Summary
Qui vi presentiamo una Sorting (FACS) protocollo Fluorescence Activated cellulare per studiare le alterazioni molecolari a Fos-esprimendo ensemble neuronali dal tessuto cerebrale sia freschi che surgelati. L'uso di tessuti congelati permette FACS isolamento di molte aree cerebrali in più sessioni per massimizzare l'uso di soggetti animali preziosi.
Abstract
Lo studio della neuroplasticità e alterazioni molecolari in comportamenti appresi sta passando dallo studio di regioni cerebrali intere allo studio di specifici gruppi di neuroni attivati scarsamente distribuiti chiamati complessi neuronali che mediano imparato associazioni. La fluorescenza delle cellule Attivato ordinamento (FACS) è stato recentemente ottimizzato per tessuti adulti cervello di ratto e ha permesso l'isolamento dei neuroni attivati utilizzando anticorpi contro il marcatore neuronale NeuN e proteine Fos, un marker di neuroni fortemente attivati. Fino ad ora, i neuroni Fos-esprimere e altri tipi di cellule sono state isolate dal tessuto fresco, che ha comportato lunghi giorni di lavorazione e consentite un numero molto limitato di campioni di cervello per essere valutati dopo le procedure comportamentali lunghe e complesse. Qui abbiamo trovato che i rendimenti di Fos-esprimendo neuroni e Fos mRNA da dorsale striato sono stati simili tra tessuto fresco sezionato e tessuti congelati a -80 ° C per 3 - 21 giorni. Inoltre, abbiamo confermato il fenotipodelle cellule NeuN-positivi e NeuN-negativi ordinate per valutare l'espressione genica di neuronale (NeuN), astrociti (GFAP), oligodendrocitario (Oligo2) e microgial marcatori (Iba1), il che indica che il tessuto congelato può essere utilizzato anche per FACS isolamento tipi di cellule gliali. In generale, è possibile raccogliere, analizzare e congelare il tessuto cerebrale per le sessioni multiple FACS. Questo massimizza la quantità di dati ottenuti da soggetti animali importanti che sono spesso sottoposti a procedure comportamentali lunghe e complesse.
Introduction
Durante l'apprendimento, gli animali formano associazioni tra insiemi complessi di stimoli altamente specifici. Queste informazioni ad alta risoluzione è pensato per essere codificato da alterazioni all'interno di modelli specifici di neuroni scarsamente distribuiti chiamati complessi neuronali. Ensemble neuronali sono stati recentemente identificati dalla induzione di immediatamente primi geni (IEGs) come Fos, Arco, e Zif268 e dei loro prodotti proteici nei neuroni che sono stati fortemente attivati durante il comportamento o l'esposizione stecca. Fos-esprimendo neuroni, in particolare, hanno dimostrato di giocare un ruolo causale nel contesto e comportamenti appresi 1-4 specifici stecca. Così, neuroadaptations molecolari unici all'interno di questi neuroni Fos-esprimono attivati sono migliori candidati per i meccanismi neurali che codificano apprese le associazioni costituite durante il normale disturbi di apprendimento e di formazione anomala, come la dipendenza e disturbi da stress post-traumatico (PTSD) 5.
Fluorescence attivato cell sorting (FACS) ha recentemente permesso l'analisi di neuroadaptations molecolari unici all'interno dei neuroni Fos-esprimono. Citometria a flusso e cell sorting sono stati sviluppati nel 1960 6,7 per caratterizzare e isolare le cellule in base alle loro caratteristiche di luce-dispersione e immunofluorescenza, e sono da tempo utilizzati in immunologia e la ricerca sul cancro. Tuttavia citometria a flusso e FACS richiede singole cellule dissociate che sono difficili da ottenere da tessuto cerebrale adulta. FACS è stato usato per la prima per isolare e analizzare Green Fluorescent Protein (GFP) esprimente neuroni striatali dei topi transgenici che non richiedono l'etichettatura degli anticorpi 8,9. Abbiamo sviluppato un metodo FACS a base di anticorpi 10 per isolare e valutare le alterazioni molecolari a Fos-esprimendo neuroni attivati da farmaci e / o spunti in animali wild-type 11-15. In questo metodo, i neuroni sono etichettati con un anticorpo contro il marcatore neuronale generale NeuN, mentre i neuroni iperattivazionesono etichettati con un anticorpo contro Fos. Anche se il nostro metodo iniziale richiesto messa in comune di un massimo di 10 ratti per campione di tessuto fresco, successive modifiche del protocollo ha permesso FACS isolamento di Fos-esprimendo neuroni e della polimerasi quantitativa Chain Reaction (qPCR) analisi delle aree cerebrali distinte da un singolo topo 13-15 . Nel complesso, alterazioni molecolari unici sono stati trovati in Fos-esprimendo neuroni attivati nel corso di una serie di comportamenti al contesto e cue-attivati nella ricerca dipendenza 12,14,15.
Un importante problema logistico con l'esecuzione di FACS sul tessuto fresco è che ci vuole un giorno intero per dissociare il tessuto e il processo da FACS. Inoltre, solo circa quattro campioni possono essere processati al giorno. Questo di solito significa che solo una zona del cervello può essere valutata da ciascun cervello e le zone del cervello rimanenti devono essere scartati. Questo è un grave problema per le procedure comportamentali basso throughput come l'auto-somministrazione e l'estinzione training che richiede un intervento chirurgico e molte settimane di allenamento intensivo. Inoltre, le procedure comportamentali lunghe e complicate giornata di test rende difficile eseguire FACS lo stesso giorno. Sarebbe un vantaggio significativo per essere in grado di congelare il cervello dagli animali subito dopo test comportamentali, e quindi isolare i neuroni Fos-esprimono da una o più aree cerebrali in diversi momenti della scelta degli investigatori.
Qui dimostriamo che il nostro protocollo FACS può essere utilizzato per isolare i neuroni Fos-esprimono (e altri tipi di cellule) dal tessuto cerebrale sia freschi che surgelati. A titolo di esempio, abbiamo isolato Fos-esprimendo neuroni da striato di ratto dopo le iniezioni di metanfetamina acute e da ratti naive senza iniezioni (condizione di controllo). Tuttavia, questo protocollo FACS può essere utilizzato dopo ogni trattamento comportamentale o farmacologica. La successiva analisi qPCR dei nostri campioni indicato che l'espressione del gene da questi tipi di cellule potrebbe essere valutata con Simiefficienza lar da tessuti sia freschi che surgelati.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il Comitato Cura e uso istituzionale animali (IACUC) dei National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio 16.
Nota: Tutti i passi sotto tubi di scarso utilizzo vincolante centrifuga che sono stati tenuti in ghiaccio se non diversamente specificato.
1. Preparazione alla Tissue Collection
- Impostare la centrifuga a 4 ° C.
- Fuoco smalto un insieme di tre pipette Pasteur in vetro con decreasing diametri di circa 1,3, 0,8, e 0,4 mm per ogni campione.
- Preparare etichettati 1,7 ml-provette contenenti 1 ml freddo tampone A e tenere i tubi in ghiaccio.
- Preparare un vassoio di ghiaccio che contiene il cervello affettare matrice, spatole e lastre di vetro (o invertita vetro capsula di Petri) su cui eseguire la dissezione. Pre-freddo a due o più lame di rasoio sulla carta lastre di vetro e l'uso dei tessuti a secco tutti gli strumenti che toccano il tproblema.
- Scongelare la soluzione enzimatica a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti prima della raccolta del tessuto.
2. Tessuto Collection e la dissezione
- Avviare la comportamentale o farmacologica trattamento 90 minuti prima della raccolta del tessuto.
NOTA: Per i risultati mostrati qui, iniezioni intraperitoneali acuti di 5 mg / kg di metanfetamine su ratti in un ambiente romanzo (condizione di prova) e ratti naive tenuti nelle gabbie casa (condizione di controllo) sono state eseguite. - Anestetizzare il topo ponendolo in un barattolo di vetro con essiccatore isoflurano saturi e decapitare il topo 30-60 secondi più tardi con una ghigliottina.
Utilizzare forbici per rimuovere la pelle ei muscoli dalla testa ed esporre il cranio. Utilizzare rongeurs per tagliare il cranio e aprire il foro occipitale e rimuovere la parte posteriore del cranio. Utilizzare rongeurs per tagliare lungo i bordi superiori del cranio per esporre il cervello. Fare attenzione a non danneggiare il cervello. Utilizzare una piccola spatola per raccogliere delicatamente sotto und elevare il cervello. Sollevare il cervello e tagliare i nervi fino a quando il cervello è libero 17. - Sezionare il tessuto usando lame di rasoio.
NOTA: Ottenere campioni di tessuto utilizzando uno dei seguenti metodi: (2.3.1) del tessuto fresco sezionato; (2.3.2) tessuti congelati dopo la dissezione; o (2.3.3) del tessuto congelato sezionato dal congelato tutto il cervello. Mantenere la matrice affettare cervello, lamette e lastra di vetro secco per la dissezione e tritare processi come l'acqua condensata può portare a lisi ipotonico delle cellule. Utilizzare lenti di ingrandimento per garantire la dissezione accurata.- Per il tessuto fresco sezionato, posizionare il cervello appena estratto in una matrice affettatura cerebrale (uno stampo metallico a forma di cervello di ratto con slot per le lamette a intervalli di 1 mm) che è stato raffreddato su ghiaccio. Inserire due o più lame di rasoio pre-refrigerati negli slot per tagliare fette coronali che contengono la regione del cervello (s) di interesse. Posizionare la fetta tagliata sulla lastra di vetro freddo.
Nota: sezionare il cervello regions di interesse su una lastra di vetro freddo. - Per tessuti congelati dopo la dissezione, sezionare la regione del cervello (s) di interesse da fette di cervello appena estratta, simile a quello sopra descritto in 2.3.1. Posizionare il tessuto sezionato in una provetta e rapidamente congelare il tessuto immergendo la microprovetta in -40 ° C isopentano per 20 sec. Mantenere tessuto sezionato congelato in ogni momento in una ºC freezer -80 fino al procedimento.
- Per tessuti congelati, congelare immediatamente il cervello appena estratto in -40 ° C isopentano e conservare in un sacchetto sigillato a -80 ° C per un massimo di 6 mesi.
- Il giorno della dissezione, posizionare il cervello congelato in un criostato settato a circa -20 ° C (non più caldo di -18 ° C) per circa 2 ore per equilibrare la temperatura.
NOTA: Cervelli possono essere facilmente tagliati a questa temperatura, mentre le temperature più fresche rendono il cervello troppo fragile da tagliare in modo sicuro. - Utilizzare lame di rasoio per tagliare 1 - 2 mm fette coronali diil cervello congelato in un criostato. Utilizzare un ago 12 a 16-gauge smussato per ottenere punzoni di tessuto da queste fette in condizioni di congelamento. Mantenere il tessuto sezionato congelato in ogni momento fino al procedimento.
- Il giorno della dissezione, posizionare il cervello congelato in un criostato settato a circa -20 ° C (non più caldo di -18 ° C) per circa 2 ore per equilibrare la temperatura.
- Per il tessuto fresco sezionato, posizionare il cervello appena estratto in una matrice affettatura cerebrale (uno stampo metallico a forma di cervello di ratto con slot per le lamette a intervalli di 1 mm) che è stato raffreddato su ghiaccio. Inserire due o più lame di rasoio pre-refrigerati negli slot per tagliare fette coronali che contengono la regione del cervello (s) di interesse. Posizionare la fetta tagliata sulla lastra di vetro freddo.
- Aggiungere 1 - 2 gocce di tampone A per coprire il tessuto sezionato prima della macinazione. Rimuovere la maggior parte della sostanza bianca dal tessuto utilizzando due lame di rasoio per evitare la perdita di neuroni durante il resto del processo di triturazione. Se iniziano tessuto congelato, quindi consentire il tessuto scongelare sulla lastra di vetro freddo per non più di 1 min prima di applicare tampone A soluzione.
- Tritare il tessuto 100 volte in ogni direzione ortogonale con una lama di rasoio su una lastra di vetro refrigerati. Tenere la lametta verticale alla piastra di vetro quando macinazione.
NOTA: macinazione approfondita è fondamentale per tutte le fasi del protocollo. - Utilizzare lame di rasoio per trasferire il tessuto tritato in provette da microcentrifuga contenente 1 ml di tampone a freddo A. Invertire il tubo 3 - 5 volte a keep tutto il tessuto tritato nella soluzione.
3. cellulare Dissociazione
NOTA: L'uso delicato su se stesso miscelazione per tutti i seguenti passaggi. Non utilizzare un vortex e di evitare bolle d'aria che causano danni alle cellule.
- Centrifugare le provette dei campioni a 110 xg per 2 minuti a 4 ° C. surnatante degli scarti. Lentamente aggiungere 1 ml di soluzione di enzima appena scongelati fredda (contenente una miscela di enzimi proteolitici) lungo la parete interna della provetta. Immediatamente succhiare tutto il pellet e delicatamente pipetta su e giù solo 4 volte con una pipetta moderatamente grande diametro punta per disperdere il precipitato di tessuto tritato.
- Invertire immediatamente i microtubi per evitare il pellet di attaccarsi al fondo e incubare i campioni con miscelazione end-over-end per 30 min a 4 ° C.
- Dopo la digestione enzimatica del tessuto, centrifugare le provette a 960 xg per 2 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e aggiungere 0,6 ml di freddo tampone A. immediately dopo l'aggiunta del tampone A, utilizzare la stessa punta della pipetta per disperdere il pellet risucchiando tutto il pellet e delicatamente pipetta su e giù per 5 volte.
- Meccanicamente triturare il tessuto digerito e raccogliere in provette da 15 ml utilizzando le seguenti operazioni. Per ogni campione, utilizzare un insieme separato di 3 pipette Pasteur di vetro incendio lucidato con decrescente diametri di circa 1,3, 0,8 e 0,4 mm attaccati alle lampadine di lattice.
- Delicatamente triturare ogni campione per 10 volte con la pipetta di vetro 1,3 millimetri. Lasciate che il campione accontentarsi di 2 minuti sul ghiaccio (i detriti e le cellule indissociate si depositerà sul fondo). Raccogliere il surnatante (~ 0,6 ml) e trasferimento in un tubo da 15 ml (tubo # 1).
- Aggiungere 0,6 ml di tampone A soluzione al pellet rimanente. Triturare il campione 10 volte con la pipetta di vetro e 0,8 mm. Lasciate che il campione accontentarsi di 2 min in ghiaccio. Raccogliere il surnatante (~ 0,6 ml) e il trasferimento agli stessi tubo da 15 ml # 1.
- Aggiungere 0,6 ml di tampone Una soluzione alla pelle rimanentit. Triturare il campione 10 volte con la pipetta di vetro 0,4 mm. Lasciate che il campione accontentarsi di 2 min in ghiaccio. Raccogliere il surnatante (~ 0,6 ml; senza toccare il pellet con le cellule non dissociati) e trasferire agli stessi 15 tubo conico # 1 ml.
NOTA: Mantenere il diametro pipetta 0,4 millimetri nel tubo # 1 per le seguenti operazioni triturazione. - Ripetere il punto 3.4.3 altre tre volte utilizzando la più piccola pipetta di vetro (~ 0,4 millimetri di diametro), e raccogliere il surnatante in un tubo conico separati 15 ml (tubo # 2).
- Triturare le sospensioni cellulari raccolti in tubi # 1 e # 2 per ulteriori 10 volte usando la pipetta di vetro 0,4 millimetri e tenere in ghiaccio.
4. cellulare Fissazione e permeabilizzazione
- Preparare 4 microtubi per campione (due microtubi per le cellule dal tubo # 1 e due per le cellule da tubo # 2) con l'aggiunta di 800 ml di etanolo al 100% freddo (conservati a -20 ° C prima dell'uso) in ogni provetta e tenerli in ghiaccio . Nota: L'etanolo finaleconcentrazione sarà 50%.
- Pipettare ~ 800 ml di sospensioni cellulari (dal tubo # 1 e tubo # 2) in ciascuna delle 4 provette contenenti etanolo freddo e invertire i tubi per mescolare i campioni.
- Incubare le provette in ghiaccio per 15 minuti, mentre invertendo i tubi ogni 5 minuti.
- Dopo la fissazione / permeabilizzazione, centrifugare le provette a 1.700 xg per 4 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. Lasciare 50 ml di soluzione per evitare la perdita di cellule.
NOTA: I pellet in questa fase sono bianchi e bastone meno alla parete dei tubi di prima permeabilizzazione. Pertanto, rimuovere il supernatante attentamente toccando la parete della provetta dove non c'è pellet e redige il surnatante lentamente con una micropipetta.
5. cellulare Filtrazione
- Risospendere il pellet dal punto 4.4 con PBS freddo come segue:
- Aggiungere 550 pl di PBS freddo ad uno dei due microtubi provenienti dal tubo # 1, e utilizzare un moderatamente grande diametro piPette punta di pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per 5 volte. Ripetere la stessa per una provetta proveniente dal tubo # 2.
- Per le cellule dal tubo # 1, utilizzando la stessa pipetta, la prima sospensione cellulare al secondo pellet. Risospendere il secondo pellet pipettando delicatamente il combinato sospensione cellulare su e giù per 5 volte.
- Per le cellule dal tubo # 2, risospendere e combinare i pellet (vale a dire, terzo e quarto microtubi), come descritto in 5.1.2.
- Filtrare le due sospensioni cellulari da passi 5.1.2 e 5.1.3 separatamente utilizzando due diverse coppie di filtri cellulari (100 micron e 40 micron dimensioni dei pori) come segue:
- Pre-umidi ciascuna colino cella aggiungendo PBS all'interno del filtro. Utilizzare una pipetta per rimuovere l'eccesso di PBS dall'esterno del filtro.
- Pipetta la sospensione cellulare dal punto 5.1.2 in modo uniforme sulla prima colino cella con 100 micron dimensione dei pori. Raccogliere il flusso continuo in un tubo da 50 ml su ghiaccio. Utilizzare il pi grecopipetta per raccogliere il flusso continuo attaccata sul fondo lato esterno del filtro cella.
- Utilizzare la stessa pipetta per trasferire il flusso continuo dal filtro delle cellule 100 micron per il filtro cella di 40 micron. Raccogliere questo flusso passante in un altro tubo 50 ml su ghiaccio. Quando si trasferisce il flusso attraverso di 40 micron colino cella, cambiare per nuove punte per pipette per evitare la contaminazione da 100 micron colino cella.
- Ripetere questi passaggi per la sospensione cellulare dal punto 5.1.3 utilizzando una nuova serie di filtri.
- Combinare i due flusso continuo di ogni campione per un volume finale di circa 1 ml per campione.
6. Incubazione con anticorpi
NOTA: utilizzare piccole aliquote delle sospensioni delle cellule cerebrali per preparare più campioni di controllo per la regolazione del flusso adeguato citometro impostazioni prima di eseguire l'esempio principale. Per ogni etichettatura degli anticorpi, preparare campioni di controllo che includono anticorpi, solo la SEanticorpo condary (o altra etichetta fluorescente), e quindi entrambi gli anticorpi primari e secondari (o altra etichetta fluorescente). Utilizzare questi controlli per impostare le porte che separano specifico contro l'etichettatura non specifico nel citometro di flusso. Se possibile, utilizzare fluorocromi che non richiedono un risarcimento. Aumentare il volume finale dei campioni di controllo gating ad un volume finale di 700 microlitri aggiungendo PBS prima di aggiungere gli anticorpi primari.
- Preparare luce-dispersione e campione di controllo DAPI con il trasferimento di un campione di 100 ml di cellule filtrata in una provetta 1,7 ml. Aggiungere 600 ml di PBS freddo con 1 mg / ml DAPI per la colorazione dei nuclei. Incubare per 10 minuti con miscelazione end-over-end, e lavare (come indicato nei passaggi 6.4.2 a 6.4.5) prima di passare attraverso il citofluorimetro.
Nota: questo esempio viene utilizzato solo per impostare il / nuclei di gate di cella prima di ordinare le cellule rimanenti nella macchina FACS. - Preparare singoli campioni di controllo immunolabeled trasferendo 100 & #181; l delle cellule filtrate in un provetta 1,7 ml. Aggiungere 600 ml di PBS freddo con un anticorpo (ad esempio, anticorpi NeuN). Aggiungere 600 pl di PBS freddo ad una microprovetta con un altro anticorpo (ad esempio, anticorpi Fos). Aggiungere il corrispondente anticorpo secondario se non è un anticorpo primario diretta coniugato.
NOTA: Questi campioni vengono utilizzati per determinare la tensione del tubo fotomoltiplicatore appropriata (PMT), e di valutare la sovrapposizione dei due segnali fluorescenti se necessario. Le concentrazioni anticorpali devono essere titolati per ottenere i migliori rapporti segnale-rumore in tutti i canali. segnali fluorescenti sovrapposte possono essere compensate con taratura interna dei canali fluorescenti diverse all'interno del citofluorimetro. - Preparare campione di controllo negativo con marcatore fluorescente doppio trasferendo 100 ml di cellule filtrata in una provetta 1,7 ml. Aggiungere 600 ml di PBS freddo con i soli anticorpi secondari o IgG anticorpi primari diretta-coniugati.
NOTA: Thicampione di controllo s può essere utilizzato ogni volta prima di ordinare per determinare la fluorescenza di sfondo per ogni fluoroforo. - Preparare campione principale da ordinare.
- Trasferire 700 microlitri di cellule filtrati in una provetta 1,7 ml. Aggiungere 7 ml (1: 100) di anticorpo primario Fos coniugato direttamente Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) e 1,4 ml (1: 500) di anticorpo primario NeuN coniugato direttamente ficoeritrina (anti-NeuN-PE). Incubare le provette per 30 minuti a 4 ° C con miscelazione end-over-end.
- Al termine dell'incubazione, aggiungere 800 ml di PBS freddo ad ogni microprovetta, compreso il campione principale e campioni di controllo, e mescolare per inversione.
- microtubi centrifugare a 1.300 xg per 3 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante, lasciando 50 surnatante ml per prevenire la perdita di cellule.
- Aggiungere 1 ml di PBS freddo alle cellule pellet e risospendere con una pipetta con un moderatamente grande diametro della punta.
- Centrifugare a 1.300 xg per 3 minuti a 4 ° C. Discard il surnatante.
- Risospendere il pellet in 500 ml PBS freddo (regolare il volume finale a seconda delle dimensioni del pellet).
- Trasferimento e filtrare la sospensione in un tubo a fondo rotondo campione FACS con un tappo colino cella (40 micron). Mantenere le cellule immunolabeled sul ghiaccio ed eseguire immediatamente FACS. Nota: Per il filtraggio, toccare la punta della pipetta verticalmente sul tappo filtro e spingere la sospensione cellulare attraverso di essa.
- Impostare citofluorimetro cancelli utilizzando campioni di controllo.
- Utilizzare la luce-dispersione e campione di controllo DAPI per identificare la popolazione di cellule neuronali dal totale eventi e detriti cellulari.
NOTA: corpi cellulari in questa preparazione sono solo 1-2% degli eventi totali (il resto sono detriti e processi cellulari rotti). Sulla base del segnale DAPI fluorescente (indicando nuclei) e dispersione Forward (dimensione della cella) è possibile localizzare corpi cellulari e cancello all'indietro basati sulla avanti e laterale proprietà della luce scatteringle cellule (come mostrato in Figura 1 A, B). - Utilizzare i singoli campioni di controllo immunolabeled per determinare le impostazioni di tensione PMT, e di analizzare spillover di emissioni da un fluorocromo specifico in un altro filtro / canale (ad esempio, Alexa Fluor 488 / FITC o Phycoerythrine). Se i segnali fluorescenti si sovrappongono, correggere la sovrapposizione regolando i livelli di compensazione manualmente.
- Utilizzare il doppio controllo negativo con marcatore fluorescente per impostare la soglia per la popolazione positiva.
NOTA: Il segnale proveniente da questo campione è pensato per essere causa di auto-fluorescenza e le cellule del campione principale si trova sopra di questa soglia può essere considerata positiva. In genere, i parametri di soglia per l'ordinamento sono più severe e circa la parte superiore 2/3 delle cellule marcate al di sopra del controllo negativo sono in realtà ordinato.
- Utilizzare la luce-dispersione e campione di controllo DAPI per identificare la popolazione di cellule neuronali dal totale eventi e detriti cellulari.
- Ordinare i neuroni del campione principale da FACS in 1,7 ml microtubi. Raccogliere le cellule in 50 ml di RNAtampone di estrazione. Dopo la cernita, vortex e centrifugare la provetta e miscelare la sospensione pipettando su e giù per 10 volte per recuperare tutte le cellule filtrate dalle pareti del tubo.
- Incubare la sospensione cellulare ordinata a 42 ° C per 30 minuti per garantire che tutte le cellule sono lisate prima dell'estrazione RNA, e quindi si centrifuga a 2800 xg per 2 minuti a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante in una provetta RNasi-free per la conservazione a lungo termine a -80 ° C o immediatamente elaborare il campione per l'isolamento di RNA, la sintesi del DNA, geni bersaglio di pre-amplificazione e qPCR, come descritto in precedenza 13-15.
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Representative Results
Ordinamento neuroni Fos-positivi e Fos-negativi dal tessuto striato dorsale freschi e congelati da singoli ratti dopo le iniezioni di metanfetamina acute.
Il protocollo descritto sopra è stato usato per ordinare neuroni Fos-positivi e Fos-negativi da un singolo ratto striato dorsale 90 min dopo l'iniezione intraperitoneale di metamfetamina (5 mg / kg). ratti naive nelle loro gabbie a casa sono stati utilizzati come controlli. Dorsale del tessuto striato è stato elaborato o immediatamente dopo la sua collezione (tessuto fresco) o trasformati dopo essere stati congelati e conservati in -80 ° C per 1, 7 o 21 giorni. I risultati di questi punti di tempo di congelamento non erano significativamente differenti tra loro, quindi i dati sono stati riuniti.
Per impostare le condizioni di ordinamento dello strumento, campioni di controllo (di cui sopra), sia dal controllo della gabbia di casa o methamphetagruppi miniera-iniettata sono stati utilizzati. Quando ogni particella o evento in questi campioni passa attraverso la cella di flusso nel citometro, sono dati un numero di identificazione che è associato con caratteristiche di dispersione e fluorescenza luce dell'evento e registrato in un foglio. Gli eventi in questa pubblicazione possono poi essere organizzati in scattergrams o appezzamenti di densità per queste caratteristiche (Figura 1). Eventi con caratteristiche simili possono essere raggruppati o 'gated' da diverse coppie di caratteristiche per determinare le porte come quelle contenenti cellule, i neuroni, o neuroni Fos-positivi. Una volta che le porte sono determinati utilizzando i campioni di controllo sopra descritte, il campione principale viene iniettato nel citometro a flusso e ordinata secondo queste porte. La popolazione di cellule è stato sorvegliato da tutti gli eventi (cellule e detriti) in base alla loro dispersione della luce in avanti (FSC, l'indicazione della dimensione della particella) e dispersione della luce laterale (SSC, l'indicazione del g della particellaranularity). Come mostrato nella FSC rispetto SSC dot plot (Figura 1A e 1B), la trama densità di tutti gli eventi rivela una piccola popolazione omogenea con dimensioni e granularità simili, oltre ad una grande popolazione eterogenea (Figura 1A e 1B). Una piccola popolazione omogenea che contiene corpi cellulari è stato identificato e sorvegliato come "Celle", sulla base di FSC e le caratteristiche SSC da studi precedenti 11,13-15 e l'etichettatura con DAPI. Un po 'più alta percentuale di cellule sono stati ottenuti da tessuto congelato (2,6%) che da tessuto fresco (1,9%). La grande popolazione eterogenea è per lo più frammenti, presumibilmente da dendriti e processi assonale.
Successivamente, le cellule singole dal cancello "celle" sono stati identificati in base alla loro dimensione, che è stato indicato dalla larghezza del segnale FSC per ogni evento l'asse x. Gli eventi che erano più grandi di singole cellule sono stati considerati aggregati di cellule e esclusi dal "porta singola cellula. Tutte le successive fasi di analisi sono state condotte all'interno di questa" porta cella singola "(Figura 1C e 1D). La maggior parte di questo singolo popolazione di cellule (> 92%) è stato positivo per la colorazione DAPI (dati non mostrato).
Innanzitutto, i neuroni sono stati identificati in base alla loro intensità di fluorescenza PE che indicava NeuN-immunoreattività (Figura 1E e 1F). I neuroni composti circa il 24% di tutti gli eventi dal cancello "cella singola" per tessuto fresco e il 38% per il tessuto congelato. Quasi tutti gli eventi in questa porta "Neuron" (98% in tessuto fresco e il 99% in tessuti congelati) sono risultati positivi per la colorazione DAPI del DNA nei nuclei delle cellule (Figura 1G e 1H). I restanti eventi DAPI-etichettati nella porta cella singola sono NeuN-negativi e comprendono glia, oligodendrociti e microglia, come confermato da qPCR in figura 3.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Poi i neuroni sono stati classificati come i neuroni Fos-positiva o Fos-negativi in base alla loro Alexa Fluor 647 segnale di fluorescenza (Fos-immunoreattività) A differenza di marcatori di cellule-tipo, Fos. livelli di espressione nei neuroni aumenta gradualmente a causa di diversi livelli di attività neurale e il corso del tempo. Quindi, non ci sarà una soglia netta tra Fos-positivo contro neuroni Fos-negativi. nella prima fase (utilizzato solo per off-line le analisi di calcolare le percentuali di neuroni Fos-positivo), abbiamo definito la soglia per i neuroni Fos-positivi basati sulla massima fluorescenza Alexa-647 (per Fos) da parte della popolazione NeuN-negativi nei ratti di controllo ingenui gabbia casa. neuroni Fos-positivi sono indicati nelle piazze blu da diverse condizioni sperimentali in figura 2 in entrambi i tessuti freschi e congelati, la percentuale di Fos-positivi neuroni di ratti di metanfetamine-iniettato. (1,9-2,2%, Figura 2C e 2D) era due volte più compared ai ratti gabbia casa (0,7-0,8%, Figura 2a e 2b).Conferma geni specifici delle cellule-tipo di cellule FACS-ordinati utilizzando gene bersaglio di pre-amplificazione e RT-PCR.
Nella seconda fase, per garantire la cernita di soli neuroni Fos-positivi dal campione principale per la successiva mRNA analisi e riducendo l'inclusione delle cellule Fos-negativi, la soglia di fluorescenza Alexa-647 è stata sollevata in modo che solo i due terzi superiori di Fos eventi -positive nelle piazze blu sono stati ordinati e raccolti. Questa soglia ha almeno 10 volte superiore a fluorescenza (alto Fos espressione per cella) della soglia utilizzato sopra per calcolare la percentuale di neuroni Fos-positive nei campioni. Quattro popolazioni di cellule sono state ordinate da un campione di tessuto unico, compresa NeuN-negativo + Fos-negativi (~ 5.000 eventi), NeuN-negativo + Fos-positivo (era compresa 25 - 83 eventi), NeuN-positivo + Fos-negative (~ 5.000 eventi) e NeuN-positivo + Fos-positivo (distanza 44 - 133 eventi per il gruppo di casa, 185 - 450 eventi per il gruppo di metanfetamina). Prima, è stato confermato l'espressione di geni specifici di tipo a cella in NeuN-positive (sia Fos-positivi e Fos-negativo) della popolazione e NeuN-negativi (sia Fos-positivi e Fos-negativo) (Figura 3). GAPDH era utilizzato come gene di riferimento / housekeeping, sulla base dei risultati del nostro studio precedente 13. Per controllare per i diversi livelli di RNA nel campione e cDNA nelle reazioni PCR, reazioni duplex qPCR sono state eseguite utilizzando primer sia per il gene bersaglio e GAPDH cDNA. Valori Ct per il gene housekeeping GAPDH sono stati tenuti tra il 15 e il 31 per misure accurate. Per entrambi i tessuti freschi e congelati, livelli NeuN mRNA erano significativamente maggiori (circa 8 volte) nella popolazione NeuN-positive rispetto alla popolazione NeuN-negative (p <0,05; Figura 3A GFAP (marker delle cellule gliali, figura 3B) e Oligo2 (marker delle cellule oligodendrociti, la figura 3C) livelli di mRNA erano maggiori nella popolazione NeuN-negativo rispetto alla popolazione NeuN-positiva (p <0.05 ). Una tendenza simile di maggiore Iba1 (marker delle cellule microgliali, la figura 3D) livelli di mRNA è stato osservato nella popolazione NeuN-negativi, ma questo non era statisticamente significativa. Alcuni campioni contenuti estremamente bassi livelli di mRNA particolari che non possono essere misurati con precisione in un particolare tipo di cellule (ad esempio, GFAP mRNA nei neuroni NeuN-marcati). I valori massimi sono stati definiti come Ct 35 per eliminare i valori che sono stati troppo bassa per essere rilevata con precisione. valori Ct elevati hanno superato il limite di fiducia nei nostri saggi qPCR.
Espressione fos mRNA eraesaminato nella popolazione neuronale NeuN-positivi da ratti che hanno ricevuto una singola iniezione di metamfetamine (figura 4). Per entrambi i tessuti freschi e congelati, livelli Fos mRNA erano maggiori nei neuroni Fos-positivi che nei neuroni Fos-negativi (p <0.05). Inoltre, a fronte di un aumento di 3 volte di Fos mRNA nei neuroni Fos-positivi dal tessuto fresco, un aumento di 11 volte del Fos mRNA nei neuroni Fos-positivi dal tessuto congelato è stato rilevato. Presi insieme, questi risultati confermano l'identità di mRNA dei neuroni Fos-positivi, i neuroni Fos-negativi e la popolazione non neuronali dal tessuto sia freschi che surgelati. Inoltre, specifici del tipo di geni cellulari e altri geni di interesse possono anche essere analizzati da cellule ordinati sia in condizioni freschi e congelati.
Figura 1. Soppressione di DiteLe cellule ciato ed etichettato da freschi e congelati Rat dorsale striato. Il cancello 'Cells è stato determinato da proprietà lato scatter (AD) in avanti e confermato e, mediante l'etichettatura positiva con colorazione DAPI nucleare (GH). Il cancello 'neuroni all'interno della popolazione' Cells è stata determinata mediante fluorescenza per NeuN (PE; EF). (A - B) porta cellulare: trama lineare di tutti gli eventi, in base alla loro dispersione in avanti (asse X, la dimensione della cella) e scatter laterale (asse Y, granularità). (C - D), le cellule singola porta: trama lineare di altezza avanti scatter (asse Y) e la larghezza (asse X) all'interno della porta cellula mostrata in AB. (E - F) Neuron cancello: grafico logaritmico di immunofluorescenza per PE-marcato NeuN (asse Y) all'interno del cancello di singole cellule mostrato in CD rivela neuroni del cluster superiore di eventi e di cellule non neuronali del cluster inferiore. (G H) Nuclei colorazione: grafico logaritmico di fluorescenza per nuclei DAPI-etichettati (asse Y) all'interno del cancello di cellule neuronali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Soppressione di neuroni Fos-positivi e Fos-negativi freschi e congelati Rat striato dorsale basata su doppia etichettatura per NeuN e Fos. Il striato dorsale fresca e congelata da ratti (presa direttamente da loro gabbia casa o 90 minuti dopo una singola iniezione intraperitoneale di metanfetamina) sono stati dissociato ed etichettato con gli anticorpi coniugati direttamente contro NeuN e Fos e allineati con una macchina FACS. Ordinamento era basata su ficoeritrina (PE) -labeled NeuN immunofluorescenza (asse X) e Alexa 647-marcato immunofluo Fosrescence (asse Y). Fos-positive (punti blu) e Fos-negativi (punti rossi) neuroni erano situati nei quadranti superiore e inferiore destro, rispettivamente. Le trame dot mostrano cellule NeuN-positivi (neuroni) e le cellule NeuN-negativi (punti grigi); i quadrati blu indicano neuroni con sopra-soglia di espressione Fos. (A - B) del Gruppo: i ratti naive prelevati direttamente dalle loro gabbie a casa. (C - D) Gruppo di metamfetamina: ratti che hanno ricevuto singole iniezioni di metanfetamina. Le soglie per i neuroni Fos-positivi sono stati selezionati per essere appena al di sopra massimale Alexa-647 di fluorescenza (Fos-IR) osservata per le cellule NeuN-negativi nel gruppo di controllo a casa gabbia. Mentre 0,7-0,8% di tutti i neuroni sono Fos-positivo nel gruppo di casa, 1,9-2,2% di tutti i neuroni sono Fos-positivo nel gruppo di metanfetamine.
Figura 3. Cell-tipo specifico gene espressione in cellule di fresco e congelato Rat striato dorsale FACS-allineati. neuroni NeuN-positivi (Fos-positivi e Fos-negativi) e NeuN-negativi (Fos-positivi e Fos-negativi) sono stati ordinati utilizzando il protocollo descritto e mRNA livelli di espressione di geni specifici delle cellule di tipo sono stati utilizzati per confermare l'ordinamento delle cellule. (a) NeuN è un marcatore per le cellule neuronali. (B) GFAP è un marker per le cellule gliali. (C) Oligo2 è un marker per le cellule oligodendrociti. (D) Iba1 è un marker per le cellule microgliali. Per NeuN mRNA, i dati sono presentati come media ± SEM dei valori piegatura relativi livelli di espressione in cellule NeuN-negativi dal tessuto fresco (n = 9 - 14). Per GFAP (n = 6 - 12), Oligo2 (n = 9 - 11) e Iba1 (n = 5-8) mRNA, i dati sono presentati come media ± SEM dei valori piega rispetto a livelli di espressione a NeuCellule N-positivi dal tessuto fresco. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. I livelli di mRNA nei neuroni Fos FACS-ordinati da freschi o surgelati ratto striato dorsale dopo neuroni metamfetamina iniezione. Fos-positivi e Fos-negativi sono stati ordinati come descritto nel protocollo di cui sopra e livelli di mRNA di Fos è stata confermata. I dati sono presentati come media ± SEM dei valori piegatura relativi livelli di espressione nei neuroni Fos-negativi dal tessuto fresco (n = 3 - 4).
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Discussion
FACS possono essere utilizzati per ordinare neuroni e altri tipi di cellule provenienti da tessuti adulti o cerebrale fresco o congelato. Come accennato nell'introduzione, la possibilità di utilizzare tessuti congelati consente un utilizzo ottimale di campioni da animali che sono stati sottoposti a procedure comportamentali complesse e prolungate, quali studi di auto-amministrazione e di ricaduta nella ricerca tossicodipendenza. Queste procedure comportamentali richiede solitamente 1-2 ore o più a lungo, e richiedono tutti gli animali (10-20 totale) da testare nello stesso giorno 13,18. Ci vogliono ~ 4 ore per processare 4 campioni di tessuto cerebrale fresco sezionati, che comprende la dissezione del cervello, la dissociazione delle cellule, permeabilizzazione e immunomarcatura. Dopo l'elaborazione, l'ordinamento ogni campione da FACS dura tra i 20 - 30 min. La fase finale di riscaldare le cellule ordinati nel tampone di lisi richiede un altro 30 min. In totale, ~ 7 ore sono tenuti da dissezione del cervello alla fase soluzione di cellule-lisi RNA contenenti finale. Tuttavia, è ora possibile congelare tutto Brains o appena sezionati regioni del cervello subito dopo il test, e li elaborano in seguito. Questo semplifica notevolmente i test e permette molteplici aree cerebrali per essere ordinati in un giorno diverso. Il congelamento del tessuto prima di FACS può anche migliorare i risultati. Più neuroni NeuN-positivi sono ottenuti da campioni di tessuto congelato. Questo potrebbe essere spiegato in parte da un aumento NeuN-etichettatura a causa della rottura delle membrane cellulari durante il congelamento e la successiva scongelamento, che aumenterebbe l'accesso anticorpi alle proteine intracellulari, come NeuN e Fos. Effetti simili sono stati osservati con fibroblasti, le cellule epiteliali e cellule HeLa 19.
La resa di cellule e neuroni può essere massimizzata utilizzando la procedura seguente. Durante la dissezione dei tessuti, rimuovere maggior parte della sostanza bianca (corpo calloso e commissura anteriore per le striato dorsale e nel nucleo accumbens, rispettivamente). Questo impedisce tessuto aderisca alle punte di plastica e pipette di vetro nella successiva steps. Utilizzare Buffer A (vedere le specifiche nella tabella dei materiali e reagenti) per mantenere il tessuto sezionato coperto. Questo migliora la qualità delle cellule durante macinazione del tessuto con la lametta (passo 2.5). L'ulteriore set di 3 passi triturazione con la più piccola pipetta di vetro (passo 3.9) e successivo filtraggio con una seconda serie di filtri cellulari (step 5) raddoppia la resa di cellule e neuroni. Riusare i filtri cellulari saranno intasare i filtri e minore resa delle cellule. Sii gentile con le cellule quando risospendere il pellet e durante la triturazione. L'uso di un moderatamente grande punta della pipetta durante queste fasi sarà ridurre i danni cellulari dovuti alle sollecitazioni di taglio. guardare con attenzione il pellet quando si rimuove il surnatante dopo permeabilizzazione con etanolo (punto 4.4). Il pellet è meno compatta e può essere distribuito lungo la parete della provetta. calcoli approssimativi, la resa dei neuroni Fos-positivi è circa il 10% del numero di partenza nel campione di tessuto striatale sezionato. Il protocollo corrente può essere modificata per adattarsi altri scopi sperimentali. Nel protocollo attuale, il tessuto è stato raccolto 90 minuti dopo le iniezioni di metanfetamina in quanto espressione di Fos raggiunge livelli massimi in questo momento, che è cruciale per un efficiente raccolta differenziata dei neuroni Fos-esprimono. Tuttavia, il tessuto può essere raccolto in qualsiasi punto di tempo per FACS, a seconda dello scopo specifico dell'esperimento. Per lo stoccaggio iniziale campione di tessuto, abbiamo utilizzato con successo il tessuto fresco sezionato, tessuti congelati dopo la dissezione, o tessuto congelato sezionato dal congelato intero cervello per isolare i neuroni Fos-esprimono utilizzando FACS seguita da analisi qPCR dell'espressione genica. Per il fissaggio e permeabilizzazione, la durata e la temperatura in questo protocollo (4 ° C per 15 min) è stato ottimizzato per permeabilize sia membrane citoplasmatiche e nucleari, nonché per fissare il tessuto. Variazioni di durata e / o la temperatura può cambiare i risultati finali. Altre soluzioni di fissaggio quali paraformaldehyde e detergenti non ionici, come saponina, che hanno lavorato per i neuroni embrionali e post-natale 20, possono funzionare anche per i neuroni dal cervello adulto. Inoltre, perline rimozione mielina possono essere utilizzati come una modifica del protocollo di corrente come mostrato recentemente per FACS da tessuto cerebrale 21.
Il protocollo attuale ha due limitazioni importanti da considerare. In primo luogo, questo protocollo non è adatto per la rilevazione di markers fenotipo delle cellule che si esprimono principalmente in sinapsi (recettori per esempio, dopamina o glutammato), perché questi processi cellulari vengono rimossi dai corpi cellulari durante le fasi di triturazione e la dissociazione. Una seconda limitazione è possibile che le lunghezze RNA ottenuto da cellule FACS-filtrate possono non essere sufficienti per tutti i metodi di analisi dell'RNA. numeri integrità dell'RNA (RIN) per RNA ottenuto da FACS scelti cellule sono tra 2.5- 3.5, che corrisponde a lunghezze RNA medi più brevi. Qui, la dimensione più corta RNA è stato compensato dautilizzando relativamente brevi ampliconi qPCR di 80-100 punti base, come descritto in precedenza 13-15. Abbiamo usato anche questi RNA lunghezza più corta con successo per l'analisi microarray 11. Tuttavia, piccoli tronchi di RNA ottenuti non possono essere adeguati per tutti i metodi di analisi di RNA. Va sottolineato che primer PCR che specificamente mirati giunzioni esone-esone trovano solo in piena spliced mRNA nel citoplasma sono stati utilizzati. Questi primer non rilevano RNA introne contenenti dal nucleo. Inoltre, abbiamo usato in precedenza questo protocollo con anticorpi e tessuto cerebrale fresco per rilevare la tirosina idrossilasi nei recettori della dopamina citosol e D1 nella membrana cellulare 10. La rilevazione di questi marcatori di membrana citosoliche e cellulari ha indicato che la procedura di dissociazione produce le cellule in gran parte intatte, e non semplicemente nuclei.
Nel complesso, FACS isolamento dei neuroni da campioni congelati apre altre applicazioni. Non ci sono differenze di ordinamento o gene espresfissione sono stati osservati (dati non mostrati) campioni sono stati conservati 3 giorni o 3 settimane a -80 ºC. Tre settimane sono un tempo ragionevole per risolvere tutti i campioni provenienti da un esperimento specifico (20 - 40 campioni) e isolare l'RNA per l'espressione genica. RNA utilizzabile è stata ottenuta da tessuto cerebrale immagazzinati per 6 mesi a -80 ° C (dati non mostrati qui). Così, questo protocollo potrebbe essere utile per FACS isolamento di surgelati campioni di cervello umano post-mortem che sono stati conservati per diversi mesi o addirittura anni.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
References
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