Summary
Nous présentons ici un Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) protocole pour étudier les altérations moléculaires à Fos-exprimant ensembles neuronaux de tissu cérébral à la fois frais et congelés. L'utilisation de tissus congelés permet FACS isolement de nombreuses zones du cerveau sur plusieurs sessions afin de maximiser l'utilisation de sujets d'animaux précieux.
Abstract
L'étude de la neuroplasticité et altérations moléculaires dans les comportements appris est de commutation de l'étude des régions du cerveau entier à l'étude des ensembles spécifiques de neurones activés faiblement distribués appelés ensembles de neurones qui interviennent dans les associations apprises. Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) a récemment été optimisé pour les tissus du cerveau de rat adulte et l'isolement des neurones activés en utilisant des anticorps contre le marqueur neuronal NeuN et de la protéine Fos, un marqueur des neurones fortement activés autorisés. Jusqu'à présent, les neurones Fos exprimant et d'autres types de cellules ont été isolées à partir de tissu frais, ce qui a entraîné jours de traitement longs et a permis un nombre très limité d'échantillons de cerveau pour être évalués après des procédures comportementales longues et complexes. Ici , nous avons constaté que les rendements de neurones et de Fos ARNm de striatum dorsal Fos exprimant étaient similaires entre les tissus fraîchement disséqués et le tissu congelé à -80 ° C pendant 3 - 21 jours. En outre, nous avons confirmé le phénotypedes cellules NeuN-positives et NeuN négatives triées en évaluant l' expression des gènes des neurones (NeuN), astrocytes (GFAP), oligodendrocytaire (Oligo2) et microgial (Iba1) marqueurs, ce qui indique que le tissu congelé peut également être utilisé pour FACS isolement de les types de cellules gliales. Dans l'ensemble, il est possible de recueillir, de disséquer et de geler les tissus du cerveau pour les sessions multiples FACS. Ceci maximise la quantité de données obtenues à partir de sujets animaux précieux qui ont souvent subi des interventions comportementales longues et complexes.
Introduction
Au cours de l'apprentissage, les animaux forment des associations entre des ensembles complexes de stimuli très spécifiques. Cette information à haute résolution est pensé pour être codé par des altérations au sein des modèles spécifiques de neurones faiblement distribués appelés ensembles neuronaux. Ensembles neuronaux ont été récemment identifiés par l'induction de gènes précoces immédiatement (PFGE) tels que Fos, Arc et Zif268 et leurs produits protéiques dans les neurones qui ont été fortement activées pendant le comportement ou l' exposition de repère. Fos-neurones exprimant ont été montré en particulier jouer un rôle causal dans le contexte spécifique et-cue des comportements appris 1-4. Ainsi, neuroadaptations moléculaires uniques dans ces neurones Fos exprimant activés sont les meilleurs candidats pour les mécanismes neuronaux qui codent pour les associations formées au cours des troubles d'apprentissage et d' apprentissage anormal normales, telles que la toxicomanie et le trouble de stress post-traumatique (PTSD) 5 apprises.
Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) a récemment permis l'analyse des neuroadaptations moléculaires uniques dans les neurones Fos exprimant. La cytométrie en flux et tri cellulaire ont été développés dans les années 1960 6,7 à caractériser et isoler les cellules en fonction de leurs caractéristiques de diffusion de lumière et immunofluorescence, et sont utilisés depuis longtemps en immunologie et en recherche sur le cancer. Cependant cytométrie en flux et FACS nécessite des cellules individuelles dissociées qui sont difficiles à obtenir du tissu cérébral adulte. A été utilisé pour la première FACS pour isoler et analyser la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant neurones striataux provenant de souris transgéniques qui ne nécessite pas de marquage d'anticorps de 8,9. Nous avons développé un procédé FACS à base d' anticorps 10 pour isoler et évaluer des modifications moléculaires dans les neurones activés par des médicaments et / ou des indices chez les animaux de type sauvage exprimant 11-15 Fos. Dans ce procédé, les neurones sont marqués avec un anticorps contre le marqueur neuronal général NeuN, tandis que les neurones fortement activéssont marqués avec un anticorps contre Fos. Bien que notre méthode initiale nécessaire mise en commun jusqu'à 10 rats par échantillon pour les tissus frais, les modifications ultérieures du protocole permis FACS isolement de Fos exprimant neurones et Polymerase Chain Reaction quantitative (qPCR) analyse des zones discrètes du cerveau à partir d' un seul rat 13-15 . Dans l' ensemble, les altérations moléculaires uniques ont été trouvés dans les neurones activés lors d' une variété de comportements et au contexte cue activé dans la recherche sur la toxicomanie 12,14,15 Fos-exprimant.
Un problème logistique majeur à l'exécution de FACS sur tissu frais est qu'il faut une journée entière pour dissocier le tissu et le processus par FACS. En outre, seulement environ quatre échantillons peuvent être traités par jour. Cela signifie généralement qu'une seule zone du cerveau peut être évalué à partir de chaque cerveau et les zones cérébrales restantes doivent être jetés. Ceci est un problème majeur pour faible débit des procédures comportementales telles que l'auto-administration et l'extinction training qui nécessite une intervention chirurgicale et plusieurs semaines de formation intensive. En outre, les procédures comportementales longues et compliquées le jour de test, il est difficile d'effectuer FACS le même jour. Ce serait un avantage significatif pour être en mesure de geler les cerveaux des animaux immédiatement après les tests de comportement, et ensuite isoler les neurones Fos exprimant d'une ou plusieurs zones du cerveau à différents moments de son choix les enquêteurs.
Ici, nous démontrons que notre protocole FACS peut être utilisé pour isoler les neurones Fos exprimant (et d'autres types de cellules) de tissu cérébral à la fois frais et congelés. A titre d'exemple, nous avons isolé des neurones de rat striatum après des injections de méthamphétamine aiguës et de rats naïfs sans injections (condition de contrôle) Fos exprimant. Cependant, ce protocole de FACS peut être utilisé suivant un traitement comportemental ou pharmacologique. Après analyse qPCR de nos échantillons a indiqué que l'expression des gènes à partir de ces types de cellules peut être évaluée avec similar efficacité du tissu à la fois frais et congelés.
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Protocol
Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec la Commission institutionnelle animale soin et l' utilisation (IACUC) des National Institutes of Health Guide pour le soin et l' utilisation des animaux de laboratoire 16.
Remarque: Toutes les étapes ci-dessous utilisent des tubes à faible liaison centrifugeuse qui ont été conservés sur la glace, sauf indication contraire.
1. Préparation Avant Collection de tissus
- Réglez la centrifugeuse à 4 o C.
- Feu polish un ensemble de trois pipettes Pasteur en verre avec des diamètres décroissants d'environ 1,3, 0,8 et 0,4 mm pour chaque échantillon.
- Préparer étiquetés 1,7 ml tubes contenant 1 ml de tampon A froid et de garder les tubes sur la glace.
- Préparer un bac à glaçons contenant le cerveau tranchage matrice, spatules et plaques de verre (ou inversé verre boîte de Pétri) sur lequel effectuer la dissection. Pré-froid deux ou plusieurs lames de rasoir sur les plaques de verre et les tissus d'utilisation papier pour sécher tous les instruments qui touchent le tproblème.
- Décongeler la solution enzymatique à la température ambiante (RT) pendant 30 min avant la collecte des tissus.
2. Tissue Collection et Dissection
- Initier le comportement ou pharmacologique traitement 90 min avant la collecte des tissus.
NOTE: Pour les résultats présentés ici, les injections intra-péritonéales aiguës de 5 mg / kg de méthamphétamine sur des rats dans un nouvel environnement (condition de test) et des rats naïfs gardés dans leurs cages à domicile (condition de contrôle) ont été réalisées. - Anesthésier le rat en le plaçant dans un récipient en verre dessicateur saturé avec de l'isoflurane et décapite les rats 30 - 60 secondes plus tard à l'aide d'une guillotine.
Utilisez des ciseaux pour enlever la peau et les muscles de la tête et exposer le crâne. Utilisez Rongeurs pour couper le crâne et ouvrir le foramen magnum et retirer la partie arrière du crâne. Utilisez Rongeurs pour couper le long des bords supérieurs du crâne pour exposer le cerveau. Veillez à ne pas endommager le cerveau. Utilisez une petite spatule pour ramasser doucement sous und élever le cerveau. Soulever le cerveau et couper les nerfs jusqu'à ce que le cerveau est libre 17. - Disséquer les tissus en utilisant des lames de rasoir.
NOTE: Obtenir des échantillons de tissus à l'aide de l'une des méthodes suivantes: (2.3.1) tissus fraîchement disséqués; (2.3.2) tissu congelé après dissection; ou (2.3.3) Le tissu congelé a disséqué à partir du cerveau entier congelé. Gardez la matrice cerveau de tranchage, des lames de rasoir et de la plaque de verre sec tout au long de la dissection et les processus que l'eau condensée émincer peut conduire à la lyse hypotonique des cellules. Utilisez des loupes pour assurer la dissection précise.- Pour les tissus fraîchement disséqués, placez le cerveau fraîchement extrait dans une matrice cérébrale de tranchage (un rat en forme de cerveau moule métallique avec des fentes pour les lames de rasoir à intervalles de 1 mm) qui a été refroidi sur de la glace. Insérez deux ou plusieurs lames de rasoir pré-réfrigérés dans les fentes pour couper des tranches coronales qui contiennent la région (s) du cerveau d'intérêt. Placez la tranche de coupe sur la plaque de verre réfrigéré.
Note: Disséquer la regio du cerveauns d'intérêt sur une plaque de verre réfrigéré. - Pour les tissus congelés après dissection, disséquer la région (s) de cerveau d'intérêt à partir des tranches de cerveau fraîchement extrait, similaire à celle décrite ci-dessus à la section 2.3.1. Placez le tissu disséqué dans un microtube et congeler rapidement le tissu en submergeant le microtube à -40 ºC isopentane pendant 20 sec. Gardez le tissu disséqué congelé à tout moment dans un congélateur ºC -80 jusqu'au traitement.
- Pour les tissus congelés, geler immédiatement le cerveau fraîchement extrait à -40 ºC isopentane et stocker dans un sac scellé à -80 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
- Le jour de la dissection, placez le cerveau congelé dans un cryostat fixé à environ -20 ° C (pas plus chaud que -18 ºC) pendant environ 2 heures pour équilibrer la température.
NOTE: Les cerveaux peuvent être coupés facilement à cette température, tandis que des températures beaucoup plus fraîches rendent le cerveau trop fragile pour être coupé en toute sécurité. - Utiliser des lames de rasoir pour couper 1 - 2 mm de coupes coronalesles cerveaux congelés dans un cryostat. Utiliser une aiguille de 12 à calibre 16 émoussée pour obtenir des poinçons de tissus provenant de ces tranches dans des conditions de gel. Gardez le tissu disséqué gelé en tout temps jusqu'à un traitement ultérieur.
- Le jour de la dissection, placez le cerveau congelé dans un cryostat fixé à environ -20 ° C (pas plus chaud que -18 ºC) pendant environ 2 heures pour équilibrer la température.
- Pour les tissus fraîchement disséqués, placez le cerveau fraîchement extrait dans une matrice cérébrale de tranchage (un rat en forme de cerveau moule métallique avec des fentes pour les lames de rasoir à intervalles de 1 mm) qui a été refroidi sur de la glace. Insérez deux ou plusieurs lames de rasoir pré-réfrigérés dans les fentes pour couper des tranches coronales qui contiennent la région (s) du cerveau d'intérêt. Placez la tranche de coupe sur la plaque de verre réfrigéré.
- Ajouter 1 - 2 gouttes de tampon A pour couvrir le tissu disséqué avant le hachage. Éliminer la majeure partie de la substance blanche à partir du tissu en utilisant deux lames de rasoir pour empêcher la perte de neurones pendant le reste du processus de trituration. Si à partir de tissu congelé, puis laisser le tissu décongeler sur la plaque de verre à froid pour pas plus de 1 min avant d'appliquer le tampon A solution.
- Émincer le tissu 100 fois dans chaque direction orthogonale avec une lame de rasoir sur une plaque de verre réfrigéré. Maintenir la lame de rasoir verticale par rapport à la plaque de verre lors de hachage.
NOTE: émincer approfondie est essentielle pour toutes les étapes du protocole. - Utiliser des lames de rasoir pour transférer le tissu haché dans des tubes de microcentrifugation contenant 1 ml de tampon froid A. Inverser le tube 3 - 5 fois keep tout tissu haché dans la solution.
3. Cellule Dissociation
REMARQUE: Utilisez fin douce sur l'extrémité de mélange pour toutes les étapes suivantes. Ne pas utiliser un mélangeur à vortex et d'éviter les bulles d'air qui causent des dommages aux cellules.
- Centrifuger les tubes d'échantillon à 110 g pendant 2 min à 4 ° C. surnageant Jeter. ajouter lentement 1 ml d'une solution froide, fraîchement décongelé enzymatique (contenant un mélange d'enzymes protéolytiques) vers le bas de la paroi intérieure du microtube. aspirer immédiatement la totalité de culot et doucement la pipette de haut en bas seulement 4 fois avec un modérément grande pipette de diamètre de pointe pour disperser le culot de tissu haché.
- Inverser les microtubes immédiatement pour éviter que la pastille de coller au fond et on incube les échantillons avec un mélange de bout en bout pendant 30 min à 4 ° C
- Après digestion de tissu enzymatique, centrifuger les tubes à 960 g pendant 2 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et ajouter 0,6 ml de tampon A. froide Immediately après avoir ajouté le tampon A, utiliser le même embout de pipette pour disperser le culot en aspirant l'ensemble de granulés et doucement la pipette de haut en bas 5 fois.
- Mécaniquement triturer le tissu digéré et recueillir dans 15 ml tubes en utilisant les étapes suivantes. Pour chaque échantillon, utilisez un ensemble distinct de 3 pipettes Pasteur en verre poli-feu avec décroissant diamètres d'environ 1,3, 0,8 et 0,4 mm attachés aux ampoules en latex.
- triturer délicatement chaque échantillon 10 fois avec la pipette de verre de 1,3 mm. Laissez l'échantillon reposer pendant 2 min sur la glace (les débris et les cellules non dissociées se déposent au fond). Recueillir le surnageant (~ 0,6 ml) et le transfert à un tube conique de 15 ml (le tube n ° 1).
- Ajouter 0,6 ml de tampon Une solution au culot restant. Triturer l'échantillon 10 fois avec la pipette de verre de 0,8 mm. Laissez l'échantillon reposer pendant 2 min sur la glace. Recueillir le surnageant (~ 0,6 ml) et le transfert aux mêmes 15 ml tube conique # 1.
- Ajouter 0,6 ml de tampon Une solution à la pelle restantet. Triturer l'échantillon 10 fois avec la pipette de verre de 0,4 mm. Laissez l'échantillon reposer pendant 2 min sur la glace. Recueillir le surnageant (~ 0,6 ml; sans toucher le culot avec des cellules non dissociés) et transférer les mêmes 15 ml tube conique # 1.
NOTE: Conserver le diamètre pipette de 0,4 mm dans le tube n ° 1 pour les étapes suivantes de trituration. - Répétez l'étape 3.4.3 trois fois de plus en utilisant la plus petite pipette en verre (~ 0,4 mm de diamètre) et recueillir le surnageant dans un tube conique de 15 ml séparés (le tube n ° 2).
- Triturer les suspensions de cellules recueillies dans des tubes # 1 et # 2 pour 10 plusieurs fois à l'aide de la pipette de verre de 0,4 mm et de garder sur la glace.
4. Cellule de fixation et de perméabilisation
- Préparer 4 microtubes par échantillon (deux microtubes pour les cellules du tube n ° 1 et deux pour les cellules du tube 2 #) en ajoutant 800 pi de 100% de l' éthanol froid (stocké à -20 ° C avant utilisation) dans chaque tube et les garder sur la glace . Remarque: L'éthanol finalela concentration sera de 50%.
- Introduire à la pipette ~ 800 ul des suspensions cellulaires à partir du tube (# 1 et # 2 tubes) dans chacun des 4 tubes contenant de l'éthanol froid et inverser les tubes pour mélanger les échantillons.
- Incuber les tubes sur de la glace pendant 15 min tout en inversant les tubes toutes les 5 min.
- Après fixation / perméabilisation, centrifuger les tubes à 1700 g pendant 4 min à 4 ° C et jeter le surnageant. Laisser 50 ul de solution pour éviter la perte de cellules.
NOTE: Les pastilles à ce stade sont blancs et collent moins à la paroi des tubes qu'auparavant perméabilisation. Par conséquent, éliminer le surnageant avec précaution en touchant la paroi du microtube où il n'y a pas de culot et d'en tirer le surnageant lentement en utilisant une micropipette.
5. Cellule de filtration
- Re-suspendre les granulés de l'étape 4.4 avec du PBS froid comme suit:
- Ajouter 550 ul de PBS froid à l'un des deux microtubes en provenance du tube n ° 1, et en utilisant un modérément grand diamètre pitip pette de pipeter doucement la suspension de cellules de haut en bas 5 fois. Répétez la même chose pour un microtube venant du tube n ° 2.
- Pour les cellules à partir du tube n ° 1, en utilisant la même pipette, transférer la première suspension de cellules à la seconde pastille. Reprendre le second culot par pipetage doucement le combiné suspension de cellules de haut en bas 5 fois.
- Pour les cellules du tube n ° 2, resuspendre et combiner les pellets (ie, troisième et quatrième microtubes) comme décrit dans 5.1.2.
- Filtrer les deux suspensions de cellules à partir des étapes 5.1.2 et 5.1.3 en utilisant séparément deux paires différentes de crépines de cellules (100 um et 40 um tailles de pores) comme suit:
- Prémouillage chaque tamis cellulaire en y ajoutant du PBS à l'intérieur du filtre. Utiliser une pipette pour éliminer l'excès de PBS à l'extérieur du tamis.
- Introduire à la pipette la suspension de cellules provenant de l'étape 5.1.2 uniformément sur le premier tamis cellulaire à 100 um de taille des pores. Recueillir l'écoulement dans un tube de 50 ml sur la glace. Utilisez le pipette pour recueillir la accréditive attachée sur le fond du côté extérieur du tamis cellulaire.
- Utilisez la même pipette pour transférer l'écoulement de la cellule crépine 100 um à la cellule crépine 40 pm. Recueillir ce flux continu dans un autre tube de 50 ml sur la glace. Lors du transfert de l'écoulement à travers de 40 um tamis cellulaire, changer à de nouveaux embouts de pipette pour éviter la contamination de 100 crépine um cellulaire.
- Répétez ces étapes pour la suspension cellulaire de l'étape 5.1.3 en utilisant un nouvel ensemble de filtres.
- Combiner les deux flux continu de chaque échantillon, pour un volume final d'environ 1 ml par échantillon.
6. incubation avec des anticorps
REMARQUE: Utilisez les petites aliquotes des suspensions de cellules du cerveau pour préparer plusieurs échantillons de contrôle pour la mise en cytomètre en flux approprié paramètres avant d'exécuter l'échantillon principal. Pour chaque marquage d'anticorps, préparer des échantillons de contrôle qui ne contiennent aucun anticorps, seul le soicondaire anticorps (ou un autre marqueur fluorescent), puis les deux anticorps primaires et secondaires (ou un autre marqueur fluorescent). Utilisez ces commandes pour régler les portes qui séparent spécifique par rapport à l'étiquetage non-spécifique dans le cytomètre de flux. Lorsque cela est possible, utiliser fluorochromes qui ne nécessitent pas de compensation. Augmenter le volume final des échantillons de contrôle de transmission sélective à un volume final de 700 ul par addition de PBS avant l'addition des anticorps primaires.
- Préparer diffusion de la lumière et DAPI échantillon témoin en transférant un échantillon de 100 ul des cellules filtrées dans un microtube de 1,7 ml. Ajouter 600 pl de PBS froid avec 1 pg / ml pour la coloration DAPI des noyaux. Incuber pendant 10 min avec un mélange de bout sur bout, et laver (comme indiqué dans les étapes 6.4.2 à 6.4.5) avant de passer par la cytométrie de flux.
NOTE: Cet échantillon est utilisé uniquement pour définir la cellule / noyaux porte avant de trier les cellules restantes dans la machine FACS. - Préparer simples échantillons de contrôle immunomarquées en transférant 100 & #181; l des cellules filtrées dans un microtube de 1,7 ml. Ajouter 600 pi de PBS froid avec un anticorps (par exemple, un anticorps NeuN). Ajouter 600 pi de PBS froid à un microtube avec un autre anticorps (par exemple, un anticorps Fos). Ajouter l'anticorps secondaire correspondant si elle est pas un anticorps primaire directe conjugué.
REMARQUE: Ces échantillons sont utilisés pour déterminer la tension photomultiplicateur approprié (FPM), et d'évaluer le recouvrement des deux signaux fluorescents, si nécessaire. Les concentrations d'anticorps doivent être titrés pour obtenir les meilleurs rapports signal-bruit dans tous les canaux. signaux fluorescents Chevauchement peuvent également être compensées par un étalonnage interne de différents canaux fluorescents au sein de la cytométrie de flux. - Préparer à double échantillon témoin négatif marqué par fluorescence en transférant 100 ul des cellules filtrées dans un microtube de 1,7 ml. Ajouter 600 pi de PBS froid avec les anticorps secondaires seuls ou des anticorps primaires directe conjugués IgG.
NOTE: Thiéchantillon s de contrôle peut être utilisé à chaque fois avant le tri pour déterminer la fluorescence de fond pour chaque fluorophore. - Préparer l'échantillon principal à trier.
- Transférer 700 ul des cellules filtrées dans un microtube de 1,7 ml. Ajouter 7 pi (1: 100) de l'anticorps primaire conjugué à Fos directement à Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) et 1,4 pi (1: 500) de l'anticorps primaire conjugué à NeuN directement à la phycoérythrine (anti-NeuN-PE). Incuber les tubes pendant 30 minutes à 4 ° C avec un mélange de bout sur bout.
- A la fin de l'incubation, ajouter 800 ul de PBS froid à chaque microtube, y compris l'échantillon principal et les échantillons témoins et mélanger par retournement.
- microtubes à centrifuger à 1300 xg pendant 3 min à 4 ºC. Jeter le surnageant, laissant 50 surnageant ul pour empêcher la perte de cellules.
- Ajouter 1 ml de PBS froid aux cellules de granulés et resuspendre en utilisant une pipette avec un diamètre modérément large de la pointe.
- Centrifugeuse à 1300 xg pendant 3 min à 4 ° C. réiscard le surnageant.
- Re-suspendre le culot dans 500 ul de PBS froid (régler le volume en fonction de la taille finale de la pastille).
- Transfert et filtrer la suspension dans un tube d'échantillon à fond rond FACS avec un bouchon de crépine de cellules (40 pm). Gardez les cellules immunomarquées sur la glace et effectuer immédiatement FACS. Remarque: Pour le filtrage, appuyez sur la pointe de la pipette verticalement sur le capuchon de la crépine et pousser la suspension cellulaire à travers elle.
- Set cytomètre portes à l'aide d'échantillons de contrôle.
- Utilisez la diffusion de la lumière et DAPI échantillon de contrôle pour identifier la population des cellules neuronales du total des événements et les débris cellulaires.
NOTE: Les corps cellulaires dans cette préparation ne sont que 1 - 2% du total des événements (les autres sont les débris et les processus cellulaires brisés). Sur la base de signal de DAPI fluorescent (noyaux indiquant) et scatter Forward (taille de la cellule), il est possible de localiser les corps cellulaires et la porte arrière sur la base du Forward et Side propriétés de diffusion de la lumièreles cellules (comme représenté sur la figure 1 A, B). - Utilisez les échantillons de contrôle immunomarquées simples pour déterminer les réglages de tension de PMT et d'analyser des retombées de l' émission d'un fluorochrome spécifique dans un autre filtre / canal (par exemple, Alexa Fluor 488 / FITC ou phycoérythrine). Si des signaux fluorescents se chevauchent, corriger le chevauchement en ajustant les niveaux de rémunération manuellement.
- Utilisez la double contrôle négatif marqué par fluorescence à mettre en place le seuil pour la population positive.
REMARQUE: le signal provenant de cet échantillon est considéré comme dû à l'auto-fluorescence et les cellules de l'échantillon principal situé au-dessus de ce seuil peut être considéré comme positif. En règle générale, les paramètres de seuil pour le tri sont plus strictes et à peu près le top 2/3 des cellules marquées au-dessus du contrôle négatif sont effectivement triés.
- Utilisez la diffusion de la lumière et DAPI échantillon de contrôle pour identifier la population des cellules neuronales du total des événements et les débris cellulaires.
- Trier les neurones à partir de l'échantillon principal par FACS dans 1,7 ml microtubes. Recueillir les cellules dans 50 ul d'ARNun tampon d'extraction. Après le tri, vortex et centrifuger le tube et mélanger la suspension par pipetage de haut en bas 10 fois pour récupérer toutes les cellules triées par les parois du tube.
- Incuber la suspension de cellules triées à 42 ° C pendant 30 min pour assurer que toutes les cellules sont lysées avant l'extraction de l'ARN, puis centrifuger à 2.800 xg pendant 2 min à 4 ° C.
- Transférer le surnageant dans un tube sans RNase pour le stockage à long terme à -80 ° C ou immédiatement traiter l'échantillon pour l' isolement de l' ARN, la synthèse d'ADNc, le gène cible de pré-amplification et de qPCR, comme décrit précédemment 13-15.
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Representative Results
Tri neurones Fos-positifs et Fos-négatifs de tissus frais et congelé striatum dorsal de rats simples après des injections de méthamphétamine aiguës.
Le protocole décrit ci-dessus a été utilisé pour trier les neurones Fos-positifs et négatifs de Fos à partir d'un seul rat striatum dorsal 90 min après une injection intrapéritonéale de la méthamphétamine (5 mg / kg). les rats naïfs dans leurs cages ont été utilisées comme témoins. Dorsale tissu striatum a été traité soit immédiatement après sa collection (de tissu frais) ou transformés après avoir été congelé et stocké dans -80 ° C pendant 1, 7 ou 21 jours. Les résultats de ces points dans le temps de gel ne sont pas significativement différents les uns des autres, de sorte que les données ont été regroupées.
Pour mettre en place les conditions de tri sur l'instrument, des échantillons de contrôle (décrits ci-dessus) soit de la commande à la maison de la cage ou methamphetagroupes de mines injectés ont été utilisés. Lorsque chaque particule ou d'un événement dans ces échantillons traverse la cellule d'écoulement dans le cytomètre, ils reçoivent un numéro d'identification qui est associée à des caractéristiques de diffusion de la lumière et de fluorescence de l'événement et enregistrée dans une feuille de calcul. Les événements de cette feuille peuvent alors être organisés en scattergrams ou des parcelles de densité pour ces caractéristiques (figure 1). Les événements avec des caractéristiques similaires peuvent être groupées ou «gated» par les différentes paires de caractéristiques pour déterminer les grilles telles que celles contenant des cellules, des neurones, ou neurones Fos-positifs. Une fois que les portes sont déterminées en utilisant des échantillons de contrôle décrits ci-dessus, l'échantillon principal est injecté dans le cytomètre en flux et triées en fonction de ces portes. La population de cellules a été fermée de tous les événements (cellules et débris) en fonction de leur dispersion de la lumière vers l'avant (FSC, une indication de la taille de la particule) et dispersion de la lumière latérale (SSC; une indication de g de la particuleranularity). Comme le montre le FSC par rapport SSC tracé de points (figure 1A et 1B), le tracé de la densité de tous les événements révèle une petite population homogène avec une taille et une granularité, en plus d'une grande population hétérogène (figure 1A et 1B). Une petite population homogène qui contient les corps cellulaires a été identifié et fermé comme «cellules», basé sur FSC et les caractéristiques de la SSC des études précédentes 11,13-15 et l' étiquetage avec DAPI. Un pourcentage légèrement plus élevé de cellules ont été obtenues à partir de tissus congelés (2,6%) que de tissus frais (1,9%). La grande population hétérogène est la plupart du temps les débris, vraisemblablement de dendrites et des axones processus.
Ensuite, les cellules individuelles de la porte "cellules" ont été identifiées en fonction de leur taille, ce qui a été indiqué par la largeur du signal FSC pour chaque événement sur l'axe des abscisses. Les événements qui étaient plus grandes que les cellules individuelles ont été considérés comme des agrégats de cellules et exclus de la «porte de la cellule unique. Toutes les étapes d'analyse suivantes ont été menées au sein de cette« porte de la cellule unique "(figure 1C et 1D). La majorité de cette population cellulaire unique (> 92%) était positif pour la coloration DAPI (données non représenté).
Tout d' abord, les neurones ont été identifiés en fonction de leur PE intensité de fluorescence qui indiquait NeuN-immunoréactivité (Figure 1E et 1F). Neurones représentaient environ 24% de tous les événements de la porte "cellule unique" pour les tissus frais et 38% pour les tissus congelés. Presque tous les événements de cette porte "Neuron" (98% dans les tissus frais et 99% dans le tissu congelé) étaient positifs pour la coloration DAPI de l' ADN dans les noyaux des cellules (Figure 1G et 1H). Les autres événements DAPI marqués dans la porte de la cellule unique sont NeuN négatif et comprennent gliales, les oligodendrocytes et la microglie, tel que confirmé par qPCR dans la figure 3.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Ensuite, les neurones ont été classés comme les neurones Fos-positif ou Fos-négative en fonction de leur Alexa Fluor 647 signal de fluorescence (Fos-immunoréactivité) Contrairement à des marqueurs de type cellulaire, Fos. les niveaux d'expression dans les neurones augmente progressivement en raison de niveaux d'activité neurale et bien sûr de temps différentes. par conséquent, il n'y aura pas un seuil de coupure nette entre Fos-positif par rapport neurones Fos-négatifs. dans la première étape (utilisée uniquement pour hors-ligne des analyses pour calculer les pourcentages de neurones Fos-positif), nous avons défini le seuil pour les neurones Fos-positifs basés sur la fluorescence Alexa-647 au maximum (pour Fos) de la population NeuN négatif dans les naïfs rats témoins à la maison de la cage. neurones Fos-positifs sont indiqués dans les carrés bleus de différentes conditions expérimentales de la figure 2 dans les deux tissus frais et congelés, le pourcentage Fos-positif neurones de rats de méthamphétamine à injection. (01.09 à 02.02%, la figure 2C et 2D) a été deux fois en tant que compared à des rats , à la maison de cage (de 0,7 à 0,8%, la figure 2A et 2B).Confirmation des gènes spécifiques du type cellulaire à partir de cellules triées par FACS en utilisant un gène cible de pré-amplification et de RT-PCR.
Dans la deuxième étape, pour assurer le tri des seuls neurones Fos-positifs de l'échantillon principal pour l'ARNm des analyses subséquentes et réduire l'inclusion des cellules Fos-négatives, le seuil de fluorescence Alexa-647 a été soulevée de sorte que seuls les deux tiers supérieurs de Fos événements -positifs dans les carrés bleus ont été triés et collectés. Ce seuil a au moins 10 fois plus élevée fluorescence (plus d'expression Fos par cellule) que le seuil utilisé ci-dessus pour calculer le pourcentage de neurones Fos-positifs dans les échantillons. Quatre populations de cellules ont été triées à partir d'un échantillon de tissu unique, y compris NeuN négatif + Fos-négatif (~ 5000 événements), NeuN négatif + Fos-positif (variait de 25 - 83 événements), NeuN positif + Fos-negative (~ 5000 événements) et NeuN positif + Fos-positif (distance 44 - 133 événements pour le groupe de maison, 185 - 450 événements pour le groupe de méthamphétamine). Tout d' abord, l'expression de gènes spécifiques de type cellulaire dans NeuN positif (y compris à la fois Fos-positif et Fos-négatif) population et NeuN négatif (y compris à la fois Fos-positif et Fos-négatif) a été confirmée (Figure 3). Gapdh était utilisé comme gène de référence / ménage, en fonction des résultats de notre étude précédente 13. Pour contrôler les différents niveaux d'ARN dans l'échantillon et l' ADNc dans les réactions de PCR, des réactions de qPCR duplex ont été réalisées en utilisant des amorces à la fois pour le gène cible et GAPDH ADNc. Les valeurs de Ct pour le gène de ménage Gapdh ont été maintenus entre 15 et 31 pour des mesures précises. Pour les deux tissus frais et congelés, les niveaux d' ARNm de NeuN étaient significativement plus élevés (environ 8 fois) dans la population NeuN positif que dans la population NeuN-négative (p <0,05; Figure 3A GFAP (marqueur des cellules gliales, figure 3B) et Oligo2 (marqueur de cellules oligodendrocytes; Figure 3C) les taux d' ARNm étaient supérieurs dans la population NeuN négatif que dans la population NeuN-positive (p <0,05 ). Une tendance similaire de plus Iba1 (marqueur de cellules microgliales; Figure 3D) les taux d' ARNm a été observée dans la population NeuN négatif, mais cela n'a pas été statistiquement significative. Certains échantillons contenus extrêmement faibles niveaux d'ARNm particuliers qui ne pouvaient pas être mesurés avec précision dans un type cellulaire particulier (par exemple, GFAP ARNm dans les neurones NeuN marqués). Les valeurs maximales de Ct ont été définies comme 35 pour éliminer les valeurs qui ont été trop faible pour être détectée avec précision. Des valeurs plus élevées Ct ont dépassé la limite de confiance dans nos essais de qPCR.
Expression Fos ARNm étaitexaminé dans la population neuronale NeuN positif de rats qui ont reçu une seule injection de méthamphétamine (Figure 4). Pour les deux tissus frais et congelés, les niveaux d' ARNm de Fos étaient plus élevées dans les neurones Fos-positifs que dans les neurones Fos-négatifs (p <0,05). De plus, alors qu'il y avait une augmentation de 3 fois de Fos ARNm dans les neurones Fos-positifs à partir du tissu frais, une augmentation de 11 fois de Fos ARNm dans les neurones Fos-positifs du tissu congelé a été détecté. Pris ensemble, ces résultats d'ARNm confirment l'identité des neurones Fos-positifs, les neurones Fos-négatifs et la population non-neuronales à la fois des tissus frais et congelés. En outre, les gènes spécifiques de type cellulaire et d'autres gènes d'intérêt peuvent également être analysées à partir de cellules triées sous les deux conditions fraîches et congelées.
Figure 1. Gating de DisCellules sociated et Labellisées de frais et congelés Rat Dorsale striatum. La porte «cellules» a été déterminé par l' avant et les propriétés de dispersion latérale (AD) et confirmée par un marquage positif avec une coloration DAPI nucléaire (GH). La porte «Neurones» au sein de la population "cellules" a été déterminée par fluorescence pour NeuN (PE; EF). (A - B) porte Cell: tracé linéaire de tous les événements, en fonction de leur diffusion vers l' avant (axe X, la taille des cellules) et la dispersion latérale (axe Y, granularité). (C - D) cellules unique porte: tracé linéaire de la hauteur avant de dispersion (axe Y) et la largeur (axe X) dans la porte de la cellule représentée sur AB. (E - F) Neuron porte: Terrain logarithmiques de immunofluorescence pour NeuN PE marqué (axe Y) à l' intérieur de la porte des cellules individuelles représenté sur CD révèle les neurones du cluster supérieure des événements et des cellules non neuronales du cluster inférieur. (G H) Noyaux coloration: plot logarithmiques de la fluorescence pour les noyaux DAPI marqués (axe Y) à l' intérieur de la porte des cellules neuronales. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Gating de Neurones Fos-positifs et Fos-négatifs de frais et congelés Rat Dorsale striatum Basé sur Double étiquetage pour NeuN et Fos. Le striatum dorsal frais et congelé à partir de rats (pris directement à partir de leur cage d'origine ou 90 min après une seule injection intrapéritonéale de méthamphétamine) ont été dissociés et étiquetés avec les anticorps directement conjugués contre NeuN et Fos et triée en utilisant une machine FACS. Le tri a été basée sur la phycoérythrine (PE) marqué à NeuN immunofluorescence (axe X) et Alexa 647 marqué par immunofluorescence Fosrescence (axe Y). (points bleus) Fos-positifs et Fos-négatif (points rouges) neurones étaient situés dans les quadrants supérieur et inférieur droit, respectivement. Les tracés de points montrent cellules NeuN-positives (neurones) et les cellules NeuN-négatives (points gris); les carrés bleus indiquent les neurones avec au-dessus de seuil Fos expression. (A - B) groupe Accueil: rats naïfs prises directement à partir de leurs cages à domicile. (C - D) groupe de méthamphétamine: rats qui ont reçu des injections uniques de méthamphétamine. Les seuils pour les neurones Fos-positifs ont été sélectionnés pour être juste au-dessus maximale Alexa-647 fluorescence (Fos-IR) observée pour les cellules NeuN-négatives dans le foyer de groupe de contrôle de la cage. Alors que 0,7 à 0,8% de tous les neurones sont Fos-positifs dans le groupe de la maison, de 1,9 à 2,2% de tous les neurones sont Fos-positifs dans le groupe de la méthamphétamine.
La figure 3. type de cellule forte Gene expression spécifique dans les cellules de frais et congelés Rat Dorsale striatum neurones NeuN-positives triées par FACS. (Fos-positifs et Fos-négatives) et NeuN-négatives (Fos-positifs et Fos-négatifs) ont été classés en utilisant le protocole décrit et niveaux d' ARNm de gènes spécifiques du type cellulaire d' expression ont été utilisés pour confirmer le tri de cellules (a) . NeuN est un marqueur pour les cellules neuronales. (B) GFAP est un marqueur pour les cellules gliales. (C) Oligo2 est un marqueur pour les oligodendrocytes. (D) Iba1 est un marqueur pour les cellules microgliales. NeuN pour un ARNm, les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart - type des valeurs de pliage par rapport aux niveaux d'expression dans les cellules-NeuN négatives du tissu frais (n = 9 - 14). Pour GFAP (n = 6-12), Oligo2 (n = 9 - 11) et Iba1 (n = 5-8) , l' ARNm, les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart - type des valeurs de pliage par rapport aux niveaux d'expression NeuCellules N-positives du tissu frais. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Niveaux Fos ARNm dans Neurones FACS triés de frais ou congelé Rat Dorsale striatum après neurones méthamphétamine Injection. Fos-positifs et Fos-négatifs ont été classés comme décrit dans le protocole ci - dessus et les taux d' ARNm de Fos a été confirmée. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type des valeurs de pliage par rapport aux niveaux d'expression dans les neurones Fos-négatifs du tissu frais (n = 3 - 4).
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Discussion
FACS peut être utilisé pour trier les neurones et d'autres types de cellules provenant soit du tissu cérébral adulte frais ou congelé. Comme mentionné dans l'introduction, la possibilité d'utiliser les tissus congelés permet une utilisation optimale des échantillons provenant d'animaux qui ont subi des procédures comportementales complexes et prolongées, comme l'auto-administration et de rechute des études dans la recherche sur la toxicomanie. Ces procédures de comportement prend habituellement 1 - 2 h ou plus, et exigent que tous les animaux (10 - 20 au total) seront testés le même jour 13,18. Il faut environ 4 h ~ 4 pour traiter des échantillons de tissu cérébral fraîchement disséqué, qui comprend dissection du cerveau, de la dissociation des cellules, la perméabilisation et immunomarquage. Après le traitement, le tri chaque échantillon par FACS prend entre 20 - 30 min. L'étape finale consistant à chauffer les cellules triées dans la mémoire tampon de lyse nécessite encore 30 min. Au total, ~ 7 h sont nécessaires de dissection du cerveau à la cellule-lyse étape finale contenant de l'ARN-solution. Cependant, il est maintenant possible de geler toute brains ou fraîchement disséqués régions du cerveau immédiatement après les tests, et les traiter plus tard. Ceci simplifie grandement les tests et permet de multiples régions du cerveau d'être trié sur un autre jour. La congélation du tissu avant FACS peut également améliorer les résultats. NeuN neurones plus positifs sont obtenus à partir d'échantillons de tissus congelés. Ceci pourrait être expliqué en partie par l'augmentation de NeuN-étiquetage en raison de la perturbation des membranes cellulaires lors de la congélation et la décongélation ultérieure, ce qui augmenterait l'accès des anticorps aux protéines intracellulaires tels que NeuN et Fos. Des effets similaires ont été observés avec des fibroblastes, des cellules épithéliales et des cellules HeLa 19.
Le rendement des cellules et des neurones peut être maximisée en utilisant les étapes suivantes. Au cours de la dissection du tissu, retirer la majorité de la matière blanche (le corps calleux et la commissure antérieure pour les striatum dorsal et le noyau accumbens, respectivement). Cela empêche le tissu d'adhérer aux conseils en plastique et pipettes de verre dans la ste ultérieureps. Utiliser le tampon A (voir cahier des charges dans le tableau des matériaux et réactifs) pour maintenir le tissu disséqué couvert. Ceci permet d'améliorer la qualité des cellules pendant hachant du tissu avec la lame de rasoir (étape 2.5). Le jeu supplémentaire de 3 étapes de trituration avec la plus petite pipette en verre (étape 3.9) et le filtrage ultérieur avec un deuxième ensemble de crépines de cellules (étape 5) double le rendement des cellules et des neurones. Réutilisation les crépines cellulaires se boucher les filtres et le rendement de la cellule inférieure. Soyez doux avec les cellules lorsque la remise en suspension des pastilles et pendant la trituration. L'utilisation d'un modérément grande pointe de la pipette au cours de ces étapes permettra de réduire les dommages aux cellules due au cisaillement. Surveillez attentivement la pastille lors du retrait de surnageant après perméabilisation avec de l'éthanol (étape 4.4). Le culot est moins compact et peut être distribué le long de la paroi du tube de microcentrifugeuse. Des calculs approximatifs suggèrent que le rendement des neurones Fos-positifs est d'environ 10% du nombre à partir de l'échantillon de tissu striatal disséqués. Le protocole actuel peut être modifié pour convenir à d'autres fins expérimentales. Dans le protocole actuel, le tissu a été recueilli 90 min après les injections de méthamphétamine parce que l'expression de Fos atteint des niveaux maximaux en ce moment, ce qui est crucial pour le tri efficace des neurones Fos exprimant. Cependant, le tissu peut être recueillie à tout point de temps pour FACS, en fonction de l'objectif spécifique de l'expérience. Pour le stockage de l'échantillon initial de tissu, nous avons utilisé avec succès un tissu fraîchement disséqué, congelé les tissus après dissection, ou d'un tissu congelé entier disséqué à partir du cerveau congelé pour isoler les neurones Fos-exprimant l'aide de FACS suivie d'une analyse PCR quantitative de l'expression génique. Pour la fixation et perméabilisation, la durée et la température dans ce protocole (4 ° C pendant 15 min) a été optimisé pour perméabiliser les membranes cytoplasmiques et nucléaires, ainsi que pour fixer le tissu. Les variations de durée et / ou la température peuvent modifier les résultats finaux. D'autres solutions de fixation tels que paraformaldehyde et des détergents non-ioniques tels que la saponine, qui ont travaillé pour les neurones embryonnaires et post-natales 20, peuvent aussi travailler pour les neurones du cerveau adulte. En outre, des billes d'enlèvement myéline peuvent être utilisés comme une modification du protocole courant comme indiqué récemment par FACS du tissu cérébral 21.
Le protocole actuel a deux limites importantes à considérer. Tout d' abord, ce protocole ne convient pas pour la détection de marqueurs de phénotype cellulaire qui sont exprimés principalement dans les synapses (par exemple, la dopamine ou les récepteurs du glutamate) , car ces processus cellulaires sont éliminés des corps cellulaires au cours des étapes de trituration et de dissociation. Une deuxième limite possible est que les longueurs d'ARN obtenus à partir de cellules FACS triés peuvent ne pas être suffisant pour toutes les méthodes d'analyse de l'ARN. les numéros d'intégrité de l'ARN (RIN) pour l'ARN obtenu à partir de cellules triées par FACS sont comprises entre 3,5 2.5-, ce qui correspond à des longueurs d'ARN moyennes plus courtes. Ici, la taille de l'ARN court a été compensée paren utilisant des amplicons relativement courts qPCR de 80-100 pb, comme décrit précédemment 13-15. Nous avons également utilisé ces ARN de longueur plus courte avec succès pour l' analyse des microréseaux 11. Néanmoins, les longueurs d'ARN courts obtenus peuvent ne pas être suffisant pour toutes les méthodes d'analyse de l'ARN. Il convient de souligner que les amorces de PCR qui spécifiquement ciblées jonctions exon-exon trouve que dans l'ARNm totalement épissé dans le cytosol ont été utilisés. Ces amorces ne détectent pas l'ARN contenant un intron du noyau. En outre, nous avons déjà utilisé ce protocole avec les anticorps et le tissu cérébral frais pour détecter la tyrosine hydroxylase dans les récepteurs de la dopamine D1 cytosol et la membrane cellulaire 10. La détection de ces marqueurs de membrane et cytosoliques de cellules indique que la procédure de dissociation produit des cellules pratiquement intactes et non pas seulement les noyaux.
Dans l'ensemble, FACS isolement des neurones à partir d'échantillons congelés ouvre d'autres applications. Aucune différence dans le tri ou expre géniquession a été observée (données non représentées) lorsque les échantillons ont été stockés 3 jours ou 3 semaines à -80 ° C ºC. Trois semaines est un délai raisonnable pour trier tous les échantillons d'une expérience spécifique (20 - 40 échantillons) et isoler l'ARN pour l'expression génique. L'ARN utilisable a aussi été obtenu à partir de tissu cérébral stocké pendant 6 mois à -80 ° C (données non présentées ici). Ainsi, ce protocole pourrait être utile pour FACS isolement de post-mortem des échantillons congelés du cerveau humain qui ont été stockées pendant plusieurs mois, voire des années.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
References
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