In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).
Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.
대장은 외부 환경에 노출되어 상기 몸체의 큰 표면이다. 상주 균의 광대 한 배열 장내 미생물 (또는 미생물)를 형성하는 인간의 장내 정착. 이는 최대 100 조 미생물 세포로 구성되어 것으로 추정 생물학 1-3에 알려진 가장 인구 밀도가 세균의 서식지 중 하나 구성된다. 망할 놈의 박테리아는 생존과 4를 곱 장내 틈새 시장을 식민지화. 반환에서, 미생물은 유전자 1 인코딩되지 않은 추가 기능 기능 호스트를 부여한다. 예를 들어, 미생물은 상피 세포의 증식을 자극 스스로 호스트가 생성 할 수없는 비타민을 생산하고, 신진 대사를 조절하고 병원균 4-6을 방지합니다. 이 유익한 관계를 감안할 때, 몇몇 저자는 인간이 박테리아와 인간의 유전자 7,8의 혼합이다 "슈퍼 유기체"또는 "holobionts"것을 제안했다. 제 (인간) 호스트에있는 미생물의 수익에 미치는 영향을 감안할 때, 장내 면역 시스템은 루멘에서 자신의 존재를 가능하게뿐만 아니라 내강 측 9-11에서 침입 병원균을 죽일 공생 미생물을 허용 할 필요가있다. 장내 면역 시스템은 무해하고 잠재적으로 유해한 내강 미생물을 구별하는 메커니즘을 개발했다; 그러나 이러한 메커니즘은 아직 잘 (12)을 이해하지 않습니다. 장 무결성을 유지하는 것은 관용과 면역 (13) 사이의 균형을 유지하기 위해 엄격하게 규제 면역 항상성을 필요로한다. 면역 항상성의 불균형은 염증성 장 질환 (IBD) 3,14로 장 질환의 유도에 기여한다.
크론 병 (CD)과 궤양 성 대장염 (UC) : 두 가지 주요 IBD의 유형이있다. 이러한 질병을 가진 환자는 일반적으로 직장 출혈, 심한 설사와 복통 15, 16 겪는다. IBD의 하나의 원인은 아직유전 적 요인, 환경 적 영향 및 조절 이상 면역 반응의 알 수없는,하지만 조합이 질병 개발 (15)의 키 이벤트가 될 수 있습니다.
IBD에 대한 동물 모델은 50 년 이상 사용되어왔다. 지난 수십 년에 새로운 IBD 모델 시스템은 IBD (17, 18)의 발병 기전에 관련된 여러 가지 가설을 테스트하기 위해 개발되었다. 만성 대장염의 가장 특징으로하는 모델은 T 세포의 항상성 (19, 20)의 붕괴를 유도 T 세포 전달 모델이다. 16,21이 모델은 T 및 – (- / SCID 마우스와 같은 RAG 같은) B 세포가 부족 호스트로 면역 된 마우스에서 나이브 T 세포 전사 포함한다. 이 모델에서 질병의 발달은 체중 설사 존재 감소 신체 활동과 손실을 평가 3-10 주 동안 모니터링된다. 이 때문에 낭비 증후군 (16)이라고합니다. 건강한 쥐에 비해 이식 호스트의 대장 조직 thicke입니다R, 짧고 (16) 무거운. T 개의 셀의 전송 모델을 사용하면, T 세포 개체군은 22 IBD의 병인에 기여할 수있는 다른 방법을 이해할 수있다. T 개의 셀 전송 모델은 항원 특이 적 방식으로 질병 과정에 장갑차 및 T 세포 사이의 상호 작용을 분석하지 않는다. 또한 골수 세포 및 림프구 세포 간의 상호 작용은 염증 창자 (23)의 개발을 담당 할 수 있음을 보여왔다. IBD의 많은 부분이 밝혀져 있지만, 질환의 개발로 이어질 초기 사건은 여전히 명확하게 이해되어야한다.
이는 미생물 전송 대장염이없는 것을 도시하고있다 (24)를 확립 할 수 없다. 최근 몇 이론 IBD는 공생 세균 (25)에 대한 면역 반응의 결과 일 수 있음을 시사한다. 저자는 공생 박테리아 말단 부위에 염증을 유발하는 데 필수적인 것이 제안26. 세균 무연 (GF) 동물 장 면역 체계는 일반적으로 (27, 28)을 손상되지만 완전 권한 장 면역계 (29)의 발전에 관련되는 무균 박테리아 결과의 혼합물이 마우스의 집락. 따라서, 미생물은에 걸리기 또는 장내 염증 30, 31의 개발에 대해 보호하는 메커니즘으로 하나, IBD의 발병 기전에 중요한 요소가 될 것으로 보인다. 현재의 이론에서는 유전 적 소인이 IBD 환자 32, dysbiosis 불리는 미생물 불균형의 결과임을 암시하지만, 분명하지 아직 dysbiosis가 원인 또는 병 (12)의 결과 인 경우. IBD의 개발 미생물의 역할을 고려하여, 시험 관내 실험에서 CD4 + T 세포는 장내 세균 (33, 34)와 펄스 장갑차에 의해 활성화 될 수 있음을 보여 주었다.
또한, 항원은 그 도시 된같은 E. 등 다양한 공생 박테리아 종, 대장균, 박 테로이드, Eubacterium 및 테우스는 CD4 + T 세포 (35)를 활성화 할 수 있습니다. 이 세포를 T로 세균의 항원 제시는 IBD의 개발에 대한 중요성을 나타냅니다. 질병 과정에서 미생물에 의해 도출 된 여러 항원의 복잡성을 줄이기 위하여, 대장균 균주은 OVA 항원을 생성하는 생성되었다. – / – 전송 대장염은 RAG에 OVA 특이 적 T 세포를 주입하여 유도 하였다 OVA 동물 발현 E. 집락 대장균.
이 모델은 3 CR1 CX + 의원, 대장 점막 고유 층 (CLP) (36)의 주요 세포 서브 세트가 전송 중에 CD4 + T 세포와 상호 작용하는 것을 암시하는 최근 증거에 기초 37 대장염. 의원은 돌기 (36), (38, 39)를 이용하여 박테리아 등의 미립자 항원 창자 내강, 샘플링. 이전의 연구의원도 40, 41 루멘 장 도입 등의 OVA와 같은 수용성 항원을, 걸릴 수 있음을 보여 주었다. CLP를에 CX (3) CR1 + 의원의 풍요 로움을 감안할 때, 이러한 세포 내강 박테리아를 샘플링하고 CD4 T 세포와 상호 작용할 수있는 가능성이있다. E. 집락 OVA 특이 적 CD4 + T 세포를 이식 한 생쥐의 공 초점 화상 대장균 CFP-OVA는, CX (3) CR1 + 의원은 항원 중심 대장염의 개발 과정 OT-II CD4 + T 세포와 접촉하는 것을 보여준다. 이 모델은 장내 장갑차 만 장내 루멘에 특정 항원을 발현하는 박테리아에 특이적인 T 세포의 항원 제시 공정을 연구 할 수있다.
다른 모든 모델과 같이, 상술 한 항원 구동 대장염 모델 기술을 수행하는 연구자는 유의해야 할 몇 가지 문제점을 제시 할 수있다. 구약-II 호스트에서 / 레드 + CD4 + T CD62L + 세포를 주입 할 때, 연구자는 복강에 주사 바늘을 삽입하는 것은 매우 온화하고주의해야합니다. 그렇게하지 않으면 사망에이를 수있는 마우스 또는 질병을 유발하지 않습니다 세포의 피하 투?…
The authors have nothing to disclose.
JHN is supported by the Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-19 | |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
Percoll (density 1.124 g/ml) | Biochrome | L-6145 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
FACS Calibur | BD Biosciences | ||
FCS Express V3 software | DeNovo | ||
Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
EasyWin software | Tecan |