CUBIC protokoll Visualiserar proteinuttryck på Single Cell Beslut hela montera hudpreparat
Summary
Denna rapport beskriver en kubisk protokoll för att klargöra hela tjocklek mus hudbiopsier och visualisera proteinuttrycksmönster, celler som förökar och sebocyter på en enda cell upplösning i 3D. Denna metod möjliggör noggrann bedömning av hud anatomi och patologi och onormala epidermal fenotyper i genetiskt modifierade möss linjer.
Abstract
Huden är avgörande för vår överlevnad. Det yttre epidermal lagret består av interfollikulära epidermis, vilket är ett stratifierat skivepitel som täcker större delen av vår kropp, och epidermala bihang såsom hårsäckar och svettkörtlar. Epidermis genomgår regenerering under hela livet och som svar på skada. Detta möjliggörs av K14-uttryck basala epidermala stamceller / progenitorceller populationer som tätt regleras av flera regleringsmekanismer verksamma inom epidermis och mellan epidermis och dermis. Den här artikeln beskriver en enkel metod för att klargöra hela tjocklek mus hudbiopsier och visualisera K14 proteinuttrycksmönster, Ki67 märkt förökande celler, Nile Red märkta sebocyter och DAPI nukleära märkning på en enda cell upplösning i 3D. Denna metod möjliggör noggrann bedömning och kvantifiering av hud anatomi och patologi och onormala epidermal fenotyper i genetiskt modifierade möss linjer. Den kubiska protokollet är the bästa metoden tillgänglig hittills för att undersöka molekylära och cellulära interaktioner i full tjocklek hudbiopsier vid en enda cell upplösning.
Introduction
Huden är avgörande för vår överlevnad. Den består av tre huvudskikt yttre epidermis, dermis och hypodermis. Epidermis är en mycket regenerativ vävnad. Det är en skivepitelcancer stratifierat epitel, bestående mestadels av keratinocyter. Keratinocyter föds i basalskiktet, och röra sig uppåt genom de suprabasala lagren medan differentierande, och så småningom de fälls i det yttre cornified skiktet ungefär en månad efter födseln. Epidermis utvecklar ett antal bihang inklusive hårsäckar och talgkörtlar. Hårsäckarna regenerera även i ett cykliskt sätt under hela livet en. Den regenerativa kapaciteten av epidermis är aktiverad genom närvaron av stam- och stamfaderceller som är belägna i basalskiktet av de interfollikulära epidermis och hårsäckar 2.
Många signalvägar har varit inblandade i epidermal utveckling och förnyelse. Några av dessa inträffar inomendast epidermis, såsom den Hedgehog pathway. Andra signal evenemang äger rum mellan dermis och epidermis 3. Till exempel, är Wnt-signaler från dermis tros vara viktigt för hår follikelutveckling, och de utsöndras av den dermala papillen vid inträde av anagen att aktivera hårsäcken bula stam / progenitor-cellproliferation och hårsäcken tillväxt 4. Det är viktigt att förstå de cellulära och molekylära mekanismer som styr epidermal utveckling och förnyelse för att bättre förstå hur de kan störas i regenerativ hudsjukdom som hudcancer.
Den här artikeln beskriver en C lear, U nobstructed B regn I maging cocktails och C omputational analys (CUBIC) protokoll 5-7 för att klargöra hela montera hudpreparat, och visualisera proteinuttrycksmönster i 3 dimensioner på en enda cell upplösning av konfokalmikroskopi. Den kubiska Metoden innebär nedsänkning av hudvävnad i två aminoalkohol-baserade kemiska cocktails. Dessa lösningar justera brytningsindex i provet huden och lämnar vävnaden transparent och proteinerna intakt, vilket gör att immundetektering vid en enda cell upplösning.
Med hjälp av denna CUBIC protokoll, den basala och prolifererande keratinocyter befolkningen i de interfollikulära epidermis och i hårsäcken avbildades i sin helhet tjocklek hudbiopsier av vildtyp möss med användning av anti-Keratin14 (K14) och anti-Ki67-antikroppar. Talgkörtlar i vildtyp hudbiopsier ades också visualiseras med Nile Red-färgning. Slutligen var de basala keratinocytceller befolkningen i vildtyp och hyperplastiska YAP2-5SA-AC hudbiopsier jämfört 8.
Detta CUBIC protokollet möjliggör visuell bedömning av proteinuttryck i full tjocklek hudbiopsier vid en enda cell upplösning, och är ett viktigt verktyg för att uppskatta epidermal anatomi och morfologiska defekter i huden av genetiskt modifierademöss, och att undersöka de cellulära och molekylära mekanismerna bakom epidermal utveckling och förnyelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
De regulatoriska mekanismer som styr huden utveckling och homeostas oftast studeras i 2D med hjälp av vävnadssnittning och histologisk färgning eller märkning med antikroppar, vilket möjliggör endast en begränsad förståelse för hud morfologi, cellpopulationer eller proteinuttryck. Ett antal metoder har utvecklats för att förbättra visualiseringen av det rumsliga organisering av celler och proteiner vid enstaka cell upplösning i 3 dimensioner i epidermala hela monteringar 10-13. Några av dessa i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Australian Bio-resurser (Garvan Institute, Australien), biologiska Resources Centre (UNSW Australien) och Animal Care & etikkommitté för stöd med djurförsök. Detta arbete stöddes av National Health och Medical Research Council of Australia (Project Grant APP1062720). Dr. Cesar P. Canales är mottagare av en CONICYT-Becas Chile stipendium (# 72.101.076). Mr Bassem Akladios är en mottagare av University International Forskarutbildning Award av UNSW Australien.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
