Summary
Burada taze ve dondurulmuş hem de beyin dokusundan nöronal topluluklarından Fos-ifade moleküler değişiklikler incelemek için bir Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) protokol mevcut. dondurulmuş doku kullanımı değerli hayvan deneklerin kullanımını maksimize için birden fazla seans boyunca birçok beyin bölgelerinin FACS izolasyonu sağlar.
Abstract
nöroplastisite ve öğrenilmiş davranışların moleküler değişikliklerin çalışma dernekleri öğrenilen aracılık eden nöronal topluluklar olarak adlandırılan seyrek dağıtılan aktif nöronların spesifik setleri çalışmaya tüm beyin bölgelerinin çalışma geçiyor. (FACS) Kontrol THP-en son yetişkin fare beyin dokusu için optimize edilmiş ve nöronal marker NeuN ve fos protein güçlü aktif nöronların belirteci karşı antikorlar kullanılarak aktif nöronların izolasyonu izin verildi. Şimdiye kadar, Fos salgılayan nöronların ve diğer hücre tipleri uzun işlem günü ve uzun ve karmaşık davranış işlemlerinden sonra değerlendirilir beyin örnekleri izin çok kısıtlı gerektirdiği taze doku, izole edilmiştir. 21 gün - Burada dorsal striatum nöronlar ve Fos mRNA Fos-ifade verimleri 3 -80 ºC de donduruldu taze disseke doku ve doku arasındaki benzer olduğunu gördük. Buna ek olarak, fenotip teyitdondurulmuş doku, aynı zamanda, FACS izolasyonu için kullanılabileceğini gösterir nöronal değerlendirmek gen ifadesi (NeuN), astrositik (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) ve microgial (Iba1) işaretleri ile NeuN-pozitif ve NeuN negatif kriteri hücrelerin glial hücre türleri. Genel olarak, toplamak incelemek ve birden FACS oturumları için beyin dokusu dondurmak mümkün. Bu genellikle uzun ve karmaşık davranışsal prosedürleri geçirmiş değerli hayvan deneklerden elde edilen verilerin miktarını en üst düzeye çıkarır.
Introduction
öğrenme sırasında, hayvanlar son derece spesifik uyaranların karmaşık setleri arasındaki ilişkileri oluşturmaktadır. Bu yüksek çözünürlüklü bilgi nöronal topluluklar olarak adlandırılan seyrek dağıtılan nöronların belirli kalıpları içinde değişikliklerle tarafından kodlanan olduğu düşünülmektedir. Nöronal toplulukları son zamanlarda güçlü davranış veya isteka pozlama sırasında aktive edildi gibi Fos, Arc ve Zif268 ve nöronlarda protein ürünleri gibi hemen erken genlerin (Bacaklarını) indüksiyonu ile tespit edilmiştir. Özellikle içerik ve işaret özgü öğrenilen davranışlar 1-4 nedensel rol oynadığı gösterilmiştir nöronlar Fos-dile getirdi. Bu nedenle, bu aktive Fos-ifade nöronlar içinde benzersiz moleküler neuroadaptations madde bağımlılığı ve post-travmatik stres bozukluğu (TSSB) 5 normal öğrenme ve anormal öğrenme bozuklukları sırasında oluşan dernek, öğrenilen enkode nöral mekanizmalar için en iyi adaylardır.
Fluorescence Aktif Hücre Sıralama (FACS) son zamanlarda Fos-ifade nöronlar içinde benzersiz moleküler neuroadaptations analizi izin verdi. Flow sitometri ve hücre kendi ışık saçılması ve immunofluorescent özelliklerine göre hücre karakterize ve izole etmek için 1960 6,7 geliştirilmiştir sıralama ve uzun immünoloji ve kanser araştırmalarında kullanılmaktadır. Ancak akım sitometri ve FACS yetişkin beyin dokusundan elde etmek zordur ayrışmış tek hücreleri gerektirir. FACS birinci antikor etiketleme 8,9 gerektirmeyen transjenik farelerden striatal nöronlar -expressing izole etmek ve (GFP) yeşil floresan protein analiz etmek için kullanıldı. Bu izole edilmesi ve vahşi tip hayvanlara 11-15 ilaç ve / veya ipuçları ile aktive nöronlar Fos eksprese eden moleküler değişikliklerin değerlendirilmesi için antikor bazlı FACS metodu ile 10 geliştirilmiştir. güçlü nöronlar aktive ederken, bu yöntemde, nöronlar, genel nöronal belirteç neun karşı bir antikor ile etiketlenirFos karşı bir antikor ile etiketlenir. Başlangıçtaki yöntem, taze doku için örnek başına 10 sıçan havuzu gerekli olsa da, bir protokolün takip eden değişiklikler tek sıçan 13-15 ayrık beyin alanlarının Fos salgılayan nöronların ve kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) analizi FACS izole izin . Genel olarak, eşsiz moleküler değişiklikler bağımlılığı araştırma 12,14,15 yılında bağlam ve işaret aktive davranışlar çeşitli sırasında aktive nöronlar Fos-ifade bulundu.
Taze doku üzerinde FACS performans ile büyük lojistik sorun FACS ile doku ve süreci ayırmak bir bütün gün sürer olmasıdır. Buna ek olarak, sadece dört numune günde işlenebilir. Bu, genellikle tek bir beyin bölgesi Her beyinden gelen değerlendirilebilir ve kalan beyin bölgeleri iptal edilmesi gerektiği anlamına gelir. Bu tür öz-yönetim ve nesli trai gibi düşük verimlilik davranışsal işlemler için önemli bir sorundurcerrahi ve yoğun bir eğitim birçok hafta gerekir ning. Bundan başka, test gününde, uzun ve karmaşık bir davranış işlemler zor aynı gün FACS yapılmasını kolaylaştırır. Bu önemli bir avantaj hemen davranışsal test ettikten sonra hayvanlardan beyinleri dondurmak mümkün olacak, ve sonra araştırıcının seçeceği farklı zamanlarda bir veya birden fazla beyin bölgelerinden Fos-ifade nöronlar izole olacaktır.
Burada biz, FACS protokolü taze ve dondurulmuş, her iki beyin dokusundan Fos salgılayan nöronların (ve diğer hücre tipleri) izole etmek için kullanılabileceğini gösterir. Bir örnek olarak, akut metamfetamin enjeksiyondan sonra ve enjeksiyonlar (kontrol koşulu olmadan) naif sıçanların sıçan striatum nöronları Fos-ifade izole. Bununla birlikte, bu FACS protokolü bir davranış ya da farmakolojik tedavi sonrası kullanılabilir. Bizim örneklerin sonraki qPCR analizi bu hücre tiplerinden gen ifadesi simi ile değerlendirilebilir olabileceğini belirttitaze ve dondurulmuş hem dokudan lar verimliliği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bütün deneyler Laboratuvar hayvanlarında 16 Bakımı ve Kullanımı için Sağlık Rehberi National Institutes of Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) göre gerçekleştirilmiştir.
Not: Aksi belirtilmediği sürece, buz üzerinde tutulmuştur kullanımı, düşük bağlanma santrifüj tüpleri aşağıdaki tüm adımları.
Doku Koleksiyonu önce 1. Hazırlık
- 4 o C santrifüj ayarlayın
- Yangın lehçe azalan yaklaşık 1.3 çapları, 0.8, ve her bir numune için 0.4 mm üç cam Pasteur pipetler bir dizi.
- Soğuk Tampon A 1 ml içeren etiketli 1.7 ml-tüpler hazırlayın ve buz üzerinde tüpler tutun.
- Matris, spatula ve diseksiyon gerçekleştirmek için cam plakalar (ya da ters cam Petri kabı) dilimleme beyin içeren bir buz tepsisi hazırlayın. t dokunma bütün aletleri kuru cam plakalar ve kullanım dokuları kağıt üzerinde ön soğuk iki veya daha fazla tıraş bıçağıkonu.
- Doku toplanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) enzim solüsyonu çözülme.
2. Doku Toplama ve Diseksiyon
- Doku toplamadan önce davranışsal ya da farmakolojik tedavi 90 dakika başlatın.
NOT: Burada gösterilen sonuçlar için, yeni bir ortama (test koşulu) ve naif sıçanlarda fareler üzerinde 5 mg / kg metamfetamin akut periton enjeksiyonlar evlerinde kafeslerde (kontrol koşulu) muhafaza yapıldı. - Doymuş izofluran ile bir cam kurutucu kavanoza koyarak sıçan anestezisi ve sıçan 30 decapitate - 60 sn sonra bir giyotin kullanarak.
kafa deri ve kas çıkarın ve kafatası açığa çıkarmak için makas kullanın. kafatası kesti ve foramen magnum açmak ve kafatasının arka kısmı kaldırmak için rongeurs kullanın. beyin ortaya çıkarmak için kafatasının üst kenarları boyunca kesmek için rongeurs kullanın. beyin zarar vermemek için dikkatli olun. nazikçe bir altında kepçe için küçük bir spatula kullanınbeyin yükseltmek d. Beyin yükseltmek ve beyin 17 serbest kalıncaya kadar sinirleri kesti. - Jilet kullanarak doku teşrih.
NOT: Aşağıdaki yöntemlerden birini kullanarak doku örneklerinin elde edilmesi: (2.3.1) taze disseke doku; diseksiyonu sonrası (2.3.2) dondurulmuş doku; veya (2.3.3) dondurulmuş doku dondurulmuş tüm beyin disseke. Diseksiyon boyunca beyin dilimleme matrisi, jilet ve cam plaka kuru tutun ve yoğunlaştırılmış su gibi süreçleri kıyma hücrelerin hipotonik lizizi yol açabilir. Doğru diseksiyon sağlamak için gözlük büyüteç kullanın.- Taze parçalara doku için, buz üzerinde soğutulmuş olan bir beyin dilimleme matrisi (1 mm aralıklarla traş makinesi bıçaklarının yuvaya sahip bir fare beyni şeklinde bir metal kalıp) içine yeni çekilmiş beyin yerleştirin. Çevrede beyin bölgesini (ler) ihtiva koronal dilimleri kesmek için yuvalarına iki veya daha fazla önceden soğutulmuş Jilet yerleştirin. soğutulmuş cam plaka üzerinde kesik dilimler yerleştirin.
Not: beyin regio teşrihsoğutulmuş cam plaka üzerinde ilgi ns. - Diseksiyon sonra dondurulmuş doku için, 2.3.1, yukarıda tarif edilene benzer yeni çekilmiş beyin, dilim ilgi beyin bölgesi (ler) incelemek. bir mikrotüp içine disseke doku yerleştirin ve hızla 20 saniye boyunca -40 ºC izopentan içinde mikrotüp daldırarak doku dondurma. fazla işlem kadar -80 ºC derin dondurucuda her zaman dondurulmuş doku disseke tutun.
- Dondurulmuş doku için, hemen 6 aya kadar -80 ° C'de mühürlü bir torba içinde -40 ºC isopentane ve mağaza yeni çekilmiş beyin dondurmak.
- Diseksiyon gününde, yaklaşık ayarlanmış bir kriyostat içinde donmuş beyin koyun -20 ºC (hayır sıcak -18 den ºC) yaklaşık 2 saat boyunca sıcaklığını dengelemek için.
NOT: çok soğuk sıcaklıklar güvenli kesilecek beyin çok kırılgan yaparken Brain, bu sıcaklıkta kolaylıkla kesilebilir. - 2 mm koronal dilim - 1 kesmek için jilet kullanınBir kriyostat içinde donmuş beyinleri. donma koşulları altında bu dilim doku yumruklar elde etmek için bir körelmiş 12- 16-gauge iğne kullanın. daha fazla işlem kadar her zaman dondurulmuş doku disseke tutun.
- Diseksiyon gününde, yaklaşık ayarlanmış bir kriyostat içinde donmuş beyin koyun -20 ºC (hayır sıcak -18 den ºC) yaklaşık 2 saat boyunca sıcaklığını dengelemek için.
- Taze parçalara doku için, buz üzerinde soğutulmuş olan bir beyin dilimleme matrisi (1 mm aralıklarla traş makinesi bıçaklarının yuvaya sahip bir fare beyni şeklinde bir metal kalıp) içine yeni çekilmiş beyin yerleştirin. Çevrede beyin bölgesini (ler) ihtiva koronal dilimleri kesmek için yuvalarına iki veya daha fazla önceden soğutulmuş Jilet yerleştirin. soğutulmuş cam plaka üzerinde kesik dilimler yerleştirin.
- kıyma önce disseke doku kapsayacak şekilde Tampon A 2 damla - 1 ekleyin. toz haline getirme işleminin geri kalanı boyunca nöronların kaybını önlemek için iki Jilet kullanarak dokudan beyaz maddenin en kaldırın. Dondurulmuş doku ile başlayan, sonra doku tamponu çözeltisi uygulanmadan önce en fazla 1 dakika boyunca soğuk bir cam plaka üzerine çözülme sağlar.
- soğutulmuş bir cam plaka üzerine bir jilet ile dokuya her ortogonal yönde 100 kez kıyma. kıyma zaman cam plaka dikey jilet tutun.
NOT: Kapsamlı kıyma tüm protokol adımları için kritik öneme sahiptir. - ke 5 kez - tüpü 3 ters çevirin soğuk Tampon A 1 ml içeren mikrosantrifüj tüpler içine kıyılmış doku aktarmak için Jilet kullanınçözelti içinde tüm kıyılmış doku ep.
3. Hücre Ayrılma
NOT: Aşağıdaki adımların tümünü karıştırma ucuna kullanın nazik sonu. Bir girdap karıştırıcı kullanın ve hücre hasarına neden hava kabarcıkları kaçının.
- 4 ° C'de 2 dakika süreyle 110 xg'de örnek tüplerini santrifüj. Süpernatantı atın. Yavaş yavaş mikrotüp iç duvar aşağı soğuk taze çözülmüş enzim solüsyonu (proteolitik enzimlerin bir karışımını ihtiva eden) bir 1 ml. Hemen kıyılmış doku pelet dağıtmak için bir orta büyük uç çapı pipet ile sadece 4 kez yukarı pipet ve yavaşça tüm pelet emmek ve.
- Alt yapışmasını pelet önlenmesi ve 4 O ° C'de 30 dakika boyunca son aşırı uç karıştırma ile örnekleri inkübe hemen mikrotüpler Invert
- Enzimatik Doku sindirimi sonra, santrifüj 4 ° C'de 2 dakika boyunca 960 xg'de borular. Süpernatantı ve soğuk tampon A immediatel 0.6 ml ilavey Tampon A ekledikten sonra, aşağı 5 kez tüm pelet emme pelet dağıtmak için aynı pipet kullanın ve nazikçe yukarı pipet ve.
- Mekanik sindirilmiş doku çiğnemek ve aşağıdaki adımları uygulayarak 15 ml tüpler toplamak. Her numune için, lateks ampul takılı yaklaşık 1.3, 0.8 ve 0.4 mm çapları azalan 3 yangın cilalı cam Pasteur pipetler ayrı bir kümesi kullanın.
- Yavaşça her bir numune 1.3 mm cam pipet ile 10 kez çiğnemek. Numune (dibe olacak enkaz ve ayrışmamış hücreler) buz üzerinde 2 dakika süreyle dinlendiriniz. 15 ml konik tüp süpernatant (~ 0.6 ml) ve transfer toplayın (tüp # 1).
- Kalan pelet bir çözeltisi ml Tampon 0.6 ekleyin. örneklemin 0.8 mm cam pipet ile 10 kez Karışım. Numune buz üzerinde 2 dakika süreyle dinlendiriniz. Aynı 15 ml supernatant (~ 0.6 mi) ve transfer toplamak konik tüp # 1.
- Kalan Pelle A çözüm ml Tampon 0.6 Eklet. örneklemin 0,4 mm cam pipet ile 10 kez Karışım. Numune buz üzerinde 2 dakika süreyle dinlendiriniz. (Non-ayrışmış hücreleri ile pelet dokunmadan ~ 0.6 ml) ve aynı 15 ml konik tüp içerisinde 1. transfer süpernatant toplayın.
NOT: Aşağıdaki toz haline getirme adımları için tüp 1. 0,4 mm çaplı pipet tutun. - Adımı tekrarlayın 3.4.3 ayrı 15 ml konik tüp içine üç tane daha küçük cam pipet (~ 0.4 mm çap) kullanılarak kez ve süpernatant toplamak (tüp # 2).
- 0,4 mm cam pipet kullanarak 10 daha fazla kez tüpler # 1 ve # 2 toplanan hücre süspansiyonları çiğnemek ve buz üzerinde tutmak.
4. Hücre Sabitleme ve Permeabilization
- % 100 soğuk etanol 800 ul ekleyerek (tüp # 2 hücreleri için tüp # 1 hücreleri için iki mikrotüpleri ve iki) numune başına 4 mikrotüpleri hazırlayın Her tüpe (kullanımdan önce -20 o C'de saklanır) ve buz üzerinde saklayın . Not: Nihai etanolkonsantrasyon% 50 olacaktır.
- Pipet ~ 800 soğuk etanol ihtiva eden 4 tüpün her birine (tüp # 1 ve boru # 2) hücre süspansiyonları ul numune karıştırmak için tüpler ters.
- tüpler her 5 dakika ters çevirici kadar 15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin.
- sabitleme / permeabilization sonra, 4 ° C'de 4 dakika boyunca 1.700 xg'de tüpler santrifüj ve supernatant atın. hücre kaybını önlemek için bir çözüm 50 ul bırakın.
NOT: Bu aşamada pelet beyaz ve permeabilization daha önce tüplerin duvarına daha az sopa. Bu nedenle, hiçbir pelet olduğu yerde mikrotüpte duvarını dokunarak dikkatlice süpernatant kaldırmak ve yavaş yavaş bir mikropipet kullanarak süpernatant hazırlar.
5. Hücre Filtrasyon
- aşağıdaki gibi soğuk PBS ile adım 4,4 pelet yeniden askıya:
- Tüp # 1 gelen iki mikrotüplerdeki birine soğuk PBS 550 ul ekleyin ve bir orta büyük çaplı pi kullanınPette ucu hafifçe hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı 5 kez pipet için. bir mikrotüp tüp 2. gelen için tekrarlayın aynı.
- Aynı pipet kullanılarak tüp # 1 hücreleri için, ikinci bir pelet ilk hücre süspansiyonu aktarın. yavaşça kombine hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı 5 kez pipetleme ikinci pelletini.
- Tüp # 2 hücreleri için, tekrar süspansiyon ve 5.1.2'de tarif edildiği gibi peletler (örneğin, üçüncü ve dördüncü mikrotüpler) birleştirir.
- ayrı ayrı hücre süzgeçler iki farklı çift (100 um ve 40 mikron gözenek boyutları) aşağıdaki gibi kullanarak adım 5.1.2 ve 5.1.3 iki hücre süspansiyonları Filtre:
- süzgeç içine PBS eklenerek ön ıslak her hücre süzgeç. süzgeç dışından aşırı PBS kaldırmak için bir pipet kullanın.
- eşit 100 mikron gözenek büyüklüğüne sahip ilk hücre süzgecinden üzerine adım 5.1.2 hücre süspansiyonu pipetle. Buz üzerinde 50 ml bir tüp içinde akış yoluyla toplayın. pi kullanınhücre süzgecinden dış yan altındaki ekli aracılığıyla Pette, akış toplamak.
- 40 mikron hücre süzgecinden 100 mikron hücre süzgecinden gelen akış yoluyla aktarmak için aynı pipet kullanın. buz üzerinde bir 50 ml tüp bu akış yoluyla toplayın. 40 mikron hücre süzgecinden gelen akışı aktarırken, 100 mikron hücre süzgecinden gelen kirlenmesini önlemek için yeni pipet uçları değiştirin.
- filtre yeni bir dizi kullanarak adım 5.1.3 hücre süspansiyonu için bu adımları yineleyin.
- Numune başına yaklaşık 1 ml 'lik bir son hacim, her numuneden iki akış-through birleştirin.
Antikorlar 6. inkübasyon
NOT: önce ana örneği çalıştırmak için ayarlarda sitometresinde uygun akış ayarı için çoklu kontrol örnekleri hazırlamak için beyin hücre süspansiyonları az miktar kullanın. Her bir antikor etiketleme için, herhangi bir antikor, sadece kendisini de içine kontrol örnekleri hazırlamakDaha sonra condary antikoru (ya da diğer floresan etiket), ve her ikisi de birincil ve ikincil antikorlar (ya da diğer floresan etiket). Akış sitometresindeki spesifik olmayan etiketleme karşı spesifik ayrı kapıları ayarlamak için bu denetimleri kullanın. Mümkün olduğunda, tazminat gerekmez fluorochromes kullanın. , birincil antikorlar ilave edilmeden PBS eklenerek 700 ul'lik nihai bir hacme kadar yolluk kontrol örnekleri nihai hacmi arttırır.
- 1,7 mL'lik bir mikro filtre hücre 100 ul numune aktarılarak ışık saçılma ve DAPI kontrol örneği hazırlayın. çekirdek boyama için 1 ug / ml DAPI ile soğuk PBS 600 ul ekle. sonu aşırı uç karıştırma ile 10 dakika süre ile inkübe ve (adım 6.4.5 6.4.2 de gösterildiği gibi) akış sitometresi boyunca geçirilmeden önce yıkayın.
Not: Bu örnek sadece FACS makinede kalan hücrelerin sıralama önce hücre / çekirdekler kapısı ayarlamak için kullanılır. - 100 & # aktararak tek imüno kontrol örnekleri hazırlayın181; 1.7 mi mikrotüp filtre hücrelerin l. (Örneğin, NeuN antikoru) bir antikor ile soğuk PBS 600 ul ekle. Başka bir antikor (örneğin, Fos antikoru) bir mikrotüp soğuk PBS 600 ul ekle. Bu doğrudan konjüge edilmiş primer antikor değilse gelen ikincil antikor ekleyin.
NOT: Bu numuneler uygun photomultiplier tüp (PMT) voltajı belirlemek için, ve gerekirse iki floresan sinyallerin çakışmasını değerlendirmek için kullanılır. Antikor konsantrasyonu tüm kanallarda iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için titre edilmelidir. Çakışan floresan sinyalleri de akış sitometresi içinde farklı floresan kanalların iç kalibrasyon telafi edilebilir. - 1,7 mL'lik bir mikro filtre 100 ul hücre aktarılarak, çift flüoresan etiketli negatif kontrol numunesi hazırlanır. Tek başına ikincil antikorlar veya IgG doğrudan konjuge primer antikorlar ile soğuk PBS 600 ul ekleyin.
NOT: This kontrol numunesi her fluorofor için background fîoresanını tespit etmek sıralamadan önce her kullanılabilir. - Ana örnek hazırlayın sıralanacak.
- 1.7 ml'lik mikrotüp içine süzülmüş hücrelerin 700 ul aktarın. Birincil NeuN antikorun Fikoeritrin (anti-NeuN-PE) ile doğrudan konjüge edilmiş: Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) ve 1.4 ul (500 1) ile doğrudan konjüge edilmiş primer Fos antikorun: 7 ul (100 1) ekleyin. sonu aşırı uç karıştırma ile 4 ° C 'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- İnkübasyonun sonunda, ana numunesi ve kontrol örnekleri dahil olmak üzere, her bir mikrotüp soğuk PBS 800 ul ve çevirerek karıştırın.
- Santrifüj mikrotüpler 4 ° C'de 3 dakika boyunca 1.300 xg'de. hücre kaybını önlemek için 50 ul süpernatant bırakarak süpernatant atın.
- orta derecede büyük bir uç çapı olan bir pipet kullanılarak pelet ve tekrar süspansiyon hücreleri soğuk PBS 1 ml ilave edilir.
- 4 ° C'de 3 dakika boyunca 1.300 xg'de santrifüj. Dsüpernatant iscard.
- Yeniden askıya 500 ul pelet soğuk PBS (son hacim pelet büyüklüğü bağlı ayarlayın).
- Aktarım ve hücre süzgecinden kap (40 um) olan bir yuvarlak dipli FACS deney tüpüne süspansiyonu filtre edin. buz üzerinde immunolabeled hücreleri tutun ve hemen FACS gerçekleştirin. Not: filtreleme için, süzgeç kapağı dikey pipet dokunun ve bunun üzerinden hücre süspansiyonu itin.
- Kontrol örnekleri kullanılarak kapıları sitometresinde Set akışı.
- Toplam olaylar ve hücresel enkaz nöronal hücre popülasyonunu belirlemek için ışık saçılması ve DAPI kontrol örneği kullanın.
NOT: - Toplam olaylar (dinlenme enkaz ve kırık hücresel süreçlerdir)% 2 bu hazırlık Hücre gövdeleri sadece 1 bulunmaktadır. DAPI floresan sinyal (işaret çekirdekleri) ve İleri dağılım (hücrenin boyutu) dayanarak geriye Vadeli İşlem ve Side dayalı hücre gövdeleri ve kapıyı bulmak mümkün özelliklerini ışık saçılmasıhücreleri (Şekil 1 A, B, 'de gösterildiği gibi). - PMT voltaj ayarlarını belirlemek için, ve başka bir filtre / kanal (örneğin, Alexa Fluor 488 / FITC veya Phycoerythrine) içine belirli bir florokrom emisyon avantajını analiz etmek tek imüno kontrol örnekleri kullanın. floresan sinyalleri çakışırsa, elle tazminat seviyelerini ayarlayarak üst üste düzeltin.
- Pozitif nüfus eşiğini ayarlamak için çift floresan etiketli negatif kumandayı kullanın.
NOT: Bu örnekte gelen sinyali pozitif olarak kabul edilebilir otomatik floresans ve bu eşiğin üzerinde yer alan ana örnek hücrelere bağlı olduğu düşünülmektedir. Tipik olarak, sıralama için eşik parametreleri daha sıkı ve yaklaşık negatif kontrol yukarıda işaretli hücrelerin üst 2/3 aslında sıralanır vardır.
- Toplam olaylar ve hücresel enkaz nöronal hücre popülasyonunu belirlemek için ışık saçılması ve DAPI kontrol örneği kullanın.
- 1.7 mi mikrotüpler içine FACS ile ana numuneden kriteri nöronlar. RNA 50 ul içine hücreleri toplamakekstraksiyon tamponu. Sıralama girdap ve santrifüj tüpü ve tüpün duvarlarına tüm sıralanmış hücreleri kurtarmak için aşağı 10 kere yukarı ve aşağı pipetleme süspansiyonu karıştırmak sonra.
- Tüm hücreler, RNA ekstraksiyonu önce lize sağlamak, ve daha sonra 4 ° C 'de 2 dakika boyunca 2.800 x g'de santrifüj 30 dakika boyunca 42 ° C' de sıralanmış hücre süspansiyonu inkübe edin.
- Daha önce 13-15 açıklandığı gibi, RNA izolasyonu, cDNA sentezi, hedef gen ön büyütme ve qPCR için örnek işlemek hemen -80 ° C'de uzun süreli depolama için bir RNaz ücretsiz tüp süpernatantı aktarın veya.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
akut metamfetamin enjeksiyondan sonra tek sıçanların taze ve dondurulmuş dorsal striatum dokudan Fos-pozitif ve Fos-negatif nöronlar sıralama.
Yukarıda tarif edilen protokol metamfetamin (5 mg / kg) periton içinden enjekte sonra bir sıçan dorsal striatum, 90 dakika arasında Fos-pozitif ve fos-negatif nöronlar sıralamak için kullanıldı. kendi kafeslerinde naiv sıçanlar kontrol olarak kullanıldı. Dorsal striatum dokusu işlenmiştir ya hemen Koleksiyonunda (taze doku) ya da dondurulmuş ve 1, 7 ya da 21 gün boyunca -80 ° C 'de bekletildikten sonra işlemden sonra. Bu donma zaman noktalarında elde edilen sonuçlar birbirinden önemli ölçüde farklı değildi, bu yüzden veri toplandı.
enstrüman sıralama koşulları ayarlamak için, ev ya da kafes kontrolü veya methampheta dan (yukarıda anlatılan) kontrol numunelerimayın enjekte gruplar kullanıldı. Bu örneklerde her parçacık veya olay Sitometre akış hücresinden geçer zaman, olayın ışık saçılması ve floresan özellikleri ile ilişkili ve bir elektronik tablo kaydedilmiş bir kimlik numarası verilir. Bu sayfadaki olaylar daha sonra bu özellikleriyle (Şekil 1) için scattergrams veya yoğunluk araziler organize edilebilir. benzer özelliklere sahip Olaylar daha sonra gruplandırılmış veya bu hücreleri içeren, nöronlar, ya da Fos-pozitif nöronlar olarak kapılarını belirlemek için özellikleri farklı çiftleri tarafından 'kapı' olabilir. kapıları yukarıda açıklanan kontrol numuneleri kullanılarak belirlenmiştir sonra, ana numune bu kapılardan göre akış sitometresi enjekte ve sıralanır. hücre popülasyonu onların ileri ışık yayılımı dayalı tüm olayların (hücreler ve enkaz) için Geçitli (FSC; bir parçacığın boyutu göstergesini) ve yan ışık dağılım (SSC; parçacığın g bir göstergesidirranularity). FSC SSC karşı nokta arsa gösterilen (Şekil 1A ve 1B), tüm olayların yoğunluğu arsa büyük heterojen nüfus ek olarak, benzer boyut ve ayrıntı ile küçük bir homojen nüfus ortaya koyduğu gibi (Şekil 1A ve 1B). Hücre gövdeleri içeren küçük bir homojen nüfus tespit ve önceki çalışmalarda 11,13-15 ve DAPI ile etiketleme FSC ve SSC özelliklerine göre "Hücreler" olarak Geçitli. hücrelerin biraz daha yüksek bir yüzdesi taze doku (% 1.9) elde göre donmuş dokudan (% 2.6) elde edilmiştir. Büyük heterojen nüfus tahminen dendrit ve akson süreçlerden, çoğunlukla enkaz olduğunu.
Sonra, "Hücreler" kapıdan tek hücre x ekseni üzerinde her olay için FSC sinyalinin genişliği ile belirtilmiştir boylarına, dayanarak belirlenmiştir. tek hücre daha büyük olan olayları hücre agregatları kabul edildi ve dışında "Tek hücre kapısı. sonraki analiz adımları Tüm bu içinde yürütülmüştür" Tek hücreli "kapısı (Şekil 1C ve 1D). Bu tek hücre popülasyonunun çoğunluğu (>% 92) (veri DAPI boyama için pozitif değildi gösterilir).
İlk olarak, nöronlar NeuN-immünoreaktivitesi (Şekil 1E ve 1f) gösterilen kendi PE floresans yoğunluğunu göre tespit edilmiştir. Nöronlar taze doku ve dondurulmuş doku için% 38 için "Tek hücreli" kapıdan bütün olayların yaklaşık 24% oluşturmaktadır. Hemen hemen tüm bu "Neuron" kapısı olaylar (taze doku% 98 ve dondurulmuş dokuda% 99) hücre çekirdeğinde (Şekil 1G ve 1 H) DNA DAPI boyama için pozitif idi. Şekil 3'te qPCR tarafından onaylandıktan gibi tek hücreli kapısı kalan DAPI etiketli olaylar, Neun-negatif ve glia, oligodendrositleri ve mikroglia bulunmaktadır.
1 "> Sonra nöronlar kendi Alexa Fluor 647 floresan sinyali (Fos-immunoreaktivitesi) dayalı nöronlar Fos-pozitif veya Fos-negatif olarak sınıflandırılan hücre tipi belirteçleri aksine, Fos.:" Keep-together.within sayfa = fo "ove_content nedeniyle nöral aktivitenin ve zaman elbette düzeyleri farklı yavaş yavaş nöronlar artar ifade seviyeleri. Bu nedenle, Fos-negatif nöronlar karşı Fos-pozitif arasında kesin eşik olmayacaktır. ilk aşamada (off-line analizleri sadece kullanılan ) nöronlar Fos-pozitif yüzdelerini hesaplamak, biz naif ev kafes kontrol sıçanlarda Neun-negatif nüfus Fos maksimum Alexa-647 floresan (dayalı Fos-pozitif nöronlar) için eşik tanımladı. Fos-pozitif nöronlar belirtilmiştir Şekil 2'de farklı deneysel koşullar mavi kareler hem taze ve dondurulmuş dokularda, metamfetamin enjekte farelerden alınan yüzde Fos-pozitif nöronlar. (1,9-2,2% Şekil 2C ve 2D) eş olarak iki kat(-% 0,8, Şekil 2A ve 2B 0.7) ev kafes sıçanlara mpared.Hedef gen ön amplifikasyon ve RT-PCR kullanılarak FACS-kriteri hücrelerden Onaylama hücre türüne özgü genler.
İkinci aşamada, daha sonra mRNA ana örnek sadece Fos pozitif nöronlarının sıralama sağlamak için analiz ve fos-negatif hücreler dahil indirgeyici Alexa-647 floresans eşiği yükseltilmiş böylece Fos sadece üst üçte ikisi mavi kareler pozitif olaylar sıralanır ve toplanmıştır. Bu eşik sahip en az 10 kat örneklerde Fos pozitif nöronlarının yüzdesini hesaplamak için yukarıda kullanılan eşik değerinden daha yüksek floresans (hücre başına daha yüksek Fos sentezleme). Hücrelerin dört popülasyonları Neun-negatif + Fos-negatif (~ 5.000 olaylar) Neun-negatif + Fos-pozitif dahil olmak üzere tek doku numunesi, sıralanır (25 değişmekteydi - 83 olayları), Neun-pozitif + Fos-negatifative (~ 5.000 olay) ve Neun-pozitif + Fos-pozitif (- Ev grubu için 133 olayları, 185 - Metamfetamin grubu için 450 olayları 44 arasında değişmektedir). İlk olarak, (her ikisi de Fos-pozitif ve fos-negatif dahil) NeuN negatif popülasyon (Fos-pozitif ve fos-negatif dahil) NeuN-pozitif hücre türüne özgü gen sentezlenmesi teyit edilmiştir (Şekil 3). GAPDH idi önceki çalışmamızda 13 elde edilen sonuçlara dayanarak, başvuru / temizlik gen olarak kullanılır. PCR reaksiyonlarında numune ve cDNA RNA farklı seviyelerde kontrol etmek için, çift yönlü qPCR reaksiyonları hedef genin ve GAPDH cDNA hem de primerler kullanılarak ifa edilmiştir. GAPDH temizlik geni için Ct değerleri hassas ölçümler için 15 ile 31 arasında tutuldu. Taze ve dondurulmuş doku için, NeuN mRNA seviyeleri NeuN negatif popülasyon (p <0.05 göre NeuN pozitif popülasyonda (yaklaşık 8 kat) anlamlı düzeyde daha yüksekti Şekil 3A GFAP (glial hücre belirteci, Şekil 3B) ve Oligo2 (oligodendrosit hücre belirteci Şekil 3C) mRNA seviyeleri NeuN pozitif popülasyon (p daha NeuN negatif popülasyonu içinde daha yüksek <0.05 ). Yüksek Iba1 benzer bir eğilim (mikroglial hücre işaretleyici Şekil 3D) mRNA seviyeleri Neun-negatif nüfus gözlenen, ancak bu istatistiksel olarak anlamlı değildi. Doğru belirli bir hücre türü ölçülememiştir özellikle mRNA aşırı derecede düşük seviyelerde bulunan bazı örnekler (ör NeuN etiketli nöronlarda GFAP mRNA). Maksimum Ct değerleri doğru olarak tespit edilemeyecek kadar düşük değerlere ortadan kaldırmak için 35 olarak belirlenmiştir. Yüksek Ct değerleri bizim qPCR testlerinin güven sınırını aştı.
Fos mRNA ifadesi(Şekil 4) metamfetamin tek bir enjeksiyon alınan sıçanların Neun-pozitif nöronal nüfus incelenmiştir. Taze ve dondurulmuş doku için, fos mRNA düzeyleri (P <0.05) Fos-negatif nöronlar daha Fos-pozitif nöronlarda daha yüksekti. Ayrıca, taze iken doku Fos-pozitif nöronlarda fos mRNA'nın 3 kat artış, dondurulmuş dokudan Fos-pozitif nöronlarda fos mRNA, bir 11-misli artış saptandı oldu. Birlikte ele alındığında, bu mRNA sonuçları Fos pozitif nöronlarının kimliğini, taze ve dondurulmuş dokudan Fos-negatif nöronlar ve nöronal olmayan nüfusu teyit etmektedir. Ayrıca, hücre tipine özgü genler ve diğer ilgi genleri de taze ve dondurulmuş koşulların her ikisi altında kriteri hücrelerden analiz edilebilir.
Dis Şekil 1. AyırıcıTaze ve Dondurulmuş Rat Dorsal striatum Birlikte olan ve Etiketli Hücreler. 'Hücrelerinin kapısı ileri ve yan dağılım özellikleri (AD) tarafından belirlenen ve nükleer DAPI boyama (GH) ile pozitif etiketleme tarafından teyit edilmiştir. 'Hücrelerinin nüfus içinde' nöronlar 'kapısı neun (; EF PE) için floresan ile belirlendi. (A - B) Hücre kapısı: onların forward scatter (X ekseni, hücre boyutu) ve yan dağılım (Y-ekseni, ayrıntı) dayalı tüm olayların Lineer arsa. (Cı - D), tek hücreler, kapı: Ab gösterilen hücre kapısı içinde öne dağılım yükseklik (Y-ekseni) ve genişlik (x-ekseni) arasında lineer bir çizgi. (E - F) Nöron kapısı: CD gösterilen tek hücre kapısı olan PE-etiketli neun (Y ekseni) için immünofloresan logaritmik arsa alt kümede olayları ve non-nöronal hücrelerin üst küme nöronlar ortaya koymaktadır. (G H) Çekirdekler boyama: nöronal hücre kapısının içinde DAPI etiketli çekirdekleri (Y ekseni) için floresan logaritmik arsa. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. neun ve Fos Çift Etiketleme dayanarak Taze ve Dondurulmuş Rat Dorsal striatum Fos-pozitif ve Fos-negatif nöronlar Yolluk. Tek sonra evlerine kafes veya 90 dakika doğrudan alınan sıçanların taze ve dondurulmuş dorsal striatum ( metamfetamin karın içinden enjeksiyon) ayrışmış ve neun ve Fos karşı doğrudan konjuge antikorlar ile etiketlenmiş ve bir FACS makine kullanarak sıralanır. fikoeritrin (PE) göre NeuN immünofloresan (X-ekseni) ve Alexa 647-işaretlenmiş Fos immunofluo -etiketli edildi sıralamarescence (Y-ekseni). Fos-pozitif (mavi nokta) ve Fos-negatif (kırmızı noktalar) nöronlar sırasıyla üst ve sağ alt kadranda yer bulundu. nokta diyagramları NeuN pozitif hücreleri (nöronlar) ve NeuN-negatif hücre (siyah nokta) göstermektedir; mavi kareler yukarıda eşik Fos ifadesi ile nöronlar göstermektedir. (A - B) Ev grubu: evlerinde kafeslerde doğrudan alınan naif fareler. (C - D) Metamfetamin grubu: metamfetamin tek enjeksiyonları alan fareler. Fos-pozitif nöronlarının eşik sadece Alexa-647 floresans (Fos-IR) anestezi kontrol grubunda NeuN-negatif hücreler için gözlenen maksimum üstünde seçildi. tüm nöronların% 0.8 ev grubunda Fos-pozitif, 1.9 - - 0.7 iken tüm nöronların% 2.2 metamfetamin grubunda Fos-pozitiftir.
Şekil 3. güçlü> Hücre tipi özel gen Taze ve Dondurulmuş fare dorsal striatum Hücreler, FACS-kriteri. NeuN pozitif nöronlarının (FOS pozitif ve fos-negatif) hem NeuN-negatif hücrelerin kriteri edildi hücre Ayırma teyit etmek için kullanıldı açıklanan protokol ve hücre tipi özel geninin mRNA ekspresyon seviyelerini kullanarak (A). NeuN nöronal hücreleri için bir belirteçtir. (B), GFAP glial hücreleri için bir belirteçtir. (C) Oligo2 bir belirtecidir oligodendrosit hücreleri için. (D) Iba1 mikroglial hücreleri için bir belirteçtir. NeuN mRNA için, veriler ortalama ± SEM, taze dokudan NeuN-negatif hücrelerinde sentezleme seviyelerine göre katlama değerleri (- 14, n = 9) ve ortalama olarak sunulmuştur. , Oligo2 (n = 9-11) - GFAP (12 n = 6) ve Iba1 (n = 5-8), mRNA, veriler kat değerlerinin ± SEM Neu sentezleme seviyelerine göre olduğu anlamına sunulmuşturTaze doku N-pozitif hücreler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yukarıdaki protokol açıklanan ve Fos mRNA seviyeleri teyit edilmiştir olarak Metamfetamin Enjeksiyon. Fos-pozitif ve Fos-negatif nöronlar sonra taze veya dondurulmuş Rat Dorsal striatum FACS-sıralanmış Nöronlar Şekil 4. Fos mRNA Düzeyleri dizildi. Veriler, taze dokudan Fos-negatif nöronlarda ekspresyon seviyelerine göre katlama değerleri (4 - n = 3) ve ortalama ± SEM olarak sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FACS, taze ya da dondurulmuş yetişkin beyin dokusundan nöronlar ve diğer hücre tipleri sıralamak için kullanılabilir. Girişte belirtildiği gibi, donmuş doku kullanma yeteneği gibi bağımlılık araştırma öz-yönetim ve nüks çalışmaları gibi karmaşık ve uzun süreli davranış prosedürleri geçirmiş hayvanlardan numune optimum kullanımını sağlar. 2 saat ya da daha uzun süre ve tüm hayvanları gerektiren - Bu davranış prosedürler genellikle 1 sürer - aynı gün 13,18 test edilecektir (10 20 toplam). Beyin diseksiyon, hücre ayrışma, permeabilization ve immün içeren 4 taze disseke beyin doku örnekleri, işlemek için ~ 4 saat sürer. 30 dakika - işlendikten sonra, FACS her numune sıralama 20 arasında sürer. lizis tamponunda sıralanmış hücreleri ısıtma son adımı başka bir 30 dakika gerektirir. Toplamda, ~ 7 saat son RNA içeren hücre lizis çözüm adımı beyin diseksiyonu gereklidir. Bununla birlikte, bütün Brai dondurmak mümkündürns ya da taze testin hemen ardından beyin bölgelerini disseke ve daha sonra onları süreci. Bu büyük ölçüde test kolaylaştırır ve farklı bir gün sıralanması için birden fazla beyin alanlarını izin verir. önce FACS için doku Donma da sonuçları artırabilir. Daha NeuN pozitif nöronlarının dondurulmuş doku örnekleri elde edilir. Bu durum böyle neun ve Fos olarak hücre içi proteinlere karşı antikor erişimini artıracak donma ve sonraki eritme sırasında hücre zarlarının bozulması, artan Neun-etiketleme kısmen açıklanabilir. Benzer etkiler fibroblast, epitel hücreleri ve HeLa hücreleri 19 tespit edilmiştir.
hücrelerin ve nöronların verimi aşağıdaki adımları kullanarak maksimize edilebilir. doku diseksiyonu sırasında, (sırasıyla, dorsal striatum ve nukleus akkumbenlere için korpus kallosum ve ön komissür) beyaz cevherde çoğunluğu kaldırmak. Bu daha sonraki ste plastik ipuçları ve cam pipet yapışmasını doku önlerps. Kullanım Tampon A kaplı disseke doku tutmak için (Malzeme ve Reaktifler Tablo özellikleri bakınız). Bu traş makinesi bıçak (aşama 2.5) doku kıyma boyunca hücrelerin kalitesini artırır. hücre süzgeçler (aşama 5) bir ikinci grubu ile en az bir cam pipet (aşama 3.9) ve daha sonra filtreleme ile 3 toz haline getirme aşamalarının İlave grubu hücreleri ve nöronların verim iki katına çıkar. Hücre süzgeçler tekrar kullanımı filtreleri ve alt hücre verimi yapışmasına neden olacaktır. pelet ve toz haline getirildikten sırasında resuspending zaman hücreleri ile nazik olun. Bu adımlar sırasında bir orta büyük pipet kullanılması kesme stresine bağlı hücre hasarını azaltır. Etanol (adım 4.4) ile permeabilization sonra süpernatant çıkarırken dikkatli pelet izle. Pelet daha kompakt ve mikrosantrifüj tüpü çeperi boyunca dağıtılabilir. Kaba hesaplamalar Fos pozitif nöronlarının verimi parçalara striatal doku numunesinde başlangıç sayısının yaklaşık% 10 olduğunu göstermiştir. Geçerli protokol diğer deneysel amaçlara uygun şekilde değiştirilebilir. Fos ifade Fos-ifade nöronlar verimli sıralama için çok önemli olan bu zamanda, maksimal düzeylere ulaştığında, çünkü mevcut protokolde, doku metamfetamin enjeksiyondan sonra 90 dakika toplandı. Bununla birlikte, doku deney spesifik amaca bağlı olarak, FACS herhangi bir zaman noktasında toplanan olabilir. İlk doku numunesi depolama için, biz başarılı taze disseke doku, diseksiyon sonra dondurulmuş doku, ya da gen ifadesinin qPCR analizi ile takip FACS kullanılarak Fos-ifade nöronlar izole etmek için dondurulmuş tüm beyin disseke dondurulmuş doku kullandık. Bu protokol (15 dakika 4 ° C) 'de fiksasyon ve permeabilization, süresi ve sıcaklık için hem sitoplazmik ve nükleer membranlar geçirgenliği, yanı sıra doku düzeltmek için optimize edilmiştir. süresi ve / veya sıcaklık değişimler nihai sonuçları değiştirebilir. Böyle paraformald gibi diğer sabitleme çözümleriehyde ve embriyonik ve doğum sonrası nöronlar 20 çalıştım böyle saponin gibi non-iyonik deterjanlar, aynı zamanda yetişkin beyninden nöronlar için işe yarayabilir. Beyin dokusundan 21'den FACS son zamanlarda görüldüğü gibi Dahası, miyelin kaldırma boncuklar mevcut protokolün bir modifikasyonu olarak kullanılabilir.
Geçerli protokol dikkate iki önemli sınırlamalar vardır. İlk olarak, bu protokol bu hücresel süreçlerin toz haline getirme ve ayrılma aşamaları esnasında hücre gövdeleri kaldırılır, çünkü sinapslarda esas olarak ifade (örneğin, dopamin ya da glutamat reseptörleri) olan hücre fenotipi işaretlerini tespit etmek için uygun değildir. İkinci olası bir sınırlama FACS-kriteri hücrelerinden elde edilen RNA, uzunlukları bütün RNA analiz yöntemleri için yeterli olmayabilir olmasıdır. FACS elde edilen RNA RNA bütünlük numaraları (RIN) hücreleri kısa ortalama RNA uzunluklarına karşılık gelen 2.5- 3.5 arasında olduğunu sıralanır. Burada, kısa RNA boyutu ile telafi edildiDaha önce 13-15 açıklandığı gibi, 100 bp - 80 nispeten kısa qPCR amplikonları kullanarak. Biz de mikroarray analizi 11 başarıyla bu kısa uzunluğu RNA'lar kullandık. Bununla birlikte, elde edilen kısa RNA uzunlukları tüm RNA analiz yöntemleri için yeterli olmayabilir. Özellikle hedeflenen ekson-ekson kavşak sitozolde sadece tam olarak eklenmiş mRNA bulunan PCR primerleri kullanıldı vurgulanmalıdır. Bu primerler çekirdekten intron içeren RNA algılamaz. Ayrıca, daha önce hücre zarının 10 sitozol ve D1 dopamin reseptörlerine tirozin hidroksilaz tespit etmek antikorlar ve taze beyin dokusu ile bu protokolü kullanılır. Bu sitozolik ve hücre zarı belirteçlerinin saptanması ayrışma prosedürü büyük ölçüde sağlam hücrelerini üretir ve sadece çekirdekler değil belirtti.
Genel olarak, donmuş örneklerden nöronların FACS izolasyon diğer uygulamaları açılır. sıralama veya gen Expre hiçbir farklılıkNumuneler -80 ° C'de 3 gün ya da 3 hafta saklandığı zaman salgılanması (veriler gösterilmemiştir) gözlenmiştir ºC. (- 40 örneklerinin 20) ve gen ifadesi için RNA izole üç hafta belirli bir denemenin tüm örnekleri sıralamak için makul bir süre olduğunu. Kullanılabilir RNA da -80 ° C (veriler burada gösterilmemiştir) de 6 ay depolanabilir beyin dokusundan elde edilmiştir. Böylece, bu protokol aylarca hatta yıllarca saklandı ölüm sonrası dondurulmuş insan beyin örnekleri FACS izolasyonu için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
References
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
- Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
- Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
- Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R.
- Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
- Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
- Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
- Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
- Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
- Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
- US National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
- Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
- Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
- Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537 (2015).
