Summary
Hier präsentieren wir eine Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Protokoll zu untersuchen molekulare Veränderungen in Fos-exprimierenden neuronalen Ensembles aus frischen und gefrorenen Hirngewebe. Die Verwendung von gefrorenem Gewebe ermöglicht FACS Isolierung von vielen Bereichen des Gehirns über mehrere Sitzungen hinweg die Verwendung von wertvollen tierischen Patienten zu maximieren.
Abstract
Die Studie der Neuroplastizität und molekularen Veränderungen in erlernten Verhaltensweisen aus der Studie von ganzen Hirnregionen zur Untersuchung spezifischer Sätze von spärlich verteilten aktivierten Neuronen Schalt neuronalen Ensembles genannt, die Verbände vermitteln gelernt. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) wurde vor kurzem für erwachsene Rattenhirngewebe und erlaubt die Isolierung von aktivierten Neuronen optimiert Antikörpern gegen den neuronalen Marker NeuN und Fos Protein, ein Marker der stark aktivierten Neuronen verwenden. Bisher Fos-exprimierenden Neuronen und anderen Zelltypen wurden aus frischem Gewebe isoliert, die lange Bearbeitungs Tage und erlaubt sehr begrenzte Anzahl von Gehirnproben brachte nach langwierigen und komplexen Verhaltensverfahren beurteilt werden. Hier fanden wir , dass die Renditen von Fos-exprimierenden Neuronen und Fos mRNA aus dorsalen Striatum ähnlich waren zwischen frisch sezierten Gewebe und Gewebe bei -80 ° C eingefroren 3 - 21 Tage. Zusätzlich bestätigten wir den Phänotypder NeuN-positive und NeuN-negativ sortierten Zellen durch die Bewertung der Genexpression von neuronalen (NeuN), astrozytären (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) und microgial (Iba1) Marker, die das gefrorene Gewebe für FACS Isolierung kann auch verwendet werden , von Glia-Zelltypen. Insgesamt ist es möglich, zu sammeln, zu sezieren und Hirngewebe für mehrere FACS Sitzungen einzufrieren. Dies maximiert die Menge von Daten von wertvollen tierischen Subjekten erhalten, die oft schon lange und komplexe Verhaltensverfahren unterzogen.
Introduction
Während des Lernens bilden Tiere Assoziationen zwischen komplexen Sätzen von hochspezifische Reize. Diese hochauflösende Informationen wird angenommen, dass durch Veränderungen in spezifischen Mustern von spärlich verteilten Neuronen genannt neuronalen Ensembles codiert werden. Neuronale Ensembles durch die Induktion von unmittelbar frühen Gene (IEGs) wie Fos, Arc und Zif268 und ihre Proteinprodukte in Neuronen identifiziert , die waren stark aktiviert während Verhalten oder Cue - Exposition vor kurzem wurde. Fos-exprimierenden Neuronen insbesondere gezeigt wurden 1-4 kausalen Rollen in Zusammenhang und Cue spezifische erlernten Verhaltensweisen zu spielen. Somit einzigartige molekulare neuroadaptations innerhalb dieser aktivierten Fos-exprimierenden Neuronen sind Top - Kandidaten für die neuronalen Mechanismen, die die Verbände , während des normalen Lernen und abnormal Lernstörungen, wie Sucht und posttraumatische Belastungsstörung (PTSD) 5 gelernt kodieren.
fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) wurde Analyse von einzigartigen molekularen neuroadaptations in Fos-exprimierenden Neuronen vor kurzem erlaubt. Durchflusszytometrie und Zellsortierung wurden in den 1960er Jahren entwickelt 6,7 zu charakterisieren und zu isolieren Zellen entsprechend ihrer Lichtstreuung und Immunfluoreszenz - Eigenschaften und sind seit langem in der Immunologie und Krebsforschung eingesetzt. fließen jedoch Zytometrie und FACS erfordert dissoziierten einzelne Zellen, die aus adulten Hirngewebe zu erhalten, sind schwierig. FACS wurde zuerst verwendet , Green Fluorescent Protein (GFP) exprimierenden striatalen Neuronen aus transgenen Mäusen zu isolieren und zu analysieren , die nicht mehr als 8,9 Antikörpermarkierung erforderlich war. Wir entwickelten einen Antikörper-basierten FACS Methode 10 zu isolieren und molekularen Veränderungen bewerten in Neuronen , die durch Drogen aktiviert Fos-exprimierenden und / oder Hinweise in Wildtyp - Tiere 15.11. In diesem Verfahren werden die Neuronen mit einem Antikörper gegen den neuronalen Marker NeuN allgemeinen bezeichnet, während Neuronen stark aktiviertenmit einem Antikörper gegen Fos markiert. Obwohl unsere ursprüngliche Methode Bündelung der erforderlichen bis zu 10 Ratten pro Probe für frisches Gewebe, spätere Änderungen des Protokolls erlaubt FACS Isolierung von Fos-exprimierenden Neuronen und quantitative Polymerase - Kettenreaktion (qPCR) Analyse einzelner Hirnareale von einer einzelnen Ratte 13-15 . Insgesamt wurden einzigartige molekulare Veränderungen gefunden in Neuronen während einer Vielzahl von kontext- und Cue-aktivierte Verhalten in der Suchtforschung 12,14,15 aktiviert Fos-exprimierenden.
Eine große logistische Problem mit der Durchführung FACS auf frischem Gewebe ist, dass es einen ganzen Tag dauert das Gewebe und Verfahren durch FACS zu distanzieren. Darüber hinaus können nur etwa vier Proben pro Tag verarbeitet werden. Dies bedeutet in der Regel, dass nur ein Bereich des Gehirns von jedem Gehirn beurteilt werden kann, und die verbleibenden Gehirnbereiche haben zu verwerfen. Dies ist ein großes Problem für geringen Durchsatz Verhaltens Verfahren wie Selbstverwaltung und vom Aussterben Training, die Chirurgie und viele Wochen intensives Training erfordert. Darüber hinaus macht lange und komplizierte Verhaltensverfahren auf Testtag schwierig es FACS am selben Tag durchzuführen. Es wäre ein erheblicher Vorteil sein, um die Gehirne von den Tieren nach der Verhaltenstests sofort einzufrieren und dann isolieren Fos-exprimierenden Neuronen aus einem oder mehreren Bereichen des Gehirns zu unterschiedlichen Zeiten des Wählens der Ermittler.
Hier zeigen wir, dass unser FACS-Protokoll verwendet werden können, Fos-exprimierenden Neuronen (und andere Zelltypen) zu isolieren sowohl von frischen und gefrorenen Gehirngewebe. Als Beispiel isolierten wir Neuronen aus Rattenstriatum nach akuter Methamphetamin Injektionen und von naiven Ratten ohne Injektionen (Steuerzustand) Fos-exprimierenden. Allerdings kann dieses FACS Protokoll nach jeder Verhaltens- oder pharmakologische Behandlung verwendet werden. Die anschließende qPCR Analyse unserer Proben zeigte, dass die Genexpression von diesen Zelltypen mit Simi bewertet werden konntelar Effizienz von frischem und gefrorenem Gewebe.
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Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren 16 durchgeführt.
Hinweis: Alle Schritte unter Verwendung schwach bindende Zentrifugenröhrchen, die auf Eis gehalten wurden, sofern nicht anders angegeben.
1. Vorbereitung vor dem Gewebeentnahme
- Stellen Sie die Zentrifuge bis 4 o C.
- Feuerpolitur ein Satz von drei Glaspasteurpipetten mit abnehmendem Durchmesser von ca. 1,3, 0,8 und 0,4 mm für jede Probe.
- Bereiten Sie markierten 1,7 ml-Röhrchen mit 1 ml kaltem Puffer A und halten Sie die Röhrchen auf Eis.
- Bereiten Sie einen Eisbehälter das Gehirn schneiden Matrix, Spachteln und Glasplatten (oder umgekehrt Glaspetrischale), auf dem mit dem Sezieren durchzuführen. Pre-Chill zwei oder mehr Rasierklingen auf den Glasplatten und die Verwendung Gewebe Papier alle Instrumente, um zu trocknen, die die t berührenProblem.
- Auftauen Enzymlösung bei Raumtemperatur (RT) für 30 Minuten vor dem Gewebesammlung.
2. Gewebeentnahme und Dissection
- Initiieren Sie die Verhaltens oder pharmakologische Behandlung 90 Minuten vor der Gewebesammlung.
HINWEIS: Für die Ergebnisse hier, akute intraperitoneale Injektionen von 5 mg / kg Methamphetamin an Ratten in einer neuen Umgebung (Testbedingung) und naiven Ratten gehalten durchgeführt in ihre Käfige (Kontrollbedingung) wurden gezeigt. - Anesthetize die Ratte, indem sie in einem Glas Exsikkator Glas mit gesättigten Isofluran platzieren und köpfen die Ratte 30 - 60 sec später eine Guillotine mit.
Mit einer Schere die Haut und Muskel aus dem Kopf zu entfernen und den Schädel aus. Verwenden Sie rongeurs den Schädel zu schneiden und zu öffnen, das Foramen magnum und entfernen Sie den hinteren Teil des Schädels. Verwenden Sie rongeurs entlang der oberen Kanten des Schädels zu schneiden, das Gehirn zu belichten. Achten Sie darauf, nicht das Gehirn zu beschädigen. Mit einem kleinen Spachtel vorsichtig unter eine Schaufeld das Gehirn erhöhen. Heben Sie das Gehirn und schneiden Sie die Nerven , bis das Gehirn 17 frei ist. - Präparieren Gewebe mit Rasierklingen.
HINWEIS: Gewebeproben eine der folgenden Methoden erhalten werden: (2.3.1) frisch sezierten Gewebe; (2.3.2) gefrorene Gewebe nach der Sektion; oder (2.3.3) gefrorenes Gewebe aus gefrorenem ganze Gehirn seziert. Halten Sie das Gehirn Slicing Matrix, Rasierklingen und Glasplatte trocken in der gesamten Dissektion und Prozesse als kondensierte Wasser zerkleinern zu hypotone Lyse von Zellen führen kann. Verwenden Sie Lupen genaue Präparation zu gewährleisten.- Für frisch sezierten Gewebe, legen Sie den frisch extrahierte Gehirn in ein Gehirn Slicing-Matrix (eine Rattenhirn-förmigen Metallform mit Schlitzen für die Rasierklingen in 1 mm Intervallen), die auf Eis gekühlt wurde. Legen Sie zwei oder mehr vorgekühlte Rasierklingen in die Schlitze koronalen Scheiben zu schneiden, die die Hirnregion (en) von Interesse enthalten. Platzieren Sie die Scheibe geschnitten auf der gekühlten Glasplatte.
Hinweis: Präparieren Sie das Gehirn regions von Interesse auf einer gekühlten Glasplatte. - Für gefrorene Gewebe nach der Sektion, sezieren die Hirnregion (en) von Interesse aus Scheiben frisch extrahierte Gehirn, ähnlich wie oben in 2.3.1 beschrieben. Platzieren Sie den sezierten Gewebe in ein Mikroröhrchen und schnell das Gewebe einzufrieren durch Untertauchen des microtube in -40 ºC Isopentan für 20 Sekunden. Halten Sie zu jeder Zeit eingefroren seziert Gewebe in einem -80 ° C Gefrierschrank bis zur Weiterverarbeitung.
- Für gefrorene Gewebe, gefrieren sofort die frisch extrahierte Gehirn in -40 ºC Isopentan und lagern in einem verschlossenen Beutel bei -80 ºC für bis zu 6 Monaten.
- Am Tag der Dissektion, legen Sie das gefrorene Gehirn in einem Kryostaten bei etwa -20 ° C eingestellt (nicht wärmer als -18 ° C) für etwa 2 Stunden die Temperatur zu äquilibrieren.
HINWEIS: Gehirne können bei dieser Temperatur leicht schneiden, während viel kühler Temperaturen das Gehirn zu spröde machen sicher geschnitten werden. - Verwenden Sie Rasierklingen 1 zu schneiden - 2 mm koronalen Scheibendie gefrorenen Gehirne in einem Kryostaten. Verwenden Sie ein abgestumpft 12- bis 16-Gauge-Nadel Gewebe Schläge aus diesen Scheiben unter Frostbedingungen zu erhalten. Halten Sie zu jeder Zeit eingefroren seziert Gewebe bis zur Weiterverarbeitung.
- Am Tag der Dissektion, legen Sie das gefrorene Gehirn in einem Kryostaten bei etwa -20 ° C eingestellt (nicht wärmer als -18 ° C) für etwa 2 Stunden die Temperatur zu äquilibrieren.
- Für frisch sezierten Gewebe, legen Sie den frisch extrahierte Gehirn in ein Gehirn Slicing-Matrix (eine Rattenhirn-förmigen Metallform mit Schlitzen für die Rasierklingen in 1 mm Intervallen), die auf Eis gekühlt wurde. Legen Sie zwei oder mehr vorgekühlte Rasierklingen in die Schlitze koronalen Scheiben zu schneiden, die die Hirnregion (en) von Interesse enthalten. Platzieren Sie die Scheibe geschnitten auf der gekühlten Glasplatte.
- Merken 1 - 2 Tropfen Puffer A die sezierten Gewebe zu bedecken vor dem Hacken. Entfernen der Großteil der weißen Substanz aus dem Gewebe unter Verwendung von zwei Rasierklingen während der Rest der Zerreibungsprozeß Verlust von Neuronen zu verhindern. Wenn mit gefrorenem Gewebe beginnen, lassen Sie dann das Gewebe auf der kalten Glasplatte auftauen für nicht mehr als 1 min vor Buffer Aufbringen einer Lösung.
- Mince das Gewebe 100-mal in jeder orthogonalen Richtung mit einer Rasierklinge auf einer gekühlten Glasplatte. Halten Sie die Rasierklinge senkrecht auf die Glasplatte, wenn zerkleinern.
HINWEIS: Gründliche Hacken- für alle Protokollschritte kritisch ist. - Verwenden Sie Rasierklingen das zerkleinerte Gewebe in Mikrozentrifugenröhrchen mit kaltem Puffer A mit 1 ml zu übertragen das Rohr 3 umkehren - 5 mal keep alle zerkleinerten Gewebes in die Lösung.
3. Zelldissoziationsmedium
HINWEIS: Verwenden Sie sanft über die Enden für alle folgenden Schritte. Verwenden Sie keinen Wirbelmischer verwenden und Luftblasen zu vermeiden, die Zellschäden verursachen.
- Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen bei 110 × g für 2 min bei 4 ºC. Überstand verwerfen. Langsam 1 ml kaltem frisch aufgetauten Enzymlösung auf der Innenwand des Mikroröhrchens (eine Mischung aus proteolytischen Enzymen enthält). Sofort das gesamte Pellet saugen und sanft Pipette nach oben und unten nur 4-mal mit einem mäßig großen Spitzendurchmesser Pipette des zerkleinerten Gewebes Pellet zu zerstreuen.
- Kehren Sie die Mikro - Röhrchen sofort das Pellet zu verhindern , dass auf dem Boden kleben und man die Proben mit End-Over-End - Mischen für 30 min bei 4 o C
- Nach der enzymatischen Gewebe Verdauung, Zentrifuge die Röhrchen bei 960 g für 2 min bei 4 ºC. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 0,6 ml kaltem Puffer A immediately nach dem Puffer A hinzufügen, verwenden die gleiche Pipettenspitze das Pellet zu zerstreuen, indem das gesamte Pellet aufsaugt und sanft Pipette auf und ab 5 mal.
- Mechanisch verreiben das verdaute Gewebe und in 15-ml-Röhrchen sammeln mit den folgenden Schritten. Für jede Probe einen separaten Satz von drei feuerpolierten Pasteur-Glaspipetten verwenden mit einem Durchmesser von etwa 1,3, 0,8 und 0,4 mm an Latex-Lampen absteigend.
- Sanft verreiben jede Probe 10-mal mit dem 1,3 mm Glaspipette. Lassen Sie die Probe für 2 Minuten auf Eis absetzen (die Trümmer und undissoziierten Zellen am Boden absetzen). Die überstehende Flüssigkeit (~ 0,6 ml) aufnehmen und in einem 15 ml konischen Röhrchen (Röhrchen # 1).
- Hinzufügen 0,6 ml einer Lösung für das verbleibende Pellet puffern. Man reibt die Probe 10 mal mit dem 0,8 mm Glaspipette. Lassen Sie die Probe für 2 Minuten auf Eis absetzen. Die überstehende Flüssigkeit (~ 0,6 ml) aufnehmen und in den gleichen 15 ml konischen Röhrchen # 1.
- Hinzufügen 0,6 ml einer Lösung für die restlichen Pelle Buffert. Man reibt die Probe 10 mal mit dem 0,4 mm Glaspipette. Lassen Sie die Probe für 2 Minuten auf Eis absetzen. Die überstehende Flüssigkeit (~ 0,6 ml; ohne das Pellet mit nicht getrennten Zellen berühren) und übertragen auf den gleichen 15 ml konischen Röhrchen # 1.
HINWEIS: Halten Sie den 0,4 mm Durchmesser Pipette in das Röhrchen # 1 für die folgenden Verreiben Schritte. - Wiederholen Sie Schritt 3.4.3 drei weitere Male die kleinste Glaspipette (~ 0,4 mm Durchmesser), und sammeln Sie den Überstand in einen separaten 15 ml konischen Röhrchen (Röhrchen # 2).
- Man reibt die gesammelten Zellsuspensionen in Röhrchen # 1 und # 2 für 10 weitere Male die 0,4-mm-Glaspipette und halten auf dem Eis.
4. Zell Fixierung und Permeabilisierung
- Bereiten Sie 4 Mikroröhrchen pro Probe (zwei Mikro - Röhrchen für Zellen , die aus Rohr # 1 und zwei für Zellen , die aus Rohr # 2) durch Zugabe von 800 ul 100% kaltem Ethanol in jedes Röhrchen (bei -20 ° C vor der Verwendung gelagert) und halten sie auf dem Eis . Hinweis: Die endgültige EthanolKonzentration wird 50% betragen.
- Pipette ~ 800 & mgr; l der Zellsuspensionen (aus Rohr # 1 und # Rohr 2) in jedem der 4 Röhren kaltem Ethanol enthält, und die Rohre zu invertieren, um die Proben zu mischen.
- Röhrchen auf Eis für 15 min, während die Röhren alle 5 min zu invertieren.
- Nach der Fixierung / Permeabilisierung Zentrifuge die Röhrchen bei 1700 × g für 4 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. Verlassen 50 ul Lösung Zellverlust zu verhindern.
HINWEIS: Die Pellets in diesem Stadium sind weiß und haften weniger an der Wand der Rohre als vor Permeabilisierung. Daher entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch die Wand des Mikroröhrchens zu berühren, wo es kein Pellet und der Überstand langsam mit einer Mikropipette erstellen.
5. Zell Filtration
- Re-suspend die Pellets aus Schritt 4.4 mit kaltem PBS wie folgt:
- In 550 ul kaltem PBS auf eine der beiden Mikro-Röhrchen aus Rohr # 1 kommt, und verwenden Sie einen mäßig großen Durchmesser piPette Spitze zu pipettieren sanft die oben Zellsuspension und ab 5 mal. Wiederholen Sie das gleiche für ein Mikroröhrchen aus Rohr # 2 kommt.
- Für Zellen, die aus Rohr # 1, die gleiche Pipette, übertragen Sie die erste Zellsuspension in die zweite Pellet. Resuspendieren der zweiten Pellet durch sanft die kombinierte Zellsuspension bis Pipettieren und ab 5 mal.
- Für Zellen , die aus Rohr # 2, suspendieren und kombinieren die Pellets (dh dritten und vierten Mikro - Röhrchen) , wie in 5.1.2 beschrieben.
- Filtern Sie die zwei Zellsuspensionen aus den Schritten 5.1.2 und 5.1.3 separat mit zwei verschiedenen Paaren von Zellsiebe (100 & mgr; m und 40 & mgr; m Porengröße) wie folgt:
- Vorbefeuchtenden jeder Zellsieb durch PBS an der Innenseite des Siebes hinzugefügt wird. Verwenden einer Pipette das überschüssige PBS von der Außenseite des Filters zu entfernen.
- Pipette, um die Zellsuspension aus Schritt 5.1.2 gleichmäßig auf die erste Zelle Sieb mit 100 & mgr; m Porengröße. Sammeln Sie die Flow-Through in einem 50 ml-Röhrchen auf Eis. Verwenden Sie die piPette die fließ zu sammeln durch an der Außenseite des unteren Zellsieb befestigt.
- Verwenden Sie die gleiche Pipette, um die Durchfluss von 100 & mgr; m Zellsieb auf die 40 & mgr; m Zellsieb zu übertragen. Sammeln Sie diese Durchfluss in einem anderen 50-ml-Röhrchen auf Eis. Wenn die Strömung der Übertragung durch 40 & mgr; m Zellsieb, ändern Spitzen neue Pipette Kontamination von 100 & mgr; m Zelle Sieb zu vermeiden.
- Wiederholen Sie diese Schritte für die Zellsuspension aus Schritt 5.1.3 eine neue Reihe von Filtern.
- Verbinden die beiden Durchströmungs von jeder Probe auf ein Endvolumen von etwa 1 ml pro Probe.
6. Inkubation mit Antikörper
HINWEIS: Verwenden Sie kleine Teilmengen der Gehirnzellsuspensionen für die Festlegung geeigneter Durchflusszytometer Einstellungen auf die Führung der Hauptprobe vor mehreren Kontrollproben vorzubereiten. Für jede Antikörpermarkierung, Kontrollproben herzustellen, die keine Antikörper enthalten, nur die sedäre Antikörper (oder andere Fluoreszenzmarkierung), und dann werden beide primären und sekundären Antikörper (oder andere fluoreszierende Markierung). Verwenden Sie diese Steuerelemente, die Tore zu setzen, die im Durchflusszytometer im Vergleich zu nicht-spezifische Markierung spezifischen trennen. Wenn möglich, verwenden Sie Fluorochrome, die keine Entschädigung verlangen. Erhöhung um das Endvolumen der Gating-Kontrollproben auf ein Endvolumen von 700 & mgr; l von PBS vor Zugabe der primären Antikörper zu addieren.
- Bereiten Lichtstreuung und DAPI Kontrollprobe durch eine 100 ul Probe der filtrierten Zellen zu einem 1,7 ml Mikroröhrchen übertragen. Hinzufügen, 600 & mgr; l kaltem PBS mit 1 & mgr; g / ml DAPI für Kerne Färbung. Inkubieren für 10 min mit end-over-end Mischen und wasche (wie in den Schritten 6.4.2 bis 6.4.5 dargestellt) vor Zytometer durch den Strömungs verläuft.
Hinweis: Dieses Beispiel nur dann verwendet wird, um die Zelle / Kerne Tor vor der Sortierung der verbleibenden Zellen in der FACS-Maschine einzustellen. - Bereiten Sie einzelne immunKontrollProben durch die Übertragung von 100 & #181; l der filtrierten Zellen zu einem 1,7 ml Mikroröhrchen. In 600 ul kaltem PBS mit einem Antikörper (zB NeuN Antikörper). Hinzufügen , 600 & mgr; l kaltem PBS zu einem Mikroröhrchen mit einem anderen Antikörper (beispielsweise Fos - Antikörper). Fügen Sie die entsprechenden sekundären Antikörper, wenn es nicht eine direkte konjugierte primäre Antikörper ist.
ANMERKUNG: Diese Proben werden verwendet, um die entsprechenden Fotovervielfacherröhre (PMT) Spannung zu bestimmen, und die Überlappung der beiden Fluoreszenzsignale bei Bedarf zu beurteilen. Antikörperkonzentrationen sollte das beste Signal-Rausch-Verhältnisse in allen Kanälen zu erreichen, titriert werden. Lappenden Fluoreszenzsignale können auch durch interne Kalibrierung unterschiedlicher Fluoreszenzkanäle innerhalb des Durchflusszytometers kompensiert werden. - Bereiten Sie doppelt fluoreszenzmarkierten negativen Kontrollprobe durch die Übertragung von 100 ul der gefilterten Zellen zu einem 1,7 ml Mikroröhrchen. In 600 ul kaltem PBS mit den sekundären Antikörper alleine oder IgG Direkt konjugierte primäre Antikörper.
HINWEIS: This Kontrollprobe kann jedes Mal, bevor die Sortierung verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz für jedes Fluorophor zu bestimmen. - Bereiten Hauptprobe sortiert werden.
- Übertragung von 700 & mgr; l der filtrierten Zellen in einem 1,7 ml Mikroröhrchen. ADD 7 ul (1: 100) des primären Antikörpers konjugiert Fos direkt an Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) und 1,4 ul (1: 500) der primären NeuN Antikörper konjugiert direkt an Phycoerythrin (anti-NeuN-PE). Die Röhrchen für 30 min bei 4 ºC mit end-over-end Mischen.
- Am Ende der Inkubation fügen 800 ul kaltem PBS in jedes Mikroröhrchen, einschließlich der Hauptprobe und die Kontrollproben und durch Umdrehen gemischt.
- Zentrifuge Mikro-Röhrchen bei 1300 × g für 3 min bei 4 ºC. Überstand verwerfen, 50 & mgr; l Überstand zu verlassen Zellverlust zu verhindern.
- 1 ml kaltem PBS zu dem Pellet und resuspendieren Zellen mit einer Pipette mit einem mäßig großen Spitzendurchmesser verwendet wird.
- Zentrifuge bei 1300 × g für 3 min bei 4 ºC. Discard den Überstand.
- Resuspendieren des Pellets in 500 ul kaltem PBS (Endvolumen einstellen Abhängigkeit der Größe des Pellets).
- Übertragung und filtern Sie die Suspension in einen Rundboden FACS Probenröhrchen mit einer Zelle Sieb Kappe (40 & mgr; m). Halten Sie die immun Zellen auf Eis und sofort FACS durchführen. Hinweis: Für die Filterung, berühren Sie die Pipettenspitze senkrecht auf dem Sieb Kappe und drücken Sie die Zellsuspension durch.
- Stellen Sie Durchflusszytometer Tore Kontrollproben.
- Verwenden Sie die Lichtstreuung und DAPI Kontrollprobe, die neuronale Zellpopulation von den gesamten Ereignisse und Zelltrümmer zu identifizieren.
HINWEIS: Zellkörper in diesem Präparat sind nur 1 bis 2% der gesamten Ereignisse (der Rest sind Schutt und Bruch zelluläre Prozesse). Basierend auf DAPI Fluoreszenzsignal (was anzeigt, Kerne) und Vorwärtsstreuung (Größe der Zelle) ist es möglich, Zellkörper und Tor nach hinten auf der Vorder- und Seitenlichtstreuungseigenschaften von der Basis lokalisierendie Zellen (wie in Figur 1 A, B gezeigt). - Verwenden Sie die einzelnen immunKontrollProben die PMT Spannungseinstellungen , um zu bestimmen, und von einem spezifischen Fluorochrom in einen anderen Filter / Kanal (zB Alexa Fluor 488 / FITC oder Phycoerythrin) Schwappen Emission zu analysieren. Wenn Fluoreszenzsignale überlappen, korrigieren Sie die Überlappung von Kompensationsstufen manuell eingestellt werden.
- Verwenden Sie die Doppelfluoreszenzmarkierte Negativkontrolle den Grenzwert für die positive Bevölkerung einzurichten.
HINWEIS: Das Signal von dieser Probe kommt, wird gedacht, um Autofluoreszenz und die Zellen der Hauptprobe über dieser Schwelle liegt aufgrund sein kann als positiv betrachtet werden. Typischerweise werden die Schwellenparameter für die Sortierung strengerer und ungefähr die oberen zwei Drittel der markierten Zellen über der Negativkontrolle tatsächlich sortiert.
- Verwenden Sie die Lichtstreuung und DAPI Kontrollprobe, die neuronale Zellpopulation von den gesamten Ereignisse und Zelltrümmer zu identifizieren.
- Sortieren Sie die Neuronen, die aus der Hauptprobe durch FACS in 1,7 ml Mikroröhrchen. Sammeln Sie die Zellen in 50 ul RNAExtraktionspuffer. Nach dem Sortieren, Wirbel und Zentrifuge das Rohr und die Suspension mischen durch Pipettieren nach oben und unten 10-mal alle sortierten Zellen von den Wänden des Rohres zu erholen.
- Inkubieren der sortierten Zellsuspension bei 42 ºC für 30 min, um sicherzustellen, dass alle Zellen vor der RNA-Extraktion lysiert werden, und dann bei 2.800 × g für 2 min bei 4 ºC zentrifugiert.
- Den Überstand auf ein RNase-freies Röhrchen für die Langzeitlagerung bei -80 ºC oder unmittelbar verarbeiten , um die Probe für die RNA - Isolierung, cDNA - Synthese, Zielgen Vorverstärkung und qPCR, wie zuvor 13-15 beschrieben.
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Representative Results
Sortierung Fos-positive und Fos-negativen Neuronen aus frischen und gefrorenen dorsalen Striatum Gewebe aus einzelnen Ratten nach akuter Methamphetamin Injektionen.
Die oben beschriebenen Protokoll wurde verwendet, Fos-positiven und Fos-negativer Neuronen von einer einzigen Ratte dorsalen Striatum 90 Minuten nach einer intraperitonealen Injektion von Methamphetamin zu sortieren (5 mg / kg). Naïve Ratten in ihre Käfige wurden als Kontrollen verwendet. Dorsalen Striatum-Gewebe wurde verarbeitet, entweder unmittelbar nach seiner Sammlung (frisches Gewebe) oder verarbeitet nach eingefroren und gelagert in -80 ºC für 1, 7 oder 21 Tage. Die Ergebnisse aus diesen Gefrierzeitpunkten waren nicht signifikant verschieden voneinander, so wurden die Daten gepoolt.
So stellen Sie die Sortierbedingungen auf dem Gerät nach oben, Kontrollproben (oben beschrieben) entweder aus dem Käfig Kontrolle oder methamphetamine-injizierten Gruppen wurden verwendet. Wenn jedes Partikel oder ein Ereignis in diesen Proben tritt durch die Strömungszelle in der Zytometer, werden sie eine Identifizierungsnummer gegeben, die mit dem Ereignis der Lichtstreuung und Fluoreszenzeigenschaften und aufgezeichnet in einem Tabellenkalkulations zugeordnet ist. Die Ereignisse in diesem Blatt kann dann in Scatterdigramme oder Dichteplots für diese Merkmale (Abbildung 1) organisiert werden. Ereignisse mit ähnlichen Eigenschaften können dann durch verschiedene Paare von Merkmalen gruppiert oder 'gated' werden die Tore wie solche, die Zellen, Neuronen oder Fos-positiven Neuronen zu bestimmen. Sobald die Gatter oben beschrieben die Kontrollproben bestimmt werden, verwendet, wird der Hauptprobe Zytometer in die Strömung eingespritzt und sortiert nach diesen Gattern. Die Zellpopulation wurde von allen Ereignissen (Zellen und Debris) gated auf der Grundlage ihrer Vorwärtslichtstreuung (FSC; einen Hinweis auf die Größe der Partikel) und Seitenlichtstreuung (SSC; eine Anzeige des Teilchens granularity). Wie in der FSC gegen SSC Dot - Plot (1A und 1B) gezeigt, zeigt die Dichteverteilung aller Ereignisse eine kleine homogene Population mit ähnlicher Größe und Granularität, zusätzlich zu einer großen heterogenen Population (1A und 1B). Eine kleine homogene Population , die Zellkörper enthält , wurde als "Zellen" identifiziert und gated, basierend auf FSC und SSC Eigenschaften aus früheren Studien 11,13-15 und Kennzeichnung mit DAPI. Ein etwas höherer Prozentsatz der Zellen wurden aus gefrorenen Gewebe (2,6%) erhalten, als aus frischem Gewebe (1,9%). Die große heterogene Bevölkerung ist vor allem Schutt, vermutlich von Dendriten und Axonen Prozesse.
Als nächstes wurden einzelne Zellen aus der "Zellen" Tor auf ihrer Größe identifiziert basiert, die durch die Breite des FSC-Signal für jedes Ereignis auf der x-Achse angegeben wurde. Ereignisse, die größer als einzelne Zellen waren, wurden Zellaggregate in Betracht gezogen und von dem ausgeschlossenen "Single Zellengate. Alle nachfolgenden Analyseschritte wurden innerhalb dieser durchgeführt" Single cell "Gatter (1C und 1D). Die Mehrheit dieser Einzelzellpopulation (> 92%) war positiv für DAPI - Färbung (Daten nicht gezeigt).
Zunächst wurden Neuronen auf der Grundlage ihrer PE - Fluoreszenzintensität identifiziert , die NeuN-Immunreaktivität (1E und 1F) angegeben. Neurone etwa 24% aller Ereignisse aus der "Single-Zelle" Tor für gefrorene Gewebe für frisches Gewebe und 38% liegt. Fast alle der Ereignisse in diesem "Neuron" Tor (98% in frischem Gewebe und 99% in gefrorenem Gewebe) waren positiv für DAPI - Färbung von DNA in den Zellkernen (1G und 1H). Die übrigen DAPI-markierten Ereignisse in der Einzelzelle Gate sind NeuN-negativ und beinhalten Glia, Oligodendrozyten und Mikroglia, wie qPCR in Abbildung 3 bestätigt.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Dann wurden Neuronen klassifiziert als Fos-positive oder Fos-negativen Neuronen auf der Grundlage ihrer Alexa Fluor 647 Fluoreszenzsignal (Fos-Immunreaktivität) Im Gegensatz zu Zelltyp-Marker, Fos. Expressionsniveaus in Neuronen allmählich wegen Niveaus neuronaler Aktivität und zeitlichen Verlauf unterscheiden. Daher wird es keine klar Schnittschwelle zwischen Fos-positiven Vergleich Fos-negativen Neuronen. in dem ersten Schritt (nur verwendet werden für die off-line-Analysen berechnen Prozentsätze von Fos-positiven Neuronen) definierten wir die Schwelle für Fos-positiven Neuronen auf der Basis der maximalen Alexa-647-Fluoreszenz (für Fos) von der NeuN negativen Population in der naiven Käfig Hause Kontrollratten. Fos-positiven Neuronen gekennzeichnet sind in den blauen Quadraten aus verschiedenen experimentellen Bedingungen in Abbildung 2 in beiden frischen und gefrorenen Gewebe, die prozentualen Fos-positiven Neuronen von Methamphetamin-injizierten Ratten. (1,9 bis 2,2%, 2C und 2D) war zweimal als Compared zu Hause Käfig Ratten (0,7 bis 0,8%, 2A und 2B).Bestätigung Zelltyp-spezifische Gene von FACS-sortierten Zellen unter Verwendung Zielgen Vorverstärkung und RT-PCR.
Im zweiten Schritt, um sicherzustellen, nur Fos-positiven Neuronen von der Hauptprobe für eine nachfolgende mRNA Sortieranalysen und die Aufnahme von Fos-negative Zellen zu reduzieren, wurde die Alexa-647 Fluoreszenzschwelle angehoben, so daß nur die oberen zwei Drittel der Fos -positive Ereignisse in den blauen Quadraten wurden sortiert und gesammelt. Diese Schwelle hat mindestens 10-fach höhere Fluoreszenz (höhere Fos-Expression pro Zelle) als die Schwelle oben verwendeten Prozentsatz von Fos-positiven Neuronen in den Proben zu berechnen. Vier Populationen von Zellen, die aus einem einzigen Gewebeprobe sortiert wurden, einschließlich NeuN-negativ + Fos-negativ (~ 5.000 Veranstaltungen), NeuN-negativ + Fos-positive (reichten von 25 bis 83 Ereignisse), NeuN-positiv + Fos-negtive (~ 5.000 Veranstaltungen) und NeuN-positiv + Fos-positive (reichten von 44 bis 133 Veranstaltungen für die Heimatgruppe, 185-450 Veranstaltungen für die Methamphetamin-Gruppe). Zunächst wird die Expression von Zelltyp - spezifischen Genen in NeuN-positive (einschließlich sowohl Fos-positiven und Fos-negativ) und NeuN-negativen Population (einschließlich sowohl Fos-positiven und Fos-negativ) wurde bestätigt (Abbildung 3). GAPDH war als Referenz / Housekeeping - Gen, basierend auf den Ergebnissen unserer früheren Studie 13 verwendet. Zu steuern , um verschiedene Ebenen von RNA in der Probe und cDNA in den PCR - Reaktionen wurden duplex qPCR - Reaktionen unter Verwendung von Primern durchgeführt für sowohl das Zielgen und GAPDH cDNA. Ct - Werte für das GAPDH Housekeeping - Gen wurden zwischen 15 und 31 für genaue Messungen gehalten. Sowohl für die frischen und gefrorenen Gewebe wurden NeuN - mRNA - Spiegel signifikant höher (ca. 8-fach) in der NeuN-positiven Bevölkerung als in der NeuN-negativen Population (p <0,05; 3A GFAP (glial Zellmarker, 3B) und Oligo2 (Oligodendrozyten - Zellmarker; 3C) mRNA - Spiegel waren größer in der NeuN-negativen Bevölkerung als in der NeuN-positiven Population (p <0,05 ). Ein ähnlicher Trend höherer Iba1 (Mikroglia - Zellmarker; 3D) mRNA - Spiegel wurde in der NeuN negativen Population beobachtet, aber dies war statistisch nicht signifikant. Einige Proben enthielten extrem niedrige Niveaus bestimmter mRNAs , die nicht genau in einem bestimmten Zelltyp (beispielsweise GFAP mRNA in NeuN-markierten Neuronen) gemessen werden konnte. Maximum Ct-Werte wurden als 35 definierten Werte zu eliminieren, die zu niedrig waren, genau erfasst werden. Höhere Ct-Werte überschritten die Vertrauensgrenze in unseren qPCR-Assays.
Fos - mRNA - Expression warin der NeuN-positive neuronalen Population von Ratten untersucht , die eine einzige Injektion von Methamphetamin (Figur 4) erhalten. Sowohl für die frischen und gefrorenen Gewebe wurden Fos - mRNA - Spiegel größer in den Fos-positiven Neuronen als in den Fos-negativen Neuronen (p <0,05). Hinzu kommt, dass es sich um ein 3-fachen Anstieg von Fos - mRNA in Fos-positiven Neuronen aus dem frischen Gewebe, eine 11-fache Steigerung der Fos - mRNA in Fos-positiven Neuronen aus dem gefrorenen Gewebe nachgewiesen wurde. Zusammengenommen bestätigen diese mRNA Ergebnisse, die die Identität der Fos-positiven Neuronen, Fos-negativen Neuronen und nicht-neuronalen Population von frischem und gefrorenem Gewebe. Weiterhin Zelltyp-spezifische Gene und andere Gene von Interesse können auch beide aus sortierten Zellen unter frischen und gefrorenen Bedingungen analysiert werden.
Abbildung 1. Gating von Disvergesellschafteten und Beschriftet Zellen aus frisch und gefroren Ratte dorsale Striatum. Das Tor "Zellen" durch Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften (AD) und bestätigt durch positive Markierung mit nuklearen DAPI - Färbung (GH) bestimmt. Das Tor "Neurone" in der Bevölkerung "Zellen" wurde durch Fluoreszenz für NeuN (; EF PE) bestimmt. (A - B) Zell Tor: Linear Plot aller Ereignisse auf der Grundlage ihrer Vorwärtsstreuung (X-Achse, die Zellgröße) und Seitenstreuung (Y-Achse, Granularität). (C - D) Einzelzellen - Gate: Linear Grundstück von Vorwärtsstreuung Höhe (Y-Achse) und Breite (X-Achse) innerhalb der Zelle Tor in AB gezeigt. (E - F) Neuron Tor: Logarithmische Auftragung der Immunofluoreszenz für PE-markierten NeuN (Y-Achse) in der Einzel - Gate - Zellen in CD gezeigt zeigt Neuronen im oberen Cluster von Ereignissen und nicht-neuronalen Zellen im unteren Cluster. (G H) Nuclei Färbung: Logarithmische Auftragung der Fluoreszenz für DAPI-markierten Kerne (Y-Achse) innerhalb der neuronalen Zell Tor. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Gating von Fos-positiven und Fos-negativen Neuronen aus frisch und gefroren Rat dorsale Striatum Basierend auf Doppelmarkierung für NeuN und Fos. Die frischen und gefrorenen dorsalen Striatum von Ratten (direkt aus ihrem eigenen Käfig oder 90 min nach einer einzigen genommen intraperitoneale Injektion von Methamphetamin) wurden gespalten und mit den direkt konjugierten Antikörpern gegen NeuN und Fos beschriftet und sortiert, um eine FACS-Maschine. Sortier basierte auf Phycoerythrin (PE) -markierten NeuN Immunofluoreszenz (X-Achse) und Alexa 647-markiertem Fos immunofluoFluoreszenz (Y-Achse). Fos-positive (blaue Punkte) und Fos-negativ (rote Punkte) Neuronen in den oberen und unteren rechten Quadranten angeordnet wurden, beziehungsweise. Die Dot-Plots zeigen NeuN-positiven Zellen (Neuronen) und NeuN-negativen Zellen (graue Punkte); die blauen Quadrate zeigen Neuronen mit überSchwellen Fos-Expression. (A - B) Startseite Gruppe: naive Ratten direkt aus ihren Käfigen genommen. (C - D) Methamphetamin Gruppe: Ratten , die einzelne Injektionen von Methamphetamin erhalten. Die Schwellenwerte für Fos-positiven Neuronen wurden knapp über maximal Alexa-647-Fluoreszenz (Fos-IR) beobachtet für NeuN-negative Zellen in der Heimkäfig Kontrollgruppe gewählt. Während 0,7-0,8% aller Neuronen in der Stammgruppe Fos-positiv sind, 1,9 bis 2,2% aller Neuronen sind Fos-positiv in der Methamphetamin-Gruppe.
Figur 3. Zelltyp - spezifische Gene Expression in FACS-sortierten Zellen aus frisch und gefroren Rat dorsale Striatum. NeuN-positiven Neuronen (Fos-positive und Fos-negativ) und NeuN-negativen Zellen (Fos-positive und Fos-negativ) wurden sortiert wurden unter Verwendung des beschriebenen Protokolls und mRNA - Expressionsniveaus von Zelltyp - spezifischen Genen verwendet Zellsortierung zu bestätigen. (A) NeuN ist ein Marker für neuronale Zellen. (B) GFAP ein Marker für Gliazellen ist. (C) Oligo2 ein Marker ist für Oligodendrozyten - Zellen. (D) Iba1 ist ein Marker für Mikroglia - Zellen. Für NeuN mRNA, Daten sind als Mittelwert ± SEM von Falten Werte relativ zu Expressionsniveaus in NeuN-negativen Zellen , die aus dem frischen Gewebe (- 14 n = 9) dargestellt. Für GFAP (n = 6 bis 12), Oligo2 (n = 9 bis 11) und Iba1 (n = 5 bis 8) mRNA werden Daten dargestellt als Mittelwert ± SEM von Falten Werte in Bezug auf die Expressionsniveaus in NeuN-positiven Zellen aus dem frischen Gewebe. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Fos - mRNA - Spiegel in FACS-sortiert Neurons von frischen oder gefrorenen Ratten - Striatum Dorsal nach Methamphetamin - Injektion. Fos-positiven und Fos-negativer Neuronen wurden wie in dem obigen Protokoll und mRNA - Spiegel von Fos bestätigt wurde beschrieben sortiert. Daten sind als Mittelwert ± SEM von Falten Werte relativ zu Expressionsniveaus in Fos-negativer Neuronen aus dem frischen Gewebes dargestellt (n = 3 bis 4).
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Discussion
FACS verwendet werden Neuronen zu sortieren und andere Zelltypen entweder frisch oder gefroren adult Hirngewebe. Wie in der Einleitung erwähnt, ermöglicht die Fähigkeit, gefrorene Gewebe zu verwenden, eine optimale Nutzung von Proben von Tieren, die komplexe und langwierige Verhaltensverfahren, wie zum Beispiel Selbstverwaltung und Rückfall-Studien in der Suchtforschung unterzogen wurden. Diese Verhaltensverfahren dauert in der Regel 1 bis 2 Stunden oder länger, und verlangen , dass alle Tiere (10 - 20 insgesamt) am selben Tag 13,18 getestet werden. Es dauert ca. 4 Stunden 4 frisch seziert Gehirngewebeproben zu verarbeiten, die Gehirnsezierung umfasst, Zelldissoziationsmedium, Permeabilisierung und Immunmarkierung. Nach der Verarbeitung nimmt jede Probe durch FACS-Sortierung zwischen 20 - 30 min. Der letzte Schritt der sortierten Zellen in dem Lysepuffer von Erhitzen erfordert weitere 30 min. Insgesamt ~ 7 h werden aus Gehirnsezierung der endgültigen RNA-haltigen Zell-Lyselösung Schritt erforderlich. Jedoch ist es nun möglich, ganze brai einzufrierenns oder frisch Gehirnregionen unmittelbar nach dem Test seziert, und sie später zu verarbeiten. Dies vereinfacht die Prüfung und ermöglicht, dass mehrere Gehirnbereiche an einem anderen Tag sortiert werden. das Gewebe vor der FACS Einfrieren können auch Ergebnisse zu verbessern. Mehr NeuN-positive Neurone aus gefrorenen Gewebeproben erhalten. Dies könnte teilweise durch erhöhte NeuN-Kennzeichnung erklärt werden wegen Störung der Zellmembranen während des Einfrierens und anschließenden Auftauen, die Antikörper Zugriff auf intrazelluläre Proteine erhöhen würde, wie NeuN und Fos. Ähnliche Effekte wurden mit 19 - Fibroblasten, Epithelzellen und HeLa - Zellen beobachtet.
Die Ausbeute an Zellen und Neuronen können mit den folgenden Schritten maximiert werden. Während Präparation des Gewebes zu entfernen Mehrheit der weißen Substanz (Corpus callosum und vordere Kommissur für den dorsalen Striatum und Nucleus accumbens, beziehungsweise). Dies verhindert, dass aus dem Gewebe in die Kunststoffspitzen haften und Glaspipetten in der nachfolgenden steps. Verwenden Puffer A (siehe Spezifikation in der Tabelle von Materialien und Reagenzien) bedeckt die sezierten Gewebe zu halten. Dies verbessert die Qualität der Zellen während der Rasierklinge (Schritt 2.5) des Gewebes zerkleinern. Der zusätzliche Satz von 3 Verreiben Schritte mit dem kleinsten Glaspipette (Schritt 3.9) und anschließender Filterung mit einem zweiten Satz von Zellsiebe (Schritt 5) verdoppelt sich die Ausbeute an Zellen und Neuronen. die Zelle strainers wiederverwendet werden die Filter und geringere Zellausbeute verstopfen. Seien Sie sanft mit den Zellen, wenn die Pellets Resuspendieren und während Verreiben. Die Verwendung eines mäßig große Pipettenspitze während dieser Schritte wird eine Zellschädigung aufgrund von Stress Scherung zu verringern. Sorgfältig das Pellet zu sehen, wenn Überstand nach Permeabilisierung mit Ethanol (Schritt 4.4) zu entfernen. Das Pellet wird weniger kompakt und kann entlang der Wand des Mikrozentrifugenröhrchen verteilt. Grobe Berechnungen deuten darauf hin, dass die Ausbeute von Fos-positiven Neuronen beträgt etwa 10% der Ausgangsnummer im Striatum Gewebeprobe seziert. Das aktuelle Protokoll kann modifiziert werden, um andere experimentelle Ziele zu entsprechen. In der aktuellen Protokoll wurde das Gewebe 90 Minuten nach Methamphetamin Injektionen gesammelt, da Fos-Expression das maximale Niveau zu dieser Zeit erreicht, die für eine effiziente Sortierung von Fos-exprimierenden Neuronen entscheidend ist. Gewebe kann jedoch für FACS zu jedem Zeitpunkt gesammelt werden, je nach dem spezifischen Ziel des Experiments. Für die anfängliche Gewebeprobenlagerung haben wir frisch sezierten Gewebe, gefrorene Gewebe nach der Sektion oder gefrorenem Gewebe seziert aus gefrorenem ganze Gehirn zu isolieren Fos-exprimierenden Neuronen mittels FACS, gefolgt von qPCR Analyse der Genexpression erfolgreich eingesetzt. Zur Fixierung und Permeabilisierung, die Dauer und die Temperatur in diesem Protokoll (4 ºC für 15 min) wurde sowohl cytoplasmatische und Kernmembranen zu Permeabilisierung optimiert sowie das Gewebe zu reparieren. Variationen in Dauer und / oder Temperatur können die endgültigen Ergebnisse ändern. Andere Fixierungslösungen wie paraformaldehyde und nichtionische Detergenzien, wie Saponin, die für die embryonale und postnatalen Neuronen 20 arbeiten können auch für Neuronen aus erwachsenen Gehirn gearbeitet haben. Weiterhin kann myelin Entfernung beads als Modifikation des aktuellen Protokoll verwendet werden , wie kürzlich für 21 FACS aus Hirngewebe gezeigt.
Das aktuelle Protokoll hat zwei wichtige Einschränkungen zu beachten. Zunächst wird dieses Protokoll nicht zur Detektion Zellphänotyp Marker geeignet , die in erster Linie in Synapsen (zB Dopamin oder Glutamat - Rezeptoren) , da diese Zellprozesse entfernt werden aus den Zellkörpern während der Verreibung und Dissoziation Schritte exprimiert werden. Eine zweite mögliche Einschränkung ist, dass die RNA Längen von FACS-sortierten Zellen erhalten werden, nicht für alle RNA Analyseverfahren ausreichend sein. RNA-Integrität Zahlen (RIN) für RNA aus FACS erhalten sortierten Zellen sind zwischen 2.5- 3.5, die kürzere durchschnittliche RNA Längen entspricht. Hier wurde die kürzeren RNA Größe kompensiert durchmit relativ kurzen qPCR Amplikons von 80 bis 100 bp, wie zuvor 13-15 beschrieben. Wir haben auch 11 diese kürzere Länge RNAs erfolgreich für Microarray - Analyse eingesetzt. Dennoch werden kurze RNA-Längen erhalten möglicherweise nicht ausreichend für alle RNA-Analyse-Methoden. Es sollte betont werden, dass die PCR-Primer, die gezielt Exon-Exon-Verbindungen nur in vollständig gespleißten mRNA im Cytosol verwendet wurden gefunden. Diese Primer nicht erkennen Intron-enthaltende RNA aus dem Zellkern. Darüber hinaus haben wir zuvor dieses Protokoll mit Antikörpern und frisches Gehirngewebe verwendet , um Tyrosin - Hydroxylase im Cytosol und D1 Dopamin - Rezeptoren in der Zellmembran 10 erfassen. Detektion dieser cytosolischen und Zellmembranmarker zeigte, daß die Dissoziation Verfahren weitgehend intakten Zellen produziert und nicht nur Kerne.
Insgesamt FACS Isolierung von Neuronen aus gefrorenen Proben öffnet andere Anwendungen. Keine Unterschiede in der Sortierung oder Gen expression beobachtet (Daten nicht gezeigt), wenn die Proben bei -80 3 Tage bis 3 Wochen gelagert wurden ºC. Drei Wochen ist eine angemessene Zeit, um alle Proben aus einem bestimmten Experiment zu sortieren (20 bis 40 Proben) und isolieren RNA für die Genexpression. Verwendbare RNA wurde auch aus Hirngewebe für 6 Monate gelagert bei -80 ºC (Daten hier nicht gezeigt) erhalten worden ist. So könnte dieses Protokoll für FACS Isolierung von post-mortem gefrorenen menschlichen Gehirnproben nützlich sein, die für mehrere Monate oder sogar Jahre gelagert wurden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
References
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