Summary

Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l'antigene alle cellule T

Published: September 18, 2016
doi:

Summary

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Abstract

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.

This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

Introduction

L'intestino è il più grande superficie del corpo che è esposto all'ambiente esterno. array Vaste di microbi residenti colonizzano l'intestino umano per formare il microbiota intestinale (o microflora). Questo è stimato a contenere fino a 100 trilioni di cellule microbiche e costituisce uno degli habitat batteriche più densamente popolate noti in biologia 1-3. Nel GIT batteri colonizzare una nicchia intestinale dove sopravvivono e si moltiplicano 4. In cambio, il microbiota dota l'host con l'aggiunta di caratteristiche funzionali non codificati sul suo genoma 1. Ad esempio il microbiota stimola la proliferazione delle cellule epiteliali, produce vitamine che ospita non possono produrre da soli, regola il metabolismo e protegge contro gli agenti patogeni 4-6. Dato questo rapporto vantaggioso, alcuni autori hanno suggerito che gli esseri umani sono "super-organismi" o "holobionts" che sono un mix di batteri e umane geni 7,8. Dato l'impatto positivo del microbiota sull'host (umana), il sistema immunitario intestinale deve tollerare microbi commensali per consentire la loro esistenza nel lume, ma anche uccidere gli agenti patogeni che invadono dal lato luminale 9-11. Il sistema immunitario intestinale ha messo a punto meccanismi per distinguere tra microbi luminali innocui e potenzialmente nocivi; tuttavia questi meccanismi non sono ancora ben compresi 12. Mantenere l'integrità intestinale richiede un omeostasi immunitaria strettamente regolata per mantenere l'equilibrio tra tolleranza e immunità 13. Uno squilibrio nella omeostasi immunitaria contribuisce alla induzione di malattie intestinali come la malattia infiammatoria intestinale (IBD) 3,14.

Ci sono due principali tipi di IBD: malattia di Crohn (CD) e la colite ulcerosa (UC). I pazienti affetti da queste malattie in genere soffrono di sanguinamento rettale, diarrea grave e dolore addominale 15,16. La singola causa di IBD è ancorasconosciuta, ma una combinazione di fattori genetici, influenze ambientali e le risposte immunitarie sregolati potrebbe essere l'evento chiave per lo sviluppo della malattia 15.

Modelli animali per IBD sono stati utilizzati da oltre 50 anni. Negli ultimi decenni sono stati sviluppati nuovi sistemi modello IBD per testare le varie ipotesi riguardanti la patogenesi delle IBD 17,18. Il modello più caratterizzato di colite cronica è il modello di trasferimento di cellule T che induce rottura dell'omeostasi delle cellule T 19,20. Questo modello prevede il trasferimento di cellule T naive da topi immunocompetenti in host che mancano T e cellule B (come RAG – / – e topi SCID) 16,21. Lo sviluppo della malattia in questo modello è monitorato per 3-10 settimane valutando la presenza di diarrea, ridotta attività fisica, e perdita di peso corporeo. Questo si chiama così la sindrome da deperimento 16. Rispetto al topi sani i tessuti del colon degli eserciti trapiantati è Thicker, più corto e più pesante 16. Utilizzando il modello di trasferimento di cellule T, è possibile comprendere come differenti popolazioni di cellule T possono contribuire alla patogenesi delle IBD 22. Il modello di trasferimento di cellule T non analizza le interazioni tra APC e cellule T nel processo della malattia in modo antigene-specifica. È stato dimostrato che una interazione tra cellule mieloidi e cellule linfoidi potrebbe essere responsabile per lo sviluppo di infiammazione intestinale 23. Anche se molti aspetti della IBD sono stati chiariti, gli eventi iniziali che portano allo sviluppo della malattia devono ancora essere ben compreso.

È stato dimostrato che, in assenza del trasferimento microbioti colite non può essere stabilita 24. Recentemente, diverse teorie suggeriscono che IBD potrebbe essere il risultato di una risposta immunitaria contro batteri commensali 25. Gli autori hanno anche proposto che batteri commensali sono essenziali per indurre infiammazione nell'intestino distale26. In assenza di germi (GF) animali il sistema immunitario intestinale è generalmente compromessa 27,28, ma una colonizzazione di questi topi con una miscela di connessione specifici patogeni batteri risultati nello sviluppo della completamente competente sistema immunitario intestinale 29. Quindi, il microbioti sembra essere un elemento chiave nella patogenesi delle IBD, sia come meccanismo che predispone o protegge contro lo sviluppo di infiammazione intestinale 30,31. Teorie attuali suggeriscono che IBD è il risultato di uno squilibrio microbico, chiamato disbiosi, in pazienti geneticamente predisposti 32, ma non è ancora chiaro se il disbiosi è la causa o la conseguenza della malattia 12. Considerando il ruolo dei microrganismi nello sviluppo di IBD, esperimenti in vitro hanno dimostrato che le cellule T CD4 + possono essere attivati ​​da APC pulsate con batteri intestinali 33,34.

Inoltre, è stato dimostrato che gli antigeni dadiverse specie batteriche commensali, come E. coli, Bacteroides, Eubacterium e Proteus, sono in grado di attivare le cellule T CD4 + 35. Ciò indica che la presentazione di antigeni batterici a cellule T è di importanza per lo sviluppo delle IBD. Per ridurre la complessità di molteplici antigeni derivati ​​dalla microflora nel processo di malattia, un ceppo di E.coli è stato creato che produce l'antigene OVA. Trasferimento colite è stata indotta iniettando cellule T OVA-specifici in RAG – / – animali colonizzato con OVA esprimono E. coli.

Questo modello si basa su recenti prove che suggeriscono che CX 3 CR1 + parlamentari, un importante sottoinsieme di cellule nel colon lamina propria (CLP) 36, interagiscono con le cellule T CD4 + durante il trasferimento colite 37. Parlamentari campione lume intestinale per l'antigene di particelle, come i batteri, usando i loro dendriti 36, 38,39. Studi precedentidimostrato che mp può anche assumere antigeni solubili, come OVA, introdotti nel intestinale lume 40,41. Data l'abbondanza di CX 3 CR1 + parlamentari nel CLP, è possibile che queste cellule possono assaggiare i batteri luminali e interagire con le cellule T CD4. Confocale di topi trapiantati con cellule specifiche per OVA T CD4 + colonizzati con E. coli CFP-OVA, dimostrano che CX 3 CR1 + mp sono in contatto con cella OT-II + T CD4 durante lo sviluppo di colite antigene-indotta. Questo modello permette lo studio del processo di presentazione dell'antigene tra APC intestinali e linfociti T specifici solo per particolari batteri antigene esprimendo nel lume intestinale.

Protocol

I topi sono stati allevati e tenuti sotto specifici (SPF) condizioni di assenza di patogeni nella struttura animale della Università di Ulm (Ulm, Germania). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida di utilizzo degli animali locali e il comitato cura e la legge nazionale sul benessere degli animali. 1. Costruzione del PCFP-OVA plasmidi Amplificare il gene full size OVA utilizzando il primer Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTT…

Representative Results

Per stabilire un modello di colite antigene-driven di E. coli è stato costruito che contiene un plasmide in cui il gene per la PCP è fusa alla sequenza codificante per la proteina di pollo ovalbumina e il costrutto di fusione è espresso sotto il controllo del promotore forte costitutivo P iper (Figura 1A). Microscopia fluorescente dimostra che il ricombinante E. coli PCFP-OVA, ma non il parentale E. coli DH10B,…

Discussion

Come per ogni altro modello, il modello di colite antigene-driven sopra descritto può presentare alcuni problemi che il ricercatore di eseguire la tecnica deve essere a conoscenza. Quando si somministra l'OT-II / cellule Rosso + CD4 + T + CD62L dei padroni di casa, l'investigatore deve essere molto dolce e attento a inserire l'ago nella cavità peritoneale. In caso contrario si può provocare la lacerazione della nell'intestino del topo che potrebbe portare alla morte, o…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JHN is supported by the Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).

Materials

LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 244620
Rotary Shake Reiss Laborbedarf e. K. Model 3020 GFL
2 mm gap couvettes  Peqlab Biotechnologie GmbH 71-2020
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-100ML
Gene Pulser Xcell system  BioRad Laboratories GmbH 1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) Difco 244510
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393-5G
SOC Medium Sigma-Aldrich S1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation Kit Roche 11754777001
Agarose Carl Roth GmbH & Co 3810.1
EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 537020 
Gel chamber  PEQLAB Biotechnology GmbH 40-0708
Loading Dye Thermo Fisher R0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder  Thermo Fisher SM0312
Ethidium bromide solution Carl Roth GmbH & Co. KG 2218.3
Photo-documentation system  Decon Science Tech GmbH DeVision G 
DNA sequencing  MWG-Biotech GmbH
Phosphate buffered saline (PBS) Biochrom L182-50
Fluorescent microscope  Zeiss HBO 100
Mini-PROTEAN Tetra System Bio-Rad Laboratories GmbH 1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder  Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue Solution Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
Nitrocellulose membrane  Macherey-Nagel GmbH & Co. KG 741280
Electro blotter  Biometra GmbH 846-015-600
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A6003-25G
Anti-Ovalbumin antibody  Abcam ab181688
Anti-rabbit IgG  HRP Sigma-Aldrich A0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc 32132
Forene Abbott 2594.00.00
FBS Invitrogen 10500-064
Falcon Cell Strainers Fischer Scientific  08-771-19
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134-5G
Tris Base Sigma-Aldrich 10708976001
CD4+ CD62 L+ T isolation kit  Miltenyi Biotec 130-093-227 
MACS LS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Feeding Needle 20G SouthPointe Surgical Supply, Inc FN-7903
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128
Paraffin Sigma-Aldrich 1496904
Hematoxylin Sigma-Aldrich H9627
Eosin Y Sigma-Aldrich 230251 
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779 
Collagenase type VIII Sigma-Aldrich C-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium AppliChem A2044, 9050
Percoll (density 1.124 g/ml) Biochrome L-6145
Sodium azide Sigma-Aldrich 438456
Mouse BD Fc Block BD Pharmingen 553141
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2  BD Pharmingen 553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5  eBioscience 17-0041-83
FACS Calibur  BD Biosciences
FCS Express V3 software DeNovo
Meta scanning confocal microscope  Zeiss LSM 710 
Zeiss Workstation Zeiss LSM 7
Zeiss ZEM software  Zeiss v4.2.0.121
Maxisorp immuno plates  NUNC, Roskilde 442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase Jackson Immuno Research 016-050-084
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma-Aldrich 71768-5G
mAb R4-6A2 BD Biosciences 551216
mAb XMG1.2  BD Biosciences 554410
TECAN microplate-ELISA reader Tecan
EasyWin software Tecan

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Cite This Article
Rossini, V., Radulovic, K., Riedel, C. U., Niess, J. H. Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells. J. Vis. Exp. (115), e54421, doi:10.3791/54421 (2016).

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