Summary
Her presenterer vi en Fluorescence Activated Cell Sortering (FACS) protokoll for å studere molekylære endringer i Fos-uttrykke nevrale ensembler fra både fersk og frossen hjernevev. Bruken av frossent vev tillater FACS isolering av mange hjernen områder over flere økter for å maksimere bruken av verdifulle dyr fag.
Abstract
Studiet av neuroplasticity og molekylære forandringer i lært atferd bytter fra studien av hele hjernen til studiet av bestemte sett med tynt fordelt aktiverte nerveceller kalles nevronale ensembler som formidler lært foreninger. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) er nylig blitt optimalisert for voksent rottehjernevevet og tillot isolering av aktiverte neuroner ved hjelp av antistoffer mot neuronal markør Neun og Fos-proteinet, en markør for aktiverte sterkt neuroner. Inntil nå ble Fos-uttrykkende nevroner og andre celletyper isolert fra friskt vev, noe som medførte lange behandlings dager og tillates meget begrenset antall tilfeller av hjerne prøver som skal vurderes etter langvarige og kompliserte atferdsmessige prosedyrer. Her fant vi at utbyttet av Fos-uttrykke nevroner og Fos mRNA fra rygg striatum var lik mellom fersk dissekert vev og vev frosset ved -80 ºC i 3 - 21 dager. I tillegg har vi bekreftet fenotypenav de Neun-positive og Neun-negative sorterte cellene ved å vurdere genekspresjon av neuronal (Neun), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) og microgial (Iba1) markører, noe som indikerer at frosne vev kan også anvendes for FACS isolering av glial celletyper. Samlet sett er det mulig å samle inn, dissekere og fryse hjernevev for flere FACS økter. Dette maksimerer mengden av data innhentet fra verdifulle dyr fag som har ofte gjennomgått lange og komplekse atferdsprosedyrer.
Introduction
Under læring, dyr danne assosiasjoner mellom komplekse sett av svært spesifikke stimuli. Dette høyoppløselige informasjon er tenkt å bli kodet av endringer innenfor bestemte mønstre av tynt fordelt nevroner kalles nevrale ensembler. Neuronal ensembler har nylig blitt identifisert ved induksjon av umiddelbart tidlige gener (IEGs) som Fos, Arc, og Zif268 og deres proteinprodukter i neuronene som var sterkt aktivert i løpet av oppførsel eller cue eksponering. Fos-uttrykke nevroner i særdeleshet har vist seg å spille kausale roller i sammenheng og cue-spesifikke lært atferd 1-4. Dermed unike molekylære neuroadaptations innenfor disse aktiverte Fos-uttrykke nevroner er topp kandidater til de nevrale mekanismene som koder lært foreninger dannet under normale læring og unormal læring lidelser, for eksempel avhengighet og posttraumatisk stresslidelse (PTSD) 5.
Fluorescence Aktivert Cell Sorting (FACS) har nylig tillatt analyse av unike molekylære neuroadaptations innenfor Fos-uttrykke nevroner. Flowcytometri og cellesortering ble utviklet i 1960-årene 6,7 for å karakterisere og isolere celler i henhold til deres lys-spredning og immuno-egenskaper, og har lenge vært brukt i immunologi og kreftundersøkelser. Imidlertid flowcytometri og FACS krever dissosierte enkeltceller som er vanskelig å få tak i fra voksen hjernevevet. FACS ble først brukt til å isolere og analysere grønt fluorescerende protein (GFP) -expressing striatale nevroner fra transgene mus som ikke krever antistoff merking 8,9. Vi utviklet et antistoff-basert FACS metode 10 for å isolere og vurdere molekylære endringer i Fos-uttrykke nevroner aktiveres av narkotika og / eller signaler i villtype dyr 11-15. I denne metoden, blir neuroner merket med et antistoff mot det generelle neuronal markør Neun, mens sterkt aktivert neuronerer merket med et antistoff mot Fos. Selv om vår første metode kreves sammenslåing av opp til 10 rotter per prøve for friskt vev, etterfølgende endringer i protokollen tillates FACS isolering av Fos-uttrykkende nevroner og kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) analyse av diskrete hjerneområder fra en enkelt rotte 13-15 . Totalt sett unike molekylære endringer ble funnet i Fos-uttrykke nevroner aktiveres under en rekke kontekst og cue-aktivert atferd i avhengighet forskning 12,14,15.
Et stort problem med logistikk utføre FACS på friskt vev, er at det tar en hel dag for å dissosiere vevet og fremgangsmåte ved FACS. I tillegg kan bare fire prøver behandles per dag. Dette betyr vanligvis at bare en hjerne område kan vurderes fra hver hjerne og de gjenværende områder av hjernen må kastes. Dette er et stort problem for lav gjennomstrømning atferds prosedyrer som for eksempel selvadministrasjon og utryddelse training som krever kirurgi og mange uker med intensiv trening. Videre er lange og kompliserte atferdsmessige prosedyrer på testdagen gjør det vanskelig å utføre FACS på den samme dag. Det ville være en vesentlig fordel å være i stand til å fryse hjernen fra dyrene umiddelbart etter adferdstesting, og deretter isolere Fos-uttrykkende nevroner fra ett eller flere områder av hjernen på forskjellige tider av undersøkerne har valgt ut.
Her viser vi at vår FACS-protokollen kan bli benyttet for å isolere Fos-uttrykkende nevroner (og andre celletyper) fra både ferske og fryste hjernevev. Som et eksempel kan det isolert Fos-uttrykkende nevroner fra rotte-striatum etter akutt metamfetamin injeksjoner og fra naive rotter uten injeksjoner (kontroll tilstand). Men dette kan FACS protokollen brukes etter eventuelle atferds eller farmakologisk behandling. Påfølgende qPCR analyse av våre prøver indikerte at genuttrykk fra disse celletyper kan bli vurdert med simiLar effektivitet fra både fersk og frossen vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble utført i henhold til Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr 16.
Merk: Alle trinnene under bruk lav-bindende sentrifugerør som ble holdt på is med mindre annet er spesifisert.
1. Forberedelser Før Tissue Collection
- Sett sentrifugen til 4 o C.
- Brann polish et sett med tre glass Pasteur pipetter med avtagende diameter på omtrent 1,3, 0,8 og 0,4 mm for hver prøve.
- Forbered merket 1,7 ml-rør som inneholder 1 ml kald buffer A og holde rørene på is.
- Forbered en is skuffen som inneholder hjernen ha klippet matrise, spatler og glassplater (eller omvendt glass petriskål) på å utføre disseksjon. Pre-kulden to eller flere barberblader på glassplater og bruke vev papir for å tørke alle instrumenter som berører tutgave.
- Tine den enzym-løsning ved romtemperatur (RT) i 30 minutter før vev samling.
2. Tissue Collection og Dissection
- Initiere atferds eller farmakologisk behandling 90 min før vev samling.
MERK: For de resultatene som vises her, akutte intraperitoneale injeksjoner av 5 mg / kg metamfetamin på rotter i en roman miljø (test tilstand) og naive rotter holdt i hjem bur (kontroll tilstand) ble utført. - Anesthetize rotte ved å plassere den i et glass eksikator krukke med mettet isofluran og halshogge rotte 30-60 sek senere ved hjelp av en giljotin.
Bruk saks til å fjerne hud og muskel fra hodet og avsløre skallen. Bruk Rongeurs å kutte skallen og åpne opp foramen magnum og fjern bakre del av skallen. Bruk Rongeurs å skjære langs kant slik at skallen å avsløre hjernen. Vær forsiktig så du ikke skader hjernen. Bruk en liten slikkepott til å forsiktig øse under end heve hjernen. Hev hjernen og kuttet nerver til hjernen er ledig 17. - Dissekere vev ved hjelp av barberblader.
MERK: Skaffe vevsprøver ved hjelp av en av følgende metoder: (2.3.1) fersk dissekert vev; (2.3.2) frosset vev etter disseksjon; eller (2.3.3) frosset vev dissekert fra fryst hel hjerne. Hold hjernen slicing matrise, barberblad og glassplate tørr hele disseksjon og hakking prosesser som kondensert vann kan føre til hypoton lysering av celler. Bruk forstørrelsesglass for å sikre nøyaktig disseksjon.- For fersk dissekert vev, plasser den ferske hentet hjernen til en hjerne slicing matrise (en rottehjerne formet metallform med spor for barberblader på 1 mm intervaller) som er blitt avkjølt på is. Sette inn to eller flere forhånds kjølte barberblad inn i sporene for å kutte koronale skiver som inneholder hjernen område (r) av interesse. Plasser kutt skive på avkjølt glass plate.
Merk: Skjær hjernen regions av interesse på et avkjølt glass plate. - For frosne vev etter disseksjon, dissekere hjernen område (r) av interesse fra stykker av ferskt ekstrahert hjerne, lik den som er beskrevet ovenfor i 2.3.1. Plasser dissekert vevet inn en microtube og raskt fryse vevet ved å senke mikrorør i -40 ºC isopentan for 20 sek. Hold dissekert vev frosset til enhver tid i en -80 ºC fryseren til videre behandling.
- For frossen vev, umiddelbart fryse ferske hentet hjernen i -40 ºC isopentan og oppbevar i en forseglet pose ved -80 ºC i inntil 6 måneder.
- På dagen for disseksjon, plasserer den frosne hjernen i en cryostat innstilt på ca -20 ºC (ikke varmere enn -18 ºC) for ca 2 timer for å stabilisere temperaturen.
MERK: Hjerner kan kuttes lett ved denne temperatur, mens mye kjøligere temperaturer gjør hjernen altfor sprø til å bli kuttet sikker måte. - Bruk barberblad for å kutte 1-2 mm koronale skiverde frosne hjerner i en cryostat. Bruk en avstumpet 12- til 16-gauge nål for å få vev slag fra disse skivene i henhold grader. Hold dissekert vev frosset til enhver tid til videre behandling.
- På dagen for disseksjon, plasserer den frosne hjernen i en cryostat innstilt på ca -20 ºC (ikke varmere enn -18 ºC) for ca 2 timer for å stabilisere temperaturen.
- For fersk dissekert vev, plasser den ferske hentet hjernen til en hjerne slicing matrise (en rottehjerne formet metallform med spor for barberblader på 1 mm intervaller) som er blitt avkjølt på is. Sette inn to eller flere forhånds kjølte barberblad inn i sporene for å kutte koronale skiver som inneholder hjernen område (r) av interesse. Plasser kutt skive på avkjølt glass plate.
- Legg 1 - 2 dråper av buffer A for å dekke det dissekerte vev før hakking. Fjerne det meste av hvit substans fra vevet ved hjelp av to barberblader for å forhindre tap av neuroner i løpet av resten av utgnidning prosessen. Ved å starte med frosset vev, og deretter tillate vevet for å tine på den kalde glassplate for ikke mer enn ett minutt før påføring av buffer A løsning.
- Hakke vevet 100 ganger i hver ortogonal retning med et barberblad på en avkjølt glassplate. Hold barberblad vertikalt på glassplaten når hakking.
MERK: Grundig hakking er kritisk for alle protokoll trinn. - Bruk barberblader for å overføre hakket vevet inn mikrosentrifugerør inneholder 1 ml kald buffer A. Snu røret 3 - 5 ganger for å keep alle hakket vev i oppløsningen.
3. celledissosiasjon
MERK: Bruk milde ende over ende blande for alle de følgende trinnene. Ikke bruk et vortex mixer og unngå luftbobler som forårsaker celleskade.
- Sentrifuger prøverørene ved 110 xg i 2 min ved 4 ° C. Kast supernatant. Langsomt tilsett 1 ml kald nylig tint Enzym-løsning (inneholdende en blanding av proteolytiske enzymer) ned langs innerveggen av mikrorør. Umiddelbart suge opp hele pelleten og forsiktig pipettere opp og ned bare fire ganger med en middels stor spiss diameter pipette for å dispergere det oppmalte vev pellet.
- Invertere mikrorør umiddelbart for å hindre pelleten fester seg til bunnen, og prøvene inkuberes med ende-over-end blanding i 30 min ved 4 o C.
- Etter enzymatisk fordøyelse vev, sentrifuger rørene ved 960 xg i 2 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og tilsett 0,6 ml kald buffer A. immediately etter tilsetning av buffer A, bruke samme pipettespissen å spre pellet ved å suge opp hele pellet og forsiktig pipettere opp og ned 5 ganger.
- Mekanisk triturer fordøyd vev og samle inn 15 ml rør ved hjelp av følgende trinn. For hver prøve, kan du bruke et eget sett med 3 brann-polert glass Pasteur pipetter med synkende diameter på ca 1,3, 0,8 og 0,4 mm knyttet til latex pærer.
- Forsiktig triturer hver prøve 10 ganger med 1,3 mm glass pipette. La prøven avgjøre i 2 min på is (rusk og udissosierte cellene vil slå seg ned til bunnen). Samle supernatanten (~ 0,6 ml) og overfør til et 15 ml konisk rør (rør 1).
- Tilsett 0,6 ml buffer En oppløsning til den gjenværende pellet. Triturer prøven 10 ganger med 0,8 mm glass pipette. La prøven betale for to minutter på isen. Samle supernatanten (~ 0,6 ml) og overføring til de samme 15 ml konisk tube # 1.
- Tilsett 0,6 ml buffer En oppløsning til den gjenværende pellet. Triturer prøven 10 ganger med 0,4 mm glass pipette. La prøven betale for to minutter på isen. Samle supernatanten (~ 0,6 ml, uten å berøre pellet med ikke-dissosiert celler) og overføring til de samme 15 ml konisk tube # 1.
MERK: Hold pipetten diameter 0,4 mm i røret # 1 for følgende Triturerings trinn. - Gjenta trinn 3.4.3 tre ganger ved anvendelse av den minste glasspipette (~ 0,4 mm diameter), og samle supernatanten i en separat 15 ml konisk rør (rør # 2).
- Triturer de oppsamlede cellesuspensjoner i rørene # 1 og # 2 til 10 ganger ved å bruke 0,4 mm glasspipette og holde på is.
4. Cell Fixation og Permeabilization
- Forbered 4 mikrorør per prøve (to mikrorør for celler fra tube # 1 og to for celler fra tube # 2) ved å tilsette 800 mL av 100% kald etanol (lagret ved -20 o C før bruk) i hvert rør og holde dem på is . Merk: Den endelige etanolkonsentrasjon vil være 50%.
- Pipetter ~ 800 ul av cellesuspensjoner (fra røret 1 og røret # 2) i hver av de 4 rør inneholdende kald etanol og invertere rør for å blande prøvene.
- Inkuber rørene på is i 15 minutter mens inverterende rørene hver 5 min.
- Etter fiksering / permeabiliseringen, sentrifugere rørene ved 1700 x g i 4 minutter ved 4 ° C og kast supernatanten. La 50 ul løsning for å hindre celletap.
MERK: pellets på dette stadiet er hvite og holde seg mindre til veggen av rørene enn før permeabilization. Derfor, fjern supernatanten forsiktig ved å berøre veggen av mikrorør der det er ingen pellet og trekke opp supernatanten langsomt ved hjelp av en mikropipette.
5. Cell Filtration
- Re-suspendere pelleten fra trinn 4.4 med kald PBS som følger:
- Legg 550 ul kald PBS til en av de to mikrorør som kommer fra røret 1, og bruker en moderat stor diameter pipette tips å forsiktig pipette cellesuspensjonen opp og ned 5 ganger. Gjenta det samme for en mikrorør kommer fra tube # 2.
- For celler fra røret 1, ved hjelp av den samme pipette, overfører den første cellesuspensjon til den andre pellet. Resuspender den andre pellet ved forsiktig pipettering den kombinerte cellesuspensjon opp og ned 5 ganger.
- For celler fra tube # 2, suspendere og kombinere pellets (dvs. tredje og fjerde mikrorør) som beskrevet i 5.1.2.
- Filtrer de to cellesuspensjoner fra trinn 5.1.2 og 5.1.3 hver for seg ved hjelp av to forskjellige par av celle siler (100 um og 40 um porestørrelse) som følger:
- Pre-våt hver celle sil ved tilsetning av PBS til innsiden av silen. Bruke en pipette for å fjerne overskudd av PBS fra utsiden av silen.
- Pipetter cellesuspensjonen fra trinn 5.1.2 jevnt på den første cellefilter med 100 um porestørrelse. Samle gjennomstrømnings i et 50 ml rør på is. Bruk pipette for å samle opp gjennom strømnings festet på yttersiden bunnen av cellen sil.
- Bruk samme pipette for å overføre gjennomstrømning fra 100 um celle sil til 40 mikrometer celle sil. Samle denne gjennomstrømning i en annen 50 ml tube på is. Ved overføring flyten gjennom fra 40 mikrometer celle sil, bytt til ny pipette tips for å unngå forurensning fra 100 mikrometer celle sil.
- Gjenta disse trinnene for cellesuspensjonen fra trinn 5.1.3 ved hjelp av et nytt sett med filtre.
- Kombinere de to gjennomstrømnings fra hver prøve for et sluttvolum på omtrent 1 ml pr prøve.
6. Inkubasjon med Antistoffer
MERK: Bruk små porsjoner av hjernecellesuspensjoner å forberede flere kontrollprøver for å sette riktig flowcytometeret innstillinger før du kjører hovedutvalget. For hvert antistoff merking, utarbeide kontrollprøver som inneholder ingen antistoffer, bare SEcondary antistoff (eller annen fluorescerende markør), og deretter både primære og sekundære antistoffer (eller andre fluorescerende markør). Bruk disse kontrollene til å angi portene som skiller spesifikk versus ikke-spesifikk merking i strømningscytometeret. Når det er mulig, bruker fluorokromer som ikke krever erstatning. Øke sluttvolum på portstyringskontrollprøver til et endelig volum på 700 ul ved tilsetning av PBS før tilsetning av de primære antistoffer.
- Forbered lys-spredning og DAPI kontrollutvalget ved å overføre en 100 mL prøve av de filtrerte cellene til en 1,7 ml mikrorør. Legg 600 ul kald PBS med 1 ug / ml DAPI for kjerner farging. Inkuber i 10 minutter med ende-over-end blanding, og vask (som indikert i trinn 6.4.2 til 6.4.5) før passering gjennom strømningscytometer.
MERK: Denne prøven blir kun brukt til å sette cellen / kjerner gate før sortering de gjenværende cellene i FACS maskinen. - Forbered enkelt immunolabeled kontrollprøver ved å overføre 100 & #181; l av de filtrerte celler til et 1,7 ml mikrorør. Legg 600 ul kald PBS med en antistoff (f.eks Neun antistoff). Legg 600 ul kald PBS til et mikrorør med et annet antistoff (f.eks Fos-antistoff). Legge til den tilsvarende sekundære antistoff hvis det ikke er en direkte-konjugert primære antistoff.
MERK: Disse prøvene blir brukt til å bestemme den riktige fotomultiplikatorrøret (PMT) spenning, og for å bedømme overlappingen av de to fluorescente signalene om nødvendig. Antistoffkonsentrasjoner bør titreres for å oppnå de beste signal-til-støy-forhold i alle kanaler. Overlappende fluorescente signalene kan også kompenseres ved intern kalibrering av ulike fluorescerende kanaler i strømningscytometer. - Fremstille dobbelt fluorescent-merkede negativ kontrollprøve ved å overføre 100 ul av de filtrerte celler til et 1,7 ml mikrorør. Legg 600 ul kald PBS med de sekundære antistoff alene eller IgG direkte konjugerte primære antistoffer.
MERK: This kontrollprøve kan brukes hver gang før sortering for å finne ut bakgrunnen fluorescens for hver fluorophore. - Forbered hovedutvalget skal sorteres.
- Overfør 700 mL av de filtrerte cellene inn i en 1,7 ml mikrorør. Legg 7 pl (1: 100) av primær Fos antistoff konjugert direkte til Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) og 1,4 pl (1: 500) av primær Neun antistoff konjugert direkte til Phycoerythrin (anti-Neun-PE). Inkuber rørene i 30 minutter ved 4 ° C med ende-over-end blanding.
- Ved slutten av inkuberingen, tilsett 800 ul kald PBS til hvert mikrorør, inkludert de viktigste prøven og kontrollprøvene, og bland ved inversjon.
- Sentrifuger mikrorør på 1300 xg i 3 min ved 4 ºC. Kast supernatanten og etterlater 50 ul supernatant for å forhindre celletap.
- Tilsett 1 ml kald PBS til pellet og resuspender cellene ved hjelp av en pipette med en moderat stor spiss diameter.
- Sentrifuger ved 1300 x g i 3 min ved 4 ° C. Discard supernatanten.
- Re-suspendere pelleten i 500 ul kald PBS (justere sluttvolumet, avhengig av størrelsen av pelleten).
- Overføring og filtrere suspensjonen inn i en rundbunnet FACS prøverør med et cellefilter hette (40 um). Hold immunolabeled cellene på is og umiddelbart utføre FACS. Merk: For filtrering, trykker pipettespissen vertikalt på silen hetten og skyv cellesuspensjonen gjennom den.
- Sett flowcytometer portene ved hjelp av kontrollprøver.
- Bruk lysspredende og DAPI kontrollprøve for å identifisere den nevronale cellepopulasjon fra de totale hendelser og cellulært avfall.
MERK: Celle organer i dette preparatet er bare 1-2% av de totale hendelser (resten er rusk og ødelagte cellulære prosesser). Basert på DAPI fluorescerende signal (som indikerer kjerner) og Forward scatter (størrelsen på cellen) er det mulig å finne celle organer og gate bakover basert på forover og side lys-spredning egenskapercellene (som vist i figur 1 A, B). - Bruk enkle immunolabeled kontrollprøver for å bestemme PMT spenningsinnstillinger, og å analysere ringvirkninger av utslipp fra en bestemt fluorochrome inn i et annet filter / kanal (f.eks Alexa Fluor 488 / FITC eller Phycoerythrine). Hvis fluorescerende signaler overlapper, korrigere overlapping ved å justere lønninger manuelt.
- Bruk dobbel fluorescerende-merket negativ kontroll for å sette opp terskelen for den positive befolkningen.
MERK: signal som kommer fra denne prøven er antatt å være på grunn av auto-fluorescens og cellene i hoved prøven som befinner seg over denne terskelen kan betraktes som positiv. Typisk terskelparametrene for sortering er strengere, og omtrent den øverste 2/3 av de merkede cellene ovenfor den negative kontroll faktisk sorteres.
- Bruk lysspredende og DAPI kontrollprøve for å identifisere den nevronale cellepopulasjon fra de totale hendelser og cellulært avfall.
- Sorter nervecellene fra hovedutvalget ved FACS til 1,7 ml mikrorør. Utlevering av cellene i 50 ul RNAutvinning buffer. Etter sortering, Vortex og sentrifuger røret og blande oppheng ved å pipettere opp og ned 10 ganger for å gjenopprette alle sorterte cellene fra veggene i røret.
- Inkuber den sorterte cellesuspensjonen ved 42 ° C i 30 minutter for å sikre at alle cellene blir lysert før RNA-ekstrahering, og deretter sentrifuger ved 2800 xg i 2 min ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten til en RNase-frie rør for langtidslagring ved -80 ° C eller umiddelbart behandle prøven for RNA-isolering, cDNA-syntese, målgenet pre-amplifisering og qPCR, som tidligere beskrevet 13-15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sortering Fos-positive og Fos-negative nevroner fra fersk og frossen dorsal striatum vev fra enkelt rotter etter akutte metamfetamin injeksjoner.
Protokollen er beskrevet ovenfor ble anvendt for å sortere Fos-positive og Fos-negative nerveceller fra en enkelt rotte dorsal-striatum 90 minutter etter en intraperitoneal injeksjon av metamfetamin (5 mg / kg). Naive rotter i sine bur ble anvendt som kontroller. Dorsal striatum vev ble behandlet enten umiddelbart etter dens samling (frisk vev) eller behandlet etter å ha blitt frosset og lagret i -80 ° C i 1, 7 eller 21 dager. Resultatene fra disse frysing tidspunkter var ikke signifikant forskjellige fra hverandre, slik at data ble slått sammen.
For å sette opp sorterings forholdene på instrumentet, kontrollprøver (beskrevet ovenfor) fra enten hjemmeburet kontroll eller methamphetamine injisert grupper ble brukt. Når hver partikkel eller hendelse i disse prøvene passerer gjennom strømningscellen i cytometeret, de er gitt et identifikasjonsnummer som er knyttet til hendelsens lysspredning og fluorescens egenskaper og registreres i et regneark. Hendelsene i dette arket kan da være organisert i scattergrams eller tetthet tomter for disse egenskapene (figur 1). Hendelser med lignende egenskaper kan da grupperes eller "gated" av forskjellige par egenskaper som avgjør de portene som de som inneholder celler, nerveceller, eller Fos-positive nevroner. Når portene er bestemt ved bruk av kontrollprøvene som er beskrevet ovenfor, er den viktigste prøven injiseres i flowcytometer og sortert i henhold til disse porter. Cellepopulasjonen var gated fra alle hendelser (celler og debris) basert på deres fremre lysspredning (FSC, en indikasjon på partikkelens størrelse) og side lysspredning (SSC; en indikasjon på partikkelens granularity). Som vist på FSC versus SSC-prikkplott (figur 1A og 1B), tettheten tomt på alle hendelsene viser et lite homogen befolkning med tilsvarende størrelse og detaljnivå, i tillegg til en stor heterogen befolkning (figur 1A og 1B). Et lite homogen befolkning som inneholder cellelegemer ble identifisert og gated som "celler", basert på FSC og SSC egenskaper fra tidligere studier 11,13-15 og merking med DAPI. En noe større andel av celler ble oppnådd fra frosset vev (2,6%) enn fra friskt vev (1,9%). Den store heterogen befolkning er stort sett rusk, antagelig fra dendritter og aksonal prosesser.
Deretter enkeltceller fra "Celler" gate ble identifisert på grunnlag av deres størrelse, noe som ble indikert ved bredden av FSC signal for hver hendelse på x-aksen. Hendelser som var større enn enkeltceller ble ansett celleaggregater og ekskludert fra "Enkelt celle gate. Alle de påfølgende analysetrinn ble gjennomført innenfor denne" Single cell "gate (figur 1C og 1D). Flertallet av denne singelen cellepopulasjon (> 92%) var positiv for DAPI farging (data ikke vist).
Først nevronene ble identifisert basert på deres PE fluorescens intensitet som indikerte Neun-immunoreaktivitets (figur 1E og 1F). Nerveceller utgjør ca 24% av alle hendelser fra "Single celle" gate for frisk vev og 38% for frosset vev. Nesten alle av hendelsene i denne "Neuron" gate (98% i frisk vev og 99% i frossent vev) var positive for DAPI farging av DNA i cellekjerner (Figur 1G og 1H). De resterende DAPI-merket hendelser i enkeltcelle gate er Neun-negative og inkluderer gliaceller, oligodendrocytter og microglia, som bekreftes av qPCR i Figur 3.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Så nevronene ble klassifisert som Fos-positive eller Fos-negative nevroner basert på deres Alexa Fluor 647 fluorescens signal (Fos-immunoreaktivitets) I motsetning til celle-type markører, Fos. uttrykk nivåer i nevroner øker gradvis på grunn av ulik grad av nevral aktivitet og tid selvfølgelig. Derfor vil det ikke være en entydige terskel mellom Fos-positive versus Fos-negative nevroner. i det første trinnet (brukes kun for off-line analyser for å beregne prosenter av Fos-positive nevroner), definerte vi terskelen for Fos-positive nevroner basert på maksimal Alexa-647 fluorescens (for Fos) fra Neun-negative befolkningen i de naive hjem bur kontrollrottene. Fos-positive nevroner er angitt de blå firkantene fra ulike eksperimentelle forhold i figur 2 i både ferske og frosne vev, prosent Fos-positive nevroner fra metamfetamin-injisert rotter. (01.09 til 02.02%, figur 2C og 2D) var dobbelt så compared hjemmet bur rotter (0,7 til 0,8%, figur 2a og 2b).Bekrefte celle-type spesifikke gener fra FACS-sorterte cellene ved hjelp av target gen pre-forsterkning og RT-PCR.
I det andre trinnet, for å sørge for sortering av bare Fos-positive neuroner fra hoved prøve for etterfølgende mRNA analyser og reduserer innlemmelse av Fos-negative celler, ble Alexa-647 fluorescens terskel hevet slik at bare de øvre to tredjedeler av Fos -positive hendelser i de blå rutene ble sortert og samlet. Denne terskelen har minst 10 ganger høyere fluorescens (høyere Fos uttrykk per celle) enn terskelen anvendt ovenfor til å beregne prosentandelen av Fos-positive neuroner i prøvene. Fire populasjoner av celler ble sortert fra en enkelt vevsprøve, inkludert Neun-negative + Fos-negative (~ 5000 hendelser), Neun-negative + Fos-positive (varierte 25 - 83 hendelser), Neun-positive + Fos-negAtive (~ 5000 hendelser) og Neun-positive + Fos-positive (varierte 44 - 133 arrangementer for hjemmegruppen, 185 - 450 arrangementer for metamfetamin gruppe). Først ble ekspresjonen av celletypespesifikke gener i Neun-positive (inkludert både Fos-positive og Fos-negative) og Neun-negative pasienter (inkludert både Fos-positive og Fos-negativ) bekreftet (figur 3). GAPDH var brukes som referanse / husholdningsgenet, basert på resultatene fra vår forrige undersøkelse 13. For å kontrollere for forskjellige nivåer av RNA i prøven og cDNA i PCR-reaksjonene, ble duplex qPCR reaksjoner utført ved anvendelse av primere for både målgenet og GAPDH cDNA. Ct-verdier for GAPDH husholdningsgenet ble holdt mellom 15 og 31 for nøyaktige målinger. For både fersk og frossen vev, Neun mRNA nivåene var signifikant høyere (ca. 8 ganger) i Neun-positive befolkningen enn i Neun-negative pasienter (p <0.05, figur 3A GFAP (glial cellemarkør, figur 3B) og Oligo2 (oligodendrocytt-cellemarkør, figur 3C) mRNA-nivåene var større i Neun-negativ enn hos Neun-positive populasjonen (p <0,05 ). Det ble ikke observert mRNA-nivåer i den Neun-negativ populasjon, men dette var ikke statistisk signifikant, En lignende trend med høyere Iba1 (figur 3D microglial cellemarkør). Noen av prøvene inneholdt ekstremt lave nivåer av visse mRNA som ikke kan måles nøyaktig på en bestemt celletype (for eksempel, GFAP mRNA i Neun-merkede neuroner). Maksimale Ct-verdier ble definert som 35 for å eliminere verdier som var for lavt til å bli nøyaktig påvist. Høyere Ct-verdiene oversteg sikkerhetsgrense i våre qPCR analyser.
Fos mRNA uttrykk varundersøkt i Neun-positive nevronale befolkningen fra rotter som fikk en enkelt injeksjon av metamfetamin (figur 4). For både ferske og frosne vev, Fos mRNA-nivåene var større i Fos-positive neuroner enn i de Fos-negative nevroner (p <0,05). Videre, mens det var en 3-dobling av Fos mRNA i Fos-positive nevroner fra den friske vevet, en 11-dobling av Fos mRNA i Fos-positive nevroner fra den frosne vev ble oppdaget. Samlet utgjør disse mRNA resultatene bekrefter identiteten til Fos-positive nevroner, Fos-negative nevroner og ikke-nevronale befolkningen fra både fersk og frossen vev. Videre kan celletypespesifikke gener og andre gener av interesse også bli analysert fra sortert cellene under både ferske og frosne forhold.
Figur 1. gating av Disassosieres og merkede celler fra fersk og fryst Rat Dorsal striatum. The 'Cells' gate ble bestemt ved forover og sidespredningsegenskaper (AD) og bekreftet av positiv merking med kjernefysisk DAPI farging (GH). The 'Nerveceller' gate innenfor "Cells 'befolkning ble bestemt av fluorescens for Neun (PE, EF). (A - B) Cell gate: Lineær tomt på alle hendelser, basert på deres fremover scatter (X-aksen, celle størrelse) og side scatter (Y-aksen, detalj). (C - D) enkeltceller gate: Lineær plott av forover spredning høyde (Y-aksen) og bredde (X-aksen) i cellen porten vist i AB. (E - F) Neuron gate: Logaritmisk tomt på immunfluorescens for PE-merket Neun (Y-aksen) i enkeltceller gate vist på CD avslører nevroner i den øvre klynge av hendelser og ikke-nevronale celler i nedre klyngen. (G H) Nuclei farging: Logaritmisk tomt på fluorescens for DAPI-merket kjerner (Y-aksen) innenfor nevroncelledød gate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. gating av Fos-positive og Fos-negative Nerveceller fra fersk og fryst Rat Dorsal striatum Basert på Double Merking for Neun og Fos. Den ferske og frosne dorsal striatum fra rotter (tatt direkte fra sine hjem bur eller 90 min etter en enkelt intraperitoneal injeksjon av metamfetamin) ble skilt og merket med direkte konjugert antistoff mot Neun og Fos og sortert ved hjelp av en FACS maskin. Sortering var basert på fysoerytrin (PE) -merket Neun immunfluorescens (X-aksen) og Alexa 647-merket Fos immunofluorescence (Y-aksen). Fos-positive (blå prikker) og Fos-negative (røde prikker) nevronene ble plassert i øvre og nedre høyre kvadrant, henholdsvis. Dot tomter viser Neun-positive celler (nevroner) og Neun-negative celler (grå prikker); de blå firkantene indikerer nevroner med oven terskel Fos uttrykk. (A - B) Hjem gruppe: naive rotter tatt direkte fra sine hjem bur. (C - D) Metamfetamin gruppe: rotter som fikk engangs injeksjoner av metamfetamin. Tersklene for Fos-positive nevroner ble valgt til å være like over maksimal Alexa-647 fluorescens (Fos-IR) observert for Neun-negative celler i hjemmeburet kontrollgruppen. Mens 0,7 til 0,8% av nevronene er Fos-positive i hjemmet gruppe, 1,9 til 2,2% av nevronene er Fos-positive i metamfetamin-gruppen.
Figur 3. Cell-type spesifikke genuttrykk i FACS-sortert Celler fra fersk og fryst Rat Dorsal striatum. Neun-positive nevroner (Fos-positive og Fos-negative) og Neun-negative celler (Fos-positive og Fos-negative) ble sortert ved hjelp av den beskrevne protokoll og mRNA-ekspresjonsnivåene av celletypespesifikke gener ble anvendt til å bekrefte cellesortering. (A) Neun er en markør for nevronale celler. (B) GFAP er en markør for gliaceller. (C) Oligo2 er en markør for oligodendrocytt-celler. (D) Iba1 er en markør for mikrogliale celler. For Neun mRNA, blir data presentert som gjennomsnitt ± SEM av verdier fold i forhold til uttrykk nivåer i Neun-negative celler fra friskt vev (n = 9 - 14). For GFAP (n = 6-12), Oligo2 (n = 9 - 11) og Iba1 (n = 5-8) mRNA, data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av verdier fold i forhold til ekspresjonsnivåer i NeuN-positive celler fra friske vevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Fos mRNA nivåer i FACS-sortert Nerveceller fra friske eller frosne Rat Dorsal striatum etter Metamfetamin Injection. Fos-positive og Fos-negative nevronene ble sortert som beskrevet i protokollen over og mRNA nivåer av Fos ble bekreftet. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av verdier fold i forhold til uttrykk nivåer i Fos-negative nerveceller fra friske vev (n = 3 - 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FACS kan brukes til å sortere nevroner og andre celletyper fra enten friske eller frosne voksen hjernevevet. Som nevnt i innledningen, muligheten til å bruke frosne vev tillater optimal utnyttelse av prøver fra dyr som har gjennomgått kompliserte og langvarige atferdsmessige prosedyrer, slik som selvadministrering og tilbakefalls studier i avhengighet forskning. Disse atferdsmessige fremgangsmåtene tar vanligvis 1 - 2 timer eller lenger, og krever at alle dyrene (10 - 20 totalt) bli testet på den samme dag 13,18. Det tar ~ 4 timer å behandle 4 ferske dissekerte hjerne vevsprøver, som inkluderer hjernen disseksjon, celledissosiasjon, permeabilization og immunolabeling. Etter behandling, sortering hver prøve ved hjelp av FACS tar mellom 20 - 30 For min. Det siste trinnet av oppvarming av de sorterte cellene i lysis buffer krever ytterligere 30 min. I alt ~ 7 timer er nødvendig fra hjernen disseksjon til den endelige RNA-inneholdende cellelyseringsløsning trinn. Imidlertid er det nå mulig å fryse hele brains eller fersk dissekert av hjernen umiddelbart etter testing, og behandle dem senere. Dette forenkler testingen og tillater flere hjerneområder for å bli sortert på en annen dag. Frysing vevet før FACS kan også forbedre resultatene. Mer Neun-positive nevroner er hentet fra frosne vevsprøver. Dette kan delvis forklares ved økt Neun-merking på grunn av forstyrrelser av cellemembraner i løpet av frysing og påfølgende opptining, noe som ville øke antistoff adgang til intracellulære proteiner som Neun og Fos. Lignende effekter har blitt observert med fibroblast, epitelceller og HeLa celler 19.
Utbyttet av celler og nevroner kan maksimeres ved å gjøre følgende. Under disseksjon av vevet, fjerne mesteparten av hvit substans (corpus callosum og anterior commissure for dorsal striatum og nucleus accumbens, henholdsvis). Dette forhindrer vev fra å feste seg til plast tips og glass pipetter i den påfølgende steps. Bruk Buffer A (se spesifikasjon i tabell over Materialer og reagenser) for å holde dissekert vev dekket. Dette forbedrer kvaliteten av cellene under hakking av vevet med barberbladet (trinn 2.5). Den ekstra sett av 3 Triturerings trinn med den minste glasspipette (trinn 3,9) og etterfølgende filtrering med et andre sett av cellesiler (trinn 5) også fungerer utbyttet av celler og nevroner. Gjenbruk av celle siler vil tette filtre og lavere celle yield. Vær forsiktig med cellene når resuspending pellets og ved gnidning. Bruken av en moderat stor pipettespiss i løpet av denne fremgangsmåten vil redusere celleskader på grunn av skjærspenning. se pellet forsiktig når du fjerner supernatanten etter permeabilization med etanol (trinn 4.4). Pelleten er mindre kompakt og kan bli distribuert langs veggen til det mikrosentrifugerør. Grove beregninger tyder på at utbyttet av Fos-positive neuroner er omtrent 10% av utgangs-nummeret i dissekert striatale vevsprøve. Den nåværende protokollen kan bli endret for å passe andre eksperimentelle mål. I dagens protokollen, ble vev samlet 90 min etter metamfetamin injeksjoner fordi Fos uttrykk når maksimal nivå på denne tiden, noe som er avgjørende for effektiv sortering av Fos-uttrykke nevroner. Imidlertid kan bli samlet vev som helst punkt for FACS, avhengig av det spesifikke mål av forsøket. For første vevsprøve lagring, har vi med hell brukt fersk dissekert vev, frosset vev etter disseksjon, eller frosset vev dissekert fra fryst hel hjerne å isolere Fos-uttrykke nevroner ved bruk av FACS fulgt av qPCR analyse av genuttrykk. For fiksering og permeabiliseringen, varigheten og temperaturen i denne protokoll (4 ° C i 15 minutter) ble optimalisert for å permeabilisere både cytoplasmiske og kjernefysiske membraner, så vel som for å løse vev. Variasjoner i varighet og / eller temperatur kan endre de endelige resultatene. Andre festeløsninger som paraformaldehyde og ikke-ioniske vaskemidler som saponin, som har jobbet for embryonale og post-natal nevroner 20, kan også arbeide for nerveceller fra voksen hjerne. Videre kan myelin fjerning perler anvendes som en modifikasjon av den aktuelle protokoll som vist nylig for FACS fra hjernevev 21.
Den nåværende protokollen har to viktige begrensninger for å vurdere. For det første er denne protokollen ikke egnet for å detektere celle fenotype markører som blir uttrykt primært i synapser (f.eks, dopamin eller glutamatreseptorer) fordi disse cellulære prosesser blir fjernet fra cellelegemene i løpet av Triturerings og dissosiasjon trinn. En annen mulig begrensning er at RNA-lengder som oppnås fra FACS-sorterte cellene ikke kan være tilstrekkelig for alle RNA-analysemetoder. RNA integritet nummer (RIN) for RNA oppnådd fra FACS-sortert celler er mellom 3.5, 2.5, tilsvarende kortere gjennomsnitts RNA lengder. Her ble det korteste RNA-størrelse kompensert avved hjelp av relativt korte qPCR amplikonene av 80-100 bp, som beskrevet tidligere 13-15. Vi har også brukt disse kortere lengde RNA hell for microarray analyse 11. Ikke desto mindre, kan korte RNA-lengder som oppnås ikke være tilstrekkelig for alle RNA-analysemetoder. Det bør understrekes at PCR-primere som spesifikt målrettet exon-ekson veikryss finnes bare i fullt spleiset mRNA i cytosol ble anvendt. Disse primere oppdager ikke intron-inneholdende RNA fra kjernen. Videre har vi tidligere har brukt denne protokoll med antistoffer og friskt hjernevev for å detektere tyrosinhydroksylase i cytosol og D1 dopaminreseptorer i den cellulære membran 10. Påvisning av disse cytosoliske og cellemembranmarkører indikert at dissosiasjonen fremgangsmåte frembringer stort sett intakte celler, og ikke bare kjerner.
Samlet sett åpner FACS isolering av nerveceller fra frosne prøvene opp andre programmer. Ingen forskjeller i sorterings eller genet EXPREssion ble observert (data ikke vist) når prøvene ble lagret 3 dager eller 3 uker ved -80 ºC. Tre uker er en rimelig tid til å sortere alle prøver fra en bestemt eksperiment (20 - 40 prøver) og isolere RNA for genekspresjon. Brukbare RNA har også blitt erholdt fra hjernevev som er lagret i 6 måneder ved -80 ° C (data ikke vist her). Dermed kan denne protokollen være nyttig for FACS isolering av obduksjons frosne menneskelige hjerne prøver som ble lagret i flere måneder eller år.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
References
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
- Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
- Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
- Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R.
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
- Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
- Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
- US National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
- Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
- Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
- Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).
