n = 3 - 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FACS kan användas för att sortera neuroner och andra celltyper från antingen färska eller frysta vuxen hjärnvävnad. Som nämndes i inledningen, möjligheten att använda fryst vävnad medger optimalt utnyttjande av prover från djur som har genomgått komplicerade och långdragna beteende förfaranden, såsom själv administration och återfalls studier i beroendeforskning. Dessa beteende förfaranden tar vanligtvis 1-2 h eller längre, och kräver att alla djur (10-20 totalt) testas på samma dag 13,18. Det tar ~ 4 timmar för att bearbeta 4 nyligen dissekerade hjärnvävnadsprover, som inkluderar hjärnan dissektion, cell dissociation, permeabilisering och immunmärkning. Efter bearbetning, sortering varje prov genom FACS tar mellan 20-30 minuter. Det sista steget av upphettning av de sorterade cellerna i lysbuffert kräver att ett annat 30 min. Totalt ~ 7 h krävs från hjärnan dissekering för att den slutliga RNA-innehållande cell-lyslösning steget. Emellertid är det nu möjligt att frysa hela brains eller nyligen dissekerade hjärnregioner omedelbart efter provning och bearbeta dem senare. Detta förenklar testning och tillåter multipla hjärnområden som skall sorteras på en annan dag. Frysning av vävnaden före FACS kan också förbättra resultaten. Mer Neun-positiva neuroner erhålls från frysta vävnadsprover. Detta kan delvis förklaras av ökad Neun-märkningen på grund av avbrott i cellmembranen under frysning och efterföljande upptining, vilket skulle öka antikropps tillgång till intracellulära proteiner såsom Neun och Fos. Liknande effekter har observerats med fibroblaster, epitelceller och HeLa-celler 19.
Utbytet av celler och neuroner kan maximeras med hjälp av följande steg. Under dissektion av vävnaden, ta bort majoriteten av vit substans (corpus callosum och tvärförbindelser i hjärnan för rygg striatum och nucleus accumbens, respektive). Detta hindrar vävnad från att fastna i plast tips och glaspipetter i efterföljande steps. Använd buffert A (se specifikation i Tabell över Material och reagens) för att hålla dissekeras vävnaden täckt. Detta förbättrar kvaliteten på celler under malning av vävnaden med rakbladet (steg 2,5). Den extra uppsättning av 3 triturering steg med den minsta glaspipett (steg 3,9) och efterföljande filtrering med en andra uppsättning av cell silar (steg 5) dubblerar utbytet av celler och neuroner. Återanvändning cell silar kommer täppa till filter och lägre cellutbyte. Var försiktig med cellerna när återsuspendering av pellets och under rivning. Användningen av ett måttligt stort pipettspets under dessa steg kommer att minska cellskador på grund av skjuvspänning. titta noga pelleten när du tar bort supernatanten efter permeabilisering med etanol (steg 4,4). Pelleten är mindre kompakt och kan distribueras längs väggen av den mikrocentrifugrör. Grova beräkningar antyder att utbytet av Fos-positiva neuron är cirka 10% av utgångsnumret i dissekerade striatala vävnadsprovet. Det nuvarande protokollet kan modifieras för att passa andra experimentella syften. I det nuvarande protokollet, var vävnaden samlas 90 minuter efter metamfetamin injektioner eftersom Fos uttryck når maximala nivåer vid denna tidpunkt, vilket är avgörande för effektiv sortering av Fos-uttryckande neuroner. Emellertid kan vävnad samlas vid någon tidpunkt för FACS, beroende på det specifika syftet av experimentet. För första vävnadsprov lagring, har vi framgångsrikt använt nyligen dissekeras vävnad, frusen vävnad efter dissektion, eller frusen vävnad dissekeras från frysta hela hjärnan för att isolera Fos-uttryckande nervceller med hjälp av FACS följt av qPCR analys av genuttryck. För fixering och permeabilization, varaktighet och temperaturen i detta protokoll (4 ° C under 15 min) optimerad för att permeabilisera både cytoplasmiska och nukleära membran, samt att fixera vävnaden. Variationer i varaktigheten och / eller temperatur kan ändra de slutliga resultaten. Andra fixeringslösningar såsom paraformaldehyde och icke-joniska detergenter såsom saponin, som har arbetat för embryonala och postnatal neuroner 20, kan också fungera för nervceller från vuxna hjärnan. Dessutom kan myelin borttagning pärlor kan användas som en modifikation av det nuvarande protokollet som visas nyligen för FACS från hjärnvävnad 21.
Det nuvarande protokollet har två viktiga begränsningar att tänka på. För det första är detta protokoll inte lämpad för detektering av cellfenotyp markörer som primärt uttrycks i synapserna (t.ex., dopamin eller glutamatreceptorer) eftersom dessa cellulära processer avlägsnas från cellkroppar under finfördelning och dissociation steg. En andra möjlig begränsning är att RNA-längder som erhålls från FACS-sorterade celler inte kan vara tillräckligt för alla RNA analysmetoder. RNA integritet nummer (RIN) för RNA som erhållits från FACS sorterade celler är mellan 2,5- 3,5, vilket motsvarar kortare genomsnittlig RNA längder. Här var kortare RNA storlek kompenseras genommed användning av relativt korta qPCR amplikoner av 80-100 bp, som beskrivits tidigare 13-15. Vi har också använt dessa kortare längd RNA framgångsrikt för microarray analys 11. Trots detta kan korta RNA-längder som erhålls vara olämpliga för alla RNA analysmetoder. Det bör understrykas att PCR-primers som specifikt riktade exon-exon korsningar som bara finns i fullt splitsat mRNA i cytosolen användes. Dessa primrar inte detektera intron-innehållande RNA från kärnan. Dessutom har vi tidigare använt detta protokoll med antikroppar och färsk hjärnvävnad för att detektera tyrosinhydroxylas i cytosolen och D1 dopaminreceptorer i cellmembranet 10. Upptäckt av dessa cytosoliska och cellmembranmarkörer indikerade att dissociation proceduren producerar i stort sett intakta celler, och inte bara kärnor.
Sammantaget FACS isolering av nervceller från frysta prover öppnar upp andra program. Inga skillnader i sortering eller gen expression observerades (data ej visade) när prover lagrades 3 dagar eller 3 veckor vid -80 ºC. Tre veckor är en rimlig tid för att sortera alla prover från en specifik experiment (20 - 40 prover) och isolera RNA för genuttryck. Användbar RNA har också erhållits från hjärnvävnad lagras i 6 månader vid -80 ° C (data ej visade här). Således kan detta protokoll vara användbara för FACS isolering av post mortem-frusna humana hjärnprover som lagrades under flera månader eller år.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
References
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
- Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
- Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
- Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R.
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
- Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
- Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
- US National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
- Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
- Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
- Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).
