Utvikling av en Antigen-drevet kolitt modell for å studere presentasjon av antigener ved hjelp av antigenpresenterende celler til T-celler

Summary

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4⁺ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG^-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Abstract

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG^-/- recipients) are reconstituted with naive CD4⁺ T cells from healthy wild type hosts.

This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4⁺ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG^-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

Introduction

Tarmen er den største overflaten av kroppen som er utsatt for det ytre miljø. Enorme mengder av fastboende mikrober koloniserer tarmen til å danne tarmfloraen (eller mikroflora). Dette antas å bestå av opptil 100 billioner mikrobielle celler og utgjør en av de mest tettbefolkede bakterielle habitater er kjent innen biologi ^1-3. I GIT bakterier kolonisere en intestinal nisje hvor de overleve og formere ^4. Til gjengjeld endows microbiota verten med flere funksjonelle funksjoner som ikke er kodet på sitt genom ^en. For eksempel microbiota stimulerer spredning av epitelceller, produserer vitaminer som er vert ikke kan produsere av seg selv, regulerer stoffskiftet og beskytter mot patogener ^4-6. Gitt dette gunstige forhold, har noen forfattere foreslått at mennesker er "super-organismer" eller "holobionts" som er en blanding av bakterielle og menneskelige gener ^7,8. Gitt den fordelaktige virkningen av bakterieflora på den (menneskelige) vert, må tarmimmunsystemet til å tolerere kommensale mikroorganismer for å muliggjøre deres eksistens i lumen, men også drepe patogener som invaderer fra luminale side ^9-11. Tarmimmunsystem har utviklet mekanismer for å skille mellom ufarlige og potensielt skadelige luminal mikrober; men disse mekanismene er ennå ikke godt forstått ^12. Å opprettholde intestinal integritet krever et strengt regulert immun homeostase å holde balansen mellom toleranse og immunitet ^13. En ubalanse i immun homeostase bidrar til induksjon av intestinale sykdommer slik som inflammatorisk tarmsykdom (IBD) ^3,14.

Det er to hovedtyper av IBD: Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt (UC). Pasienter med disse sykdommene vanligvis lider av rektal blødning, alvorlig diaré og magesmerter ^15,16. Den eneste årsaken til IBD er fortsattukjent, men en kombinasjon av genetiske faktorer, miljøpåvirkninger og feilregulert immunresponser kan være nøkkelen begivenhet for sykdomsutvikling ^15.

Dyremodeller for IBD har vært brukt i over 50 år. I de siste tiårene nye IBD modellsystemer er utviklet for å teste ulike hypoteser om patogenesen av IBD ^17,18. Den best karakteriseres modell for kronisk kolitt er den T-celle-transfer modell som induserer avbrudd av T-celle-homeostase ^19,20. Denne modellen involverer overføring av naive T-celler fra immunkompetente mus inn i verter som mangler T- og B-celler (for eksempel RAG ^{– / –} og SCID-mus) ^16,21. Utviklingen av sykdommen i denne modellen blir overvåket av 3-10 uker, ved å evaluere nærværet av diaré, redusert fysisk aktivitet, og tap av kroppsvekt. Dette er såkalt avmagringssyndromet ^16. Sammenlignet med friske musene colonic vev av transplanterte verter er Thicker, kortere og tyngre ^16. Ved hjelp av T-celle-overføring modell, er det mulig å forstå hvordan ulike T-cellepopulasjoner kan bidra til patogenesen av IBD ^22. T-celleoverføring modell analyserer ikke interaksjoner mellom APC og T-celler i sykdomsprosessen i en antigen-spesifikk måte. Det har vist seg at en interaksjon mellom myeloide celler og lymfoide celler kan være ansvarlig for utviklingen av tarmbetennelse ^23. Selv om mange aspekter av IBD er klarlagt, de første hendelsene som fører til sykdomsutviklingen fortsatt trenger å bli forstått.

Det har vist seg at i fravær av bakterieflora overføring kolitt kan ikke bli etablert ^24. Nylig har flere teorier foreslår at IBD kan være et resultat av en immunrespons mot kommensale bakterier ^25. Forfatterne har også foreslått at commensal bakterier er viktig for å indusere betennelse i tarmen^26. I bakterie frie (GF) dyr tarmimmunsystem er vanligvis svekket ^27,28, men en kolonisering av disse mus med en blanding av spesifikt patogenfrie bakterier resulterer i utviklingen av fullt kompetente tarmimmunsystem ^29. Derfor synes microbiota å være et sentralt element i patogenesen av IBD, enten som en mekanisme som predisponerer for eller beskytter mot utvikling av tarmbetennelse ^30,31. Gjeldende teorier foreslår at IBD er et resultat av mikrobiell ubalanse, kalt dysbiosis, i genetisk disponerte pasienter ^32, men det er ikke klart, men hvis dysbiosis er årsaken eller konsekvensen av sykdommen ^12. Tatt i betraktning den rolle av mikroorganismer i utvikling av IBD, in vitro eksperimenter vist at CD4 ⁺ T-celler kan aktiveres ved APC pulsert med tarmbakterier ^33,34.

Videre har det blitt vist at antigener fraforskjellige commensal bakterielle arter, for eksempel E. coli, Bacteroides, Eubacterium og Proteus, er i stand til å aktivere CD4 ⁺ T-celler ^35. Dette indikerer at presentasjonen av bakterielle antigener til T-celler er viktig for utvikling av IBD. For å redusere kompleksiteten av flere antigener avledet ved mikrofloraen i sykdomsprosessen, har en E.coli-stamme er opprettet som produserer den OVA-antigenet. Overføring kolitt ble indusert ved injeksjon av OVA-spesifikke T-celler til RAG ^{– / –} dyr kolonisert med OVA-uttrykkende E. coli.

Denne modellen er basert på nyere bevis som tyder på at CX ₃ CR1 ⁺ parlamentsmedlemmer, en stor celle undergruppe i colonic lamina propria (CLP) ^36, er i samspill med CD4 ⁺ T-celler under overføring kolitt ^37. Parlamentsmedlemmer prøve tarmlumen for partikkel antigen, som bakterier, ved hjelp av sine dendritter ^{36, 38,39.} tidligere studiervist at MP'er kan også ta opp løselige antigener, slik som OVA, som innføres i intestinal lumen ^40,41. Gitt overflod av CX ₃ CR1 ⁺ parlamentsmedlemmer i CLP, er det mulig at disse cellene kan smake luminal bakterier og samhandle med CD4 T-celler. Konfokal avbildning av mus transplantert med OVA-spesifikke CD4 ⁺ T-celler kolonisert med E. coli CFP-OVA, viser at CX ₃ CR1 ⁺ MP'er er i kontakt med OT-II CD4 ⁺ T-celle under utviklingen av antigen-drevne kolitt. Denne modellen gjør det mulig å studere den antigenpresentasjon prosessen mellom tarm APCer og T-celler spesifikke bare for bestemte antigen-uttrykkende bakterier i tarmkanalen.

Protocol

Mus ble avlet og holdt under patogenfrie (SPF) forhold i dyre innretningen av Ulm University (Ulm, Tyskland). Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjene i den lokale dyre bruk og behandling komiteen og National Animal Welfare Law. 1. Bygging av pCFP-OVA Plasmid Forsterke full størrelse OVA-genet ved bruk av primerne Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') og Ova_ClaI_rev (3'GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37…

Representative Results

Å etablere en antigen-drevet kolitt modell en E. coli-stamme er konstruert som inneholder et plasmid i hvilket genet for CFP er kondensert til den kodende sekvensen for kylling ovalbumin protein og fusjons konstruksjon blir uttrykt under kontroll av den sterke konstitutive promoter P hyper (figur 1A). Fluoriserende mikroskopi viser at rekombinant E. coli pCFP-OVA, men ikke foreldre E. coli DH10B uttrykker CFP <st…

Discussion

Som med alle andre modellen, kan den antigen-drevet kolitt modellen beskrevet ovenfor presentere noen problemstillinger som etterforsker utfører teknikken må være klar over. Når injisere OT-II / Red ⁺ CD4 ⁺ T CD62L ⁺ celler i vertene, må etterforskeren være veldig forsiktig og nøye med å sette nålen inn i bukhulen. Unnlatelse av å gjøre det kan resultere i rive av tarmen av musen som kan føre til død, eller en subkutan administrering av celler som ikke vil forårsake sykdom….

Materials

LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Difco	244620
Rotary Shake	Reiss Laborbedarf e. K.	Model 3020 GFL
2 mm gap couvettes	Peqlab Biotechnologie GmbH	71-2020
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-100ML
Gene Pulser Xcell system	BioRad Laboratories GmbH	1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)	Difco	244510
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9393-5G
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation Kit	Roche	11754777001
Agarose	Carl Roth GmbH & Co	3810.1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884-100G
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	537020
Gel chamber	PEQLAB Biotechnology GmbH	40-0708
Loading Dye	Thermo Fisher	R0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder	Thermo Fisher	SM0312
Ethidium bromide solution	Carl Roth GmbH & Co. KG	2218.3
Photo-documentation system	Decon Science Tech GmbH	DeVision G
DNA sequencing	MWG-Biotech GmbH
Phosphate buffered saline (PBS)	Biochrom	L182-50
Fluorescent microscope	Zeiss	HBO 100
Mini-PROTEAN Tetra System	Bio-Rad Laboratories GmbH	1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder	Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue Solution	Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
Nitrocellulose membrane	Macherey-Nagel GmbH & Co. KG	741280
Electro blotter	Biometra GmbH	846-015-600
Bovine Serum Albumins (BSA)	Sigma-Aldrich	A6003-25G
Anti-Ovalbumin antibody	Abcam	ab181688
Anti-rabbit IgG  HRP	Sigma-Aldrich	A0545
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate	Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc	32132
Forene	Abbott	2594.00.00
FBS	Invitrogen	10500-064
Falcon Cell Strainers	Fischer Scientific	08-771-19
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	254134-5G
Tris Base	Sigma-Aldrich	10708976001
CD4+ CD62 L+ T isolation kit	Miltenyi Biotec	130-093-227
MACS LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
MidiMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Feeding Needle 20G	SouthPointe Surgical Supply, Inc	FN-7903
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Paraffin	Sigma-Aldrich	1496904
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H9627
Eosin Y	Sigma-Aldrich	230251
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D9779
Collagenase type VIII	Sigma-Aldrich	C-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium	AppliChem	A2044, 9050
Percoll (density 1.124 g/ml)	Biochrome	L-6145
Sodium azide	Sigma-Aldrich	438456
Mouse BD Fc Block	BD Pharmingen	553141
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2	BD Pharmingen	553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5	eBioscience	17-0041-83
FACS Calibur	BD Biosciences
FCS Express V3 software	DeNovo
Meta scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 710
Zeiss Workstation	Zeiss	LSM 7
Zeiss ZEM software	Zeiss	v4.2.0.121
Maxisorp immuno plates	NUNC, Roskilde	442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase	Jackson Immuno Research	016-050-084
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate	Sigma-Aldrich	71768-5G
mAb R4-6A2	BD Biosciences	551216
mAb XMG1.2	BD Biosciences	554410
TECAN microplate-ELISA reader	Tecan
EasyWin software	Tecan