In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).
Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.
الأمعاء هو أكبر سطح الجسم الذي يتعرض للبيئة الخارجية. واسعة ومتنوعة من الميكروبات المقيمين استعمار أمعاء الإنسان لتشكيل الجراثيم المعوية (أو البكتيريا). ويقدر هذا ليصل قوامها إلى 100 تريليون خلية الميكروبية ويشكل واحدا من الموائل البكتيرية الأكثر اكتظاظا بالسكان المعروف في علم الأحياء 1-3. في الجهاز الهضمي البكتيريا استعمار كوة المعوية حيث البقاء على قيد الحياة والتكاثر 4. وفي المقابل، فإن الجراثيم يمنح المضيف مع ميزات وظيفية إضافية غير المشفرة على الجينوم 1. على سبيل المثال الجراثيم يحفز تكاثر الخلايا الظهارية، وتنتج الفيتامينات التي تستضيف لا يمكن ان تنتج من تلقاء نفسها، وينظم عملية الأيض، ويحمي ضد مسببات الأمراض 4-6. ونظرا لهذا علاقة مفيدة، وقد اقترح بعض الكتاب أن البشر هم "فائقة الكائنات" أو "holobionts" التي هي مزيج من البكتيريا والإنسان جينات 7،8. وبالنظر إلى التأثير الإيجابي للالجراثيم على (الإنسان) المضيف، يحتاج نظام المناعة المعوية على تحمل الميكروبات المتعايشة لتمكين وجودها في لمعة ولكن أيضا قتل مسببات الأمراض التي تغزو من الجانب اللمعية 9-11. وقد وضعت جهاز المناعة المعوية آليات للتمييز بين الميكروبات اللمعية غير ضارة ويمكن أن تكون ضارة. لكن هذه الآليات ليست جيدا حتى الآن فهم 12. المحافظة على سلامة الأمعاء يتطلب توازن المناعة ينظم بإحكام للحفاظ على التوازن بين التسامح والحصانة 13. خلل في توازن المناعة يساهم في تحريض الأمراض المعوية مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) 3،14.
هناك نوعان رئيسيان من مرض التهاب الأمعاء: مرض كرون (CD) والتهاب القولون التقرحي (UC). المرضى الذين يعانون من هذه الأمراض عادة تعاني من نزيف المستقيم، والإسهال الشديد وآلام في البطن 15،16. لسبب واحد من IBD لا يزالغير معروف، ولكن مجموعة من العوامل الوراثية والتأثيرات البيئية والاستجابات المناعية dysregulated قد يكون الحدث الرئيسي لتطور المرض 15.
وقد استخدمت النماذج الحيوانية للمرض التهاب الأمعاء لأكثر من 50 عاما. في العقود القليلة الماضية تم تطوير أنظمة نموذج IBD جديدة لاختبار مختلف الفرضيات عن التسبب في مرض التهاب الأمعاء 17،18. نموذج أفضل وصف لالتهاب القولون المزمن هو نموذج نقل T-الخلية التي يدفع اختلال التوازن تي خلية 19،20. ويتضمن هذا النموذج نقل خلايا T ساذجة من الفئران مناعيا في مضيفين التي تفتقر إلى T والخلايا البائية (مثل الفريق الاستشاري – / – والفئران SCID) 16،21. تتم مراقبة تطور المرض في هذا النموذج ل3-10 أسابيع من خلال تقييم وجود الإسهال، وانخفاض النشاط البدني، وفقدان وزن الجسم. وهذا ما يسمى متلازمة الهزال 16. بالمقارنة مع الفئران صحي في انسجة القولون الجنود المزروعة هي thicke لص، وأقصر وأثقل 16. عن طريق نقل الخلايا نموذج T، فمن الممكن أن نفهم كيف تختلف T السكان الخلية يمكن أن تسهم في التسبب في مرض التهاب الأمعاء 22. نقل خلية نموذج T لا تحليل التفاعلات بين ناقلات الجنود المدرعة وخلايا T في عملية المرض بطريقة مستضد معين. وقد تبين أن التفاعل بين خلايا الدم النخاعي والخلايا اللمفاوية يمكن أن يكون مسؤولا عن تطوير التهاب الأمعاء 23. وعلى الرغم من توضيح جوانب عديدة من مرض التهاب الأمعاء، والأحداث الأولية التي تؤدي إلى تطور المرض لا تزال بحاجة إلى أن تفهم بوضوح.
وقد تبين أنه في حالة عدم وجود نقل الجراثيم التهاب القولون لا يمكن تأسيس 24. في الآونة الأخيرة، العديد من النظريات تشير إلى أن مرض التهاب الأمعاء يمكن أن يكون نتيجة لاستجابة مناعية ضد البكتيريا المتعايشة 25. وقد اقترح المؤلفان أيضا أن البكتيريا المتعايشة ضرورية للحث على التهاب في الأمعاء القاصي26. وفي الجرثومية مجانية (GF) الحيوانات ويضعف الجهاز المناعي المعوي عموما 27،28، ولكن الاستعمار من هذه الفئران مع خليط من خالية محددة الممرض البكتيريا النتائج في تطوير نظام المناعة في الأمعاء، كامل الأهلية 29. وبالتالي، فإن الجراثيم ويبدو أن عنصرا رئيسيا في التسبب في مرض التهاب الأمعاء، إما على شكل الآلية التي يهيئ لأو يحمي من تطور التهاب الأمعاء 30،31. وتشير النظريات الحالية التي IBD هو نتيجة لعدم التوازن الميكروبي، ودعا dysbiosis، في المرضى الذين يعانون راثيا 32، ولكن ليس من الواضح بعد ما اذا كان dysbiosis هو سبب أو نتيجة للمرض 12. النظر في دور الكائنات الدقيقة في تطوير مرض التهاب الأمعاء، في التجارب المختبرية أظهرت أن خلايا CD4 + T يمكن تفعيلها من خلال ناقلات الجنود المدرعة نابض مع البكتيريا المعوية 33،34.
وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن المستضدات منمختلفة الأنواع البكتيرية المتعايشة، مثل E. القولونية، باكتيرويديز، الجرثمة والمتقلبة، قادرة على تنشيط خلايا CD4 + T 35. هذا يدل على أن تقديم المضادات البكتيرية إلى T الخلايا من أهمية لتطوير مرض التهاب الأمعاء. للحد من تعقيد مستضدات متعددة مشتقة من النباتات الدقيقة في عملية المرض، تم إنشاء سلالة القولونية التي تنتج المستضد OVA. وكان المستحث نقل التهاب القولون عن طريق حقن خلايا T OVA محددة إلى الفريق الاستشاري – / – الحيوانات المستعمر مع، معربا عن OVA E. القولونية.
ويستند هذا النموذج على أدلة حديثة تشير إلى أن CX 3 CR1 + النواب، مجموعة فرعية الخلايا الرئيسية في الصفيحة المخصوصة القولون (CLP) 36، تتفاعل مع خلايا CD4 + T خلال نقل التهاب القولون 37. نواب عينة لمعة الأمعاء للمستضد الجسيمات، مثل البكتيريا، وذلك باستخدام التشعبات 36، 38،39. الدراسات السابقةأثبتت أن النواب ويمكن أيضا تناول المضادات القابلة للذوبان، مثل البيض، وإدخالها في الامعاء التجويف 40،41. وبالنظر إلى وفرة من CX 3 CR1 + النواب في قانون ممارسة مهنة المحاماة، فمن الممكن أن هذه الخلايا يمكن أخذ عينات البكتيريا اللمعية وتتفاعل مع خلايا CD4 T. التصوير متحد البؤر من الفئران زرعها مع خلايا CD4 + T-OVA محددة المستعمر مع E. القولونية CFP-OVA، وتبين أن CX 3 CR1 + النواب على اتصال مع خلية OT-II CD4 + T خلال تطوير التهاب القولون يحركها المستضد. يتيح هذا النموذج دراسة عملية تقديم المستضد بين ناقلات الجنود المدرعة المعوية وخلايا T معينة فقط لبعينها البكتيريا، معربا عن مستضد في لمعة الأمعاء.
كما هو الحال مع كل نموذج آخر، نموذج التهاب القولون يحركها مستضد المذكورة أعلاه قد تقدم عدد قليل من القضايا التي المحقق أداء هذه التقنية يجب أن تكون على علم. عندما حقن OT-II / أحمر + CD4 + T + CD62L الخلايا في الدولة المضيفة، يجب أن يكون محقق لطيف جدا ودقيق لادخ?…
The authors have nothing to disclose.
JHN is supported by the Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-19 | |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
Percoll (density 1.124 g/ml) | Biochrome | L-6145 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
FACS Calibur | BD Biosciences | ||
FCS Express V3 software | DeNovo | ||
Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
EasyWin software | Tecan |