Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

تطوير التهاب القولون نموذج مدفوعة مستضد لدراسة عرض المستضدات التي كتبها مستضد الخلايا إلى خلايا T

doi: 10.3791/54421 Published: September 18, 2016

Introduction

الأمعاء هو أكبر سطح الجسم الذي يتعرض للبيئة الخارجية. واسعة ومتنوعة من الميكروبات المقيمين استعمار أمعاء الإنسان لتشكيل الجراثيم المعوية (أو البكتيريا). ويقدر هذا ليصل قوامها إلى 100 ​​تريليون خلية الميكروبية ويشكل واحدا من الموائل البكتيرية الأكثر اكتظاظا بالسكان المعروف في علم الأحياء 1-3. في الجهاز الهضمي البكتيريا استعمار كوة المعوية حيث البقاء على قيد الحياة والتكاثر 4. وفي المقابل، فإن الجراثيم يمنح المضيف مع ميزات وظيفية إضافية غير المشفرة على الجينوم 1. على سبيل المثال الجراثيم يحفز تكاثر الخلايا الظهارية، وتنتج الفيتامينات التي تستضيف لا يمكن ان تنتج من تلقاء نفسها، وينظم عملية الأيض، ويحمي ضد مسببات الأمراض 4-6. ونظرا لهذا علاقة مفيدة، وقد اقترح بعض الكتاب أن البشر هم "فائقة الكائنات" أو "holobionts" التي هي مزيج من البكتيريا والإنسان جينات 7،8. وبالنظر إلى التأثير الإيجابي للالجراثيم على (الإنسان) المضيف، يحتاج نظام المناعة المعوية على تحمل الميكروبات المتعايشة لتمكين وجودها في لمعة ولكن أيضا قتل مسببات الأمراض التي تغزو من الجانب اللمعية 9-11. وقد وضعت جهاز المناعة المعوية آليات للتمييز بين الميكروبات اللمعية غير ضارة ويمكن أن تكون ضارة. لكن هذه الآليات ليست جيدا حتى الآن فهم 12. المحافظة على سلامة الأمعاء يتطلب توازن المناعة ينظم بإحكام للحفاظ على التوازن بين التسامح والحصانة 13. خلل في توازن المناعة يساهم في تحريض الأمراض المعوية مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) 3،14.

هناك نوعان رئيسيان من مرض التهاب الأمعاء: مرض كرون (CD) والتهاب القولون التقرحي (UC). المرضى الذين يعانون من هذه الأمراض عادة تعاني من نزيف المستقيم، والإسهال الشديد وآلام في البطن 15،16. لسبب واحد من IBD لا يزالغير معروف، ولكن مجموعة من العوامل الوراثية والتأثيرات البيئية والاستجابات المناعية dysregulated قد يكون الحدث الرئيسي لتطور المرض 15.

وقد استخدمت النماذج الحيوانية للمرض التهاب الأمعاء لأكثر من 50 عاما. في العقود القليلة الماضية تم تطوير أنظمة نموذج IBD جديدة لاختبار مختلف الفرضيات عن التسبب في مرض التهاب الأمعاء 17،18. نموذج أفضل وصف لالتهاب القولون المزمن هو نموذج نقل T-الخلية التي يدفع اختلال التوازن تي خلية 19،20. ويتضمن هذا النموذج نقل خلايا T ساذجة من الفئران مناعيا في مضيفين التي تفتقر إلى T والخلايا البائية (مثل الفريق الاستشاري - / - والفئران SCID) 16،21. تتم مراقبة تطور المرض في هذا النموذج ل3-10 أسابيع من خلال تقييم وجود الإسهال، وانخفاض النشاط البدني، وفقدان وزن الجسم. وهذا ما يسمى متلازمة الهزال 16. بالمقارنة مع الفئران صحي في انسجة القولون الجنود المزروعة هي thicke لص، وأقصر وأثقل 16. عن طريق نقل الخلايا نموذج T، فمن الممكن أن نفهم كيف تختلف T السكان الخلية يمكن أن تسهم في التسبب في مرض التهاب الأمعاء 22. نقل خلية نموذج T لا تحليل التفاعلات بين ناقلات الجنود المدرعة وخلايا T في عملية المرض بطريقة مستضد معين. وقد تبين أن التفاعل بين خلايا الدم النخاعي والخلايا اللمفاوية يمكن أن يكون مسؤولا عن تطوير التهاب الأمعاء 23. وعلى الرغم من توضيح جوانب عديدة من مرض التهاب الأمعاء، والأحداث الأولية التي تؤدي إلى تطور المرض لا تزال بحاجة إلى أن تفهم بوضوح.

وقد تبين أنه في حالة عدم وجود نقل الجراثيم التهاب القولون لا يمكن تأسيس 24. في الآونة الأخيرة، العديد من النظريات تشير إلى أن مرض التهاب الأمعاء يمكن أن يكون نتيجة لاستجابة مناعية ضد البكتيريا المتعايشة 25. وقد اقترح المؤلفان أيضا أن البكتيريا المتعايشة ضرورية للحث على التهاب في الأمعاء القاصي26. وفي الجرثومية مجانية (GF) الحيوانات ويضعف الجهاز المناعي المعوي عموما 27،28، ولكن الاستعمار من هذه الفئران مع خليط من خالية محددة الممرض البكتيريا النتائج في تطوير نظام المناعة في الأمعاء، كامل الأهلية 29. وبالتالي، فإن الجراثيم ويبدو أن عنصرا رئيسيا في التسبب في مرض التهاب الأمعاء، إما على شكل الآلية التي يهيئ لأو يحمي من تطور التهاب الأمعاء 30،31. وتشير النظريات الحالية التي IBD هو نتيجة لعدم التوازن الميكروبي، ودعا dysbiosis، في المرضى الذين يعانون راثيا 32، ولكن ليس من الواضح بعد ما اذا كان dysbiosis هو سبب أو نتيجة للمرض 12. النظر في دور الكائنات الدقيقة في تطوير مرض التهاب الأمعاء، في التجارب المختبرية أظهرت أن خلايا CD4 + T يمكن تفعيلها من خلال ناقلات الجنود المدرعة نابض مع البكتيريا المعوية 33،34.

وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن المستضدات منمختلفة الأنواع البكتيرية المتعايشة، مثل E. القولونية، باكتيرويديز، الجرثمة والمتقلبة، قادرة على تنشيط خلايا CD4 + T 35. هذا يدل على أن تقديم المضادات البكتيرية إلى T الخلايا من أهمية لتطوير مرض التهاب الأمعاء. للحد من تعقيد مستضدات متعددة مشتقة من النباتات الدقيقة في عملية المرض، تم إنشاء سلالة القولونية التي تنتج المستضد OVA. وكان المستحث نقل التهاب القولون عن طريق حقن خلايا T OVA محددة إلى الفريق الاستشاري - / - الحيوانات المستعمر مع، معربا عن OVA E. القولونية.

ويستند هذا النموذج على أدلة حديثة تشير إلى أن CX 3 CR1 + النواب، مجموعة فرعية الخلايا الرئيسية في الصفيحة المخصوصة القولون (CLP) 36، تتفاعل مع خلايا CD4 + T خلال نقل التهاب القولون 37. نواب عينة لمعة الأمعاء للمستضد الجسيمات، مثل البكتيريا، وذلك باستخدام التشعبات 36، 38،39. الدراسات السابقةأثبتت أن النواب ويمكن أيضا تناول المضادات القابلة للذوبان، مثل البيض، وإدخالها في الامعاء التجويف 40،41. وبالنظر إلى وفرة من CX 3 CR1 + النواب في قانون ممارسة مهنة المحاماة، فمن الممكن أن هذه الخلايا يمكن أخذ عينات البكتيريا اللمعية وتتفاعل مع خلايا CD4 T. التصوير متحد البؤر من الفئران زرعها مع خلايا CD4 + T-OVA محددة المستعمر مع E. القولونية CFP-OVA، وتبين أن CX 3 CR1 + النواب على اتصال مع خلية OT-II CD4 + T خلال تطوير التهاب القولون يحركها المستضد. يتيح هذا النموذج دراسة عملية تقديم المستضد بين ناقلات الجنود المدرعة المعوية وخلايا T معينة فقط لبعينها البكتيريا، معربا عن مستضد في لمعة الأمعاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

كانت ولدت الفئران وأبقى تحت (SPF) شروط معينة خالية من مسببات الأمراض في منشأة الحيوان من جامعة أولم (أولم، ألمانيا). وقد أجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا للمبادئ التوجيهية للاستخدام الحيواني المحلي ولجنة الرعاية وقانون رعاية الحيوان الوطنية.

1. بناء على pCFP-OVA البلازميد

  1. تضخيم الكامل الجينات حجم البويضات باستخدام بادئات Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') وOva_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 استخدام البلازميد PCI-OVA (الأمبيسلين مقاومة) 42 كقالب. استنساخ منتج PCR (أي تسلسل الترميز OVA) إلى فج منتصف ناقلات المتاحة تجاريا باستخدام SpeI وCLAI القيود مواقع الاشعال وناقلات لتحقق محدد OVA-البلازميد.
  2. تضخيم الجين CFP الترميز جنبا إلى جنب مع المروج التأسيسية قوي ف فرط استخدام البلازميد الوسادة 1 43 كقالب والاشعال CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') وCFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. استنساخ الجين CFP الترميز في OVA-البلازميد محددة (مقاومة الأمبيسلين) باستخدام تقييد مواقع SpeI وساسي من الاشعال وناقلات 37. هذا يقدم فاصل من 6 بقايا الجلايسين بين CFP الترميز من OVA الترميز تسلسل.

2. بناء القولونية pCFP-OVA

  1. تنمو القولونية سلالة DH10B في 100 مل من لوريا Bertani (LB) المتوسطة هوائيا عند 37 درجة مئوية على شاكر دوارة بين عشية وضحاها.
  2. مزيج 800 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية مع 200 ميكرولتر من الجلسرين لخلق الأسهم الجلسرين ومخزن في -80 درجة مئوية.
  3. إضافة 50 ميكرولتر من القولونية سلالة DH10B من المخزون الجلسرين في 5 مل من LB المتوسطة وزراعتها هوائيا عند 37 درجة مئوية على الامد شاكر دوارةrnight.
  4. نقل الثقافة في حيرة قارورة 1 لتر مخروطي مع 250 مل من LB المتوسطة عند 37 درجة مئوية في هزة الدوار.
  5. تنمو البكتيريا إلى الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) 0.5 ثم هدئ الثقافة على الجليد لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي البكتيريا في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  6. بكتيريا و resuspend مع 100 مل من الجليد الباردة العقيمة H 2 O وأجهزة الطرد المركزي البكتيريا في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 البكتيريا درجة مئوية و resuspend مع 100 مل من الجليد الباردة 10٪ الجلسرين وأجهزة الطرد المركزي البكتيريا في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة الأخيرة مرتين.
  7. بعد الخطوة غسل النهائي، و resuspend البكتيريا في 700 ميكرولتر من 10٪ الجلسرين. تجميد 50 مكل في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.
  8. ذوبان الجليد قسامة 50 ميكرولتر على الجليد ونقل إلى كوفيت Electroporation للما قبل المبردة (2 مم الكهربائي عن بعد).
  9. إضافة 5 ميكرولتر من البلازميد (100 نانوغرام) إلى 50 ميكرولتر E. القولونية أليكوالخبر. أداء Electroporation للمع نبضة واحدة في 25 μF، 200 أوم (Ω) و 2.5 كيلو فولت.
  10. البكتيريا resuspend في 1 مل قبل تحسنت SOC المتوسط ​​(5 جرام / لتر خلاصة الخميرة، 2 غرام / لتر تريبتون، 10 ملي كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي كلوريد البوتاسيوم، 10 ملي كلوريد المغنيسيوم، و 10 ملي كبريتات المغنيسيوم) واحتضان عند 37 درجة مئوية هوائيا لمدة 1 ساعة.
  11. البكتيريا لوحة على لوحات LB-أجار تستكمل مع الأمبيسلين 100 ميكروغرام / مل (إضافة 100 ميكرولتر من 100 ملغ / مل الأسهم الأمبيسلين إلى 100 مل من LB أجار)، واحتضان بين عشية وضحاها هوائيا عند 37 درجة مئوية.
  12. اختيار المستعمرات واحد وإعادة متتالية، منها في لوحات LB-أجار تستكمل مع الأمبيسلين 100 ميكروغرام / مل. احتضان بين عشية وضحاها هوائيا عند 37 درجة مئوية.
  13. اختيار المستعمرات واحد وتنمو عليها بين عشية وضحاها في 10 مل من وسائل الاعلام LB تستكمل مع الأمبيسلين 100 ميكروغرام / مل لعزل البلازميد. استخدام المتاحة تجاريا البلازميد صغيرة عدة الإعدادية وأزل DNA البلازميد مع 30 درهم ميكرولتر 2 O (الماء المقطر) وفقا لالصانع؛ ق البروتوكول. تحقق من البلازميدات عن طريق تحليل تقييد و37،42،43 تسلسل الحمض النووي.
  14. إنشاء ثقافة من الحيوانات المستنسخة إيجابية من E. القولونية pCFP-OVA في 100 مل من LB المتوسطة تستكمل مع الأمبيسلين 100 ميكروغرام / مل. تنمو هوائيا عند 37 درجة مئوية على ليلة وضحاها شاكر دوارة.
  15. مزيج 800 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية مع 200 ميكرولتر من الجلسرين النقي ومخزن في -80 درجة مئوية.
  16. أجهزة الطرد المركزي لبقية الثقافة بين عشية وضحاها في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) و resuspend بيليه في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ضع 10 ميكرولتر من تعليق على شريحة زجاجية، وتغطي مع ساترة.
  17. مراقبة العينات في المجهر مضان القياسية لتأكيد مضان تعبير عن CFP-OVA (CFP الإثارة في 450 نانومتر، والانبعاثات في 480 نانومتر). تحليل البكتيريا تبدأ مع التكبير 400X.
  18. الطرد المركزي 1 مل من البكتيريا من الثقافات بين عشية وضحاها في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة، RT. Resuspend وبيليه في 40 ميكرولتر منبرنامج تلفزيوني ويغلي عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  19. الطرد المركزي العينات في 30000 x ج لمدة 10 دقيقة واستخدام supernatants للتحليل لطخة غربية 37. استخدام مكافحة OVA بولكلونل الأجسام المضادة التي أثيرت أرنب المخفف 1: 400.

3. الجيل من OT-II / الفئران الأحمر

  1. عبور ذكر / أنثى الفأر OT-II مع الإناث / الذكور الماوس التعبير عن بروتين أحمر فلوري (على حد سواء سلالات متوفر تجاريا) من أجل توليد الفئران OT-II / الأحمر 37.

4. الطحال عزل الخلايا

  1. الموت ببطء OT-II / الفئران الأحمر خلع عنق الرحم بعد التخدير عن طريق الاستنشاق من أي الأثير المهلجنة (تصل إلى 5٪ لتحريض) متاحة تجاريا.
  2. استخدام مقص لقطع جزء من البطن متفوقة الأيسر للفأرة. تحت هذا الجزء البطني هناك الطحال (بيضاوية الشكل مع اللون الداكن والأحمر). استخدام المقص والملقط لحذفها.
    1. استخراج الطحال من OT-II / الفئران الحمراء وتمريرها من خلال 100ميكرومتر مصفاة الخلية موضوعة على أنبوب 50 مل باستخدام المكبس من حقنة 1 مل من أجل الحصول على تعليق وحيد الخلية. غسل مصفاة مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS).
  3. الطرد المركزي تعليق خلية في 390 x ج لمدة 5 دقائق على RT. Resuspend وبيليه مع 5 مل من العازلة قبل تحسنت تحلل (144 ملي NH 4 CL، 17 ملي تريس، ودرجة الحموضة = 7.2) إلى ليز خلايا الدم الحمراء. احتضان 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. غسل العينة مع 25 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ FBS. أجهزة الطرد المركزي في 390 x ج لمدة 5 دقائق على RT. Resuspend وبيليه في 10 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ FBS.
  5. عد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ حل التريبان الأزرق. احتضان لمدة 1-2 دقيقة.
    1. تملأ الغرفة عدادة الكريات مع 10 ميكرولتر من الخلايا الملون. عدد الخلايا تحت المجهر في أربعة 1 × 1 مم 2 الساحات من غرفة واحدة وdeterminالبريد متوسط ​​عدد الخلايا لكل متر مربع. تظهر خلايا قابلة للحياة البيضاء والخلايا الميتة تظهر زرقاء. لتحديد عدد الخلايا / مل مضاعفة عدد الخلايا التي كتبها عامل التخفيف. إذا كان يتم عد 2-4 الأرباع، القسمة على عدد من الأرباع.

5. CD4 + CD62 L + T إثراء خلية

  1. نمي خلايا الطحال للخلايا CD4 + CD62L + T عن طريق عدة العزلة المغناطيسية باستخدام مبادئ اختيار سلبية أو إيجابية. هنا، استخدم اختيار السلبية لعزل خلايا CD4 + T واستخدام انتقاء إيجابي لإثراء لCD62L + السكان داخل تجمع خلايا CD4 + T.
    ملاحظة: في إجراءات الاختيار السلبي، والخلايا، والتي سيتم يست معزولة: وصفت مع الأجسام المضادة المحددة إلى جانب ميكروبيدات المغناطيسية (هنا كل خلايا CD4 السلبية). خلال الخطوات غسل العمود خلايا CD4 + T سوف تمر من خلال العمود بحيث أنها يمكن أن تكون EASIجمعت لاي. في الخلايا إجراءات الاختيار الإيجابية أن تكون معزولة وصفت مع الأجسام المضادة المناسبة إلى جانب ميكروبيدات المغناطيسية. خلال الخطوات غسل العمود الخلايا المسمى ستبقى في العمود ويمكن جمعها عن طريق إزالة عمود من الحقل المغناطيسي للأرض والشطف مع المخزن المؤقت.
  2. لإجراءات الاختيار السلبي، و resuspend 10 7 مجموع خلايا الطحال في 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع الزلال 0.5٪ المصل البقري (BSA). إضافة 10 ميكرولتر من البيوتين المسمى الأجسام المضادة كوكتيل المرفق مع عدة العزلة المغناطيسية (أجسام مضادة محددة ملزمة الخلايا غير CD4 + T-)، واحتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.
    1. إضافة 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSA و 20 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة البيوتين. احتضان 20 دقيقة على الجليد.
    2. إضافة إلى عينة 10 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.5٪ BSA والطرد المركزي في 390 x ج لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين. Resuspend الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSا.
    3. ضع عمود محدد لإجراءات الاختيار السلبي في الحقل المغناطيسي للأرض وشطف مع 3 مل من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSA على العمود. إضافة تعليق الخلية على العمود ويغسل 3 مرات مع 3 مل من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSA.
    4. خلايا الطرد المركزي من النفايات السائلة في 390 x ج لمدة 5 دقائق. مرور النفايات السائلة من خلال العمود يحتوي على خلايا CD4 + T غير المسماة. resuspend الكرية في 1 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع٪ BSA 0.5 و عدد الخلايا.
    5. عد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ حل التريبان الأزرق. احتضان لمدة 1-2 دقيقة.
      1. تملأ الغرفة عدادة الكريات مع 10 ميكرولتر من الخلايا الملون. عدد الخلايا تحت المجهر في أربعة 1 × 1 مم 2 الساحات من غرفة واحدة وتحديد متوسط ​​عدد الخلايا لكل متر مربع. تظهر خلايا قابلة للحياة البيضاء والخلايا الميتة تظهر زرقاء. لتحديد عدد الخلايا / مل تتكاثر سلعدد لتر من عامل التخفيف. إذا كان يتم عد 2-4 الأرباع، القسمة على عدد من الأرباع.
  3. لإجراءات الاختيار الإيجابي، إضافة 10 ميكرولتر من ميكروبيدات CD62L في 10 7 التخصيب قبل خلية جزء CD4 + T. احتضان 15 دقيقة على الجليد.
    1. إضافة إلى عينة 10 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.5٪ BSA والطرد المركزي في 390 x ج لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين. resuspend في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSA.
    2. ضع عمود محدد لإجراءات الاختيار السلبي في الحقل المغناطيسي للأرض وشطف مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSA على العمود. إضافة تعليق الخلية على العمود ويغسل 3 مرات مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة تستكمل مع 0.5٪ BSA.
    3. إزالة عمود من الحقل المغناطيسي للأرض ووضعه على أنبوب جمع مناسبة. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.5٪ BSA على العمود وطرد خلايا CD4 + T + CD62Lق الاحتفاظ بها في العمود عن طريق دفع بقوة المكبس في العمود.
      ملاحظة: خلايا CD4 + T CD62L + معزولة هي الآن جاهزة لتطبيقات المصب، مثل التجارب في الجسم الحي. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة من CD4 + CD62L + T عدة زنازين العزل، وميكروبيدات ليست سامة. نظرا لحجم صغير (حوالي 50 نانومتر)، فإنها لم تقم بتنشيط الخلايا وأنها لن تشبع الحواتم سطح الخلية. وبالتالي فإن الخلايا المعزولة يمكن نقلها في الفئران العوز المناعي للحث على التهاب القولون 37،44،45.
    4. عد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ حل التريبان الأزرق. احتضان لمدة 1-2 دقيقة.
      1. تملأ الغرفة عدادة الكريات مع 10 ميكرولتر من الخلايا الملون. عدد الخلايا تحت المجهر في أربعة 1 × 1 مم 2 الساحات من غرفة واحدة وتحديد متوسط ​​عدد الخلايا لكل متر مربع. خلايا قابلة للحياة appeaص البيضاء والخلايا الميتة تظهر زرقاء. لتحديد عدد الخلايا / مل مضاعفة عدد الخلايا التي كتبها عامل التخفيف. إذا 2 - يتم عدها 4 الأرباع، القسمة على عدد من الأرباع.

6. تحريض التهاب القولون مدفوعة مستضد

  1. حقن داخل الصفاق 3 × 10 5 خلايا OT-II / الأحمر CD4 + CD62L + T إلى CX 3 CR1 GFP / س + الفريق الاستشاري - / - الفئران. لتحريض التهاب القولون مستضد معين، إدارة E. القولونية pCFP-OVA كل يوم الثاني بجرعة 1 × 10 8 حدة تشكيل مستعمرة (كفو) في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني للحيوان بواسطة التغذية الأنبوبية أو تقطير عن طريق الفم وراء القواطع.
  2. مراقبة مرتين أسبوعيا وزن الجسم للفئران زرع وحالة سريرية على (وجود الدم في البراز، وقوام البراز ونشاط الفئران).

7. عينات الأنسجة للفحص النسيجية

  1. أخذ عينات من أنسجة عشرالبريد الأمعاء الغليظة من الفئران، وإصلاح في الفورمالين محايدة مخزنة (10٪) وتضمين في البارافين كما هو موضح سابقا 36،46.
  2. القسم عينات البارافين على مشراح، جبل على الشرائح، وأداء H & E صمة عار 47،48.
  3. تصنيف الأنسجة من الأمعاء الغليظة كما نشرت سابقا 47،48: عادي (يسجل 0)؛ التهاب القولون معتدل (درجة 1)، والتهاب القولون المعتدل (النتيجة 2) والتهاب القولون الحاد (تسجيل 3).

8. عزل خلايا القولون الصفيحة المخصوصة

  1. الموت ببطء الفئران زرعها من قبل خلع عنق الرحم بعد التخدير عن طريق الاستنشاق من أي الأثير المهلجنة (تصل إلى 5٪ لتحريض) متوفرة تجاريا.
  2. وضع الحيوان إلى أسفل مع بطن مواجهة. استخدام ملقط لانتزاع الجلد الأمامية لفتح مجرى البول. استخدام المقص لقطع الجلد على طول خط الوسط بطني من الفخذ في الصدر. سحب الجلد مرة أخرى على الجانبين.
  3. قطع طريق الجدار العضلي البريتوني شفافة ويفتح تجويف الجسم. تحديد القولون الذي يمتد من فتحة الشرج إلى العوراء 49. قطع الأطراف (2) وتحرير الأنسجة من أي دهون.
  4. فتح القولون طوليا باستخدام مقص تشريح. استخدام ملاقط لزعزعة النسيج القولون في طبق بتري تحتوي على 25 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ FBS لإزالة الأنقاض والأغشية المخاطية. قطع القولون إلى 5-8 قطع ملم.
  5. وضع شرائح القولون في أنبوب 50 مل تحتوي على 20 مل من غسل العازلة. المخزن المؤقت غسل يحتوي على 500 مل DPBS، 10MM HEPES و5MM ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA).
  6. دوامة أنبوب لمدة 30 ثانية بسرعة قصوى.
  7. احتضان الأنبوب مع شرائح القولون في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة تهتز لمدة 10 دقيقة.
  8. بعد الحضانة، ودوامة أنبوب لمدة 30 ثانية بسرعة قصوى.
  9. تجاهل supernatants ووضع عينات الأنسجة في أنبوب 50 مل جديدة تحتوي على 20 مل من غسل العازلة. كرر الخطوات من 6-9 ثلاث مرات
  10. تجاهل الصورةupernatants ووضع عينات الأنسجة في طبق بتري تحتوي على 25 مل من برنامج تلفزيوني. استخدام ملاقط ليهز بلطف عينات الأنسجة في طبق بتري لبضع ثوان لإزالة الخلايا الظهارية المتبقية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
  11. قطع أنسجة القولون إلى 2 × 2 مم 2 قطعة وهضمها من قبل حضانة في 10 مل من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) المتوسطة مع 0.5 ملغ / مل نوع كولاجيناز الثامن من كلوستريديوم للنسج و10 U / مل من DNaseI.
  12. دوامة أنبوب لمدة 30 ثانية بسرعة قصوى.
  13. احتضان شظايا القولون في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة تهتز لمدة 35 دقيقة ودوامة أنبوب لمدة 30 ثانية بسرعة قصوى كل 5 دقائق.
  14. في نهاية الحضانة دوامة أنبوب لمدة 30 ثانية على سرعة القصوى.
  15. جمع شظايا هضمها من قبل تمريرها من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر المتمركزة على أنبوب 50 مل الجديد.
  16. غسل العينة وذلك بإضافة 20 مل من DPBS وأجهزة الطرد المركزي في 400 غ لمدة 5 دقائق. resuspend ثم رانه الخلايا في 1 مل من DPBS.
  17. عد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ حل التريبان الأزرق. احتضان لمدة 1-2 دقيقة.
    1. تملأ الغرفة عدادة الكريات مع 10 ميكرولتر من الخلايا الملون. عدد الخلايا تحت المجهر في أربعة 1 × 1 مم 2 الساحات من غرفة واحدة وتحديد متوسط ​​عدد الخلايا لكل متر مربع. تظهر خلايا قابلة للحياة البيضاء والخلايا الميتة تظهر زرقاء. لتحديد عدد الخلايا / مل مضاعفة عدد الخلايا التي كتبها عامل التخفيف. إذا كان يتم عد 2-4 الأرباع، القسمة على عدد من الأرباع.

9. تلطيخ خارج الخلية لتحليل FCM

  1. أجهزة الطرد المركزي في CLP خلايا 5 دقائق في 390 ز س. Resuspend الخلايا في 1 مل من FACS ألف (PBS تستكمل مع 1٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم)
    ملاحظة: أزيد الصوديوم عالية السمية. ويمكن أن يسبب انخفاض ضغط الدم، انخفاض حرارة الجسم، والتشنجات والصداع أو الموت. تمييع حلول أزيد الصوديوم (00،1-1،0٪) عادة لا تقدم مخاطر غير عادية للمستخدم، لكنها العين والجلد المهيجة. ولذلك، استخدم أزيد الصوديوم فقط في غطاء محرك السيارة الكيميائية في حين يرتدي معطف المختبر وزوج المزدوج للقفازات النتريل المتاح.
  2. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في RT مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) 2.4G2 موجهة ضد FcγRIII / II CD16 / CD32 (0.5-1 ميكروغرام ماب / 10 6 خلايا) المخفف في نظام مراقبة الأصول الميدانية أ.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من FACS ألف لخلايا وأجهزة الطرد المركزي 5 دقائق في 390 ز س. كرر هذه الخطوة مرتين. احتضان الخلايا مع 0.5 نانوغرام / 10 6 خلايا ماب ذات الصلة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. تمييع الأجسام المضادة في نظام مراقبة الأصول الميدانية أ.
  4. إضافة 200 ميكرولتر من FACS ألف لخلايا وأجهزة الطرد المركزي 5 دقائق في 390 ز س. كرر هذه الخطوة مرتين. Resuspend والعينات في 100 ميكرولتر من FACS أ.
  5. تحليل خلايا T من CX 3 CR1 GFP / س + الفريق الاستشاري - / - الفئران تشكيلها مع OT-II / خلايا CD4 T الأحمر في قياس التدفق الخلوي 37.

تحليل 10. متحد البؤر المجهري

  1. تحليل القولون من CX 3 CR1 GFP / + الفئران تشكيلها أم لا مع OT-II / خلية الأحمر CD4 + CD62L + T وتغذية عن طريق الفم كل يوم الثاني على التوالي مع 1 × 10 8 كفو من E. كولاي سلالة DH10B pCFP-OVA.
  2. إزالة القولون من الفئران باستخدام مقص وملاقط. فتحه طوليا باستخدام مقص تشريح.
  3. قطع قطعة 5-8 ملم من عينة القولون باستخدام مقص، وضعت على الشرائح الزجاجية، وتغطي مع coverslips.
  4. تحليل العينات القولون مع المجهر متحد البؤر في التكبير من 40 / 1.30.
  5. كشف CX 3 CR1 + النواب، وصفت مع الأخضر البروتين فلوريسئين (GFP)، وذلك باستخدام فلتر مع مجموعة الإثارة في 488 نانومتر، والانبعاثات في 509 نانومتر.
  6. الكشف عن خلية CD4 + T التعبير عن بروتين أحمر باستخدام فلتر مع مجموعة الإثارة في 554 نانومتر، والانبعاثات في 586 نانومتر.
  7. كشف القولونية pCFP-OVA باستخدام فلتر مع مجموعة الإثارة في 450 نانومتر، والانبعاثات في 480 نانومتر.
  8. تحديد مساحة من الاهتمام وتوليد الرسوم البيانية مبعثر كما هو موضح سابقا 50 لإجراء التحليل شارك في التعريب. 2 استخدام صيغ مختلفة: معامل التداخل وفقا لManders ومعامل بيرسون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إنشاء نموذج التهاب القولون يحركها مستضد وE. سلالة القولونية تم بناؤها الذي يحتوي البلازميد التي يتم تنصهر جين لCFP إلى تسلسل الترميز للبروتين ألبومين البيض والدجاج وبناء الانصهار وأعرب تحت سيطرة القوي المروج التأسيسية ف فرط (الشكل 1A). يظهر الفحص المجهري الفلورسنت أن E. المؤتلف القولونية pCFP-OVA، ولكن ليس E. الوالدين القولونية DH10B، عن CFP (الشكل 1B). الحراجية المعتمدة OVA- إنتاج E. القولونية غير قادرة على تنشيط خلايا OT-II في المختبر، ولحث على إنتاج الإنترفيرون γ في المقابل إلى E. كولاي سلالة التعبير CFP فقط (الشكل 2). الشكل 3A يظهر خارج الحي 3D متحد البؤر التصوير من انسجة القولون من CX 3 CR1 GFP / + الفئران التي تغذت على E. القولونية pCFP-OVA. E. القولونية pCFP-OVA يمكنيتم الكشف عن داخل أقبية القولون تقع على مقربة من المعوية الخلايا الظهارية وشارك في يموضع مع CX 3 CR1 + البالعات. لتحديد الحصة النسبية من E. القولونية pCFP-OVA داخليا من قبل CX تعريف 3 CR1 + البالعات، وتم تحديد كثافة الإزهار الأزرق والأخضر من البقع التشرذم. وكشف التحليل أن الخلايا CX 3 CR1 + أخذ عينات 11.9 ± 1.5٪ من E. القولونية pCFP-OVA الكشف في القولون (الشكل 3B). وفي OT-II / الحيوانات الأحمر، وتتميز خلايا CD4 + T من التعبير الأحمر وVβ 5.1 التعبير يتضح من التدفق الخلوي (الشكل 4). ويبين الشكل 5A لمحة عامة عن مستضد مدفوعة نموذج التهاب القولون. تم نقل OT-II / أحمر + CD4 + T + CD62L خلايا adoptively إلى CX 3 CR1 GFP / س + الفريق الاستشاري - / - المتلقين التي تم ثم gavaged كل يوم الثاني على التوالي مع E.القولونية pCFP-OVA. عندما تحدى مع E. القولونية pCFP-OVA، نقل CX 3 CR1 GFP / + س الاستشاري - / - الفئران تفقد وزن الجسم ووضع العلامات السريرية لالتهاب القولون (الشكل 5B) يبين الشكل 6 المجراة سابقا 3D التصوير متحد البؤر من أنسجة القولون 7 و 14 و 21 يوما بعد. إعادة تشكيل CX متخالف 3 CR1 GFP / س + الفريق الاستشاري - / - المتلقين مع OT-II / أحمر + خلايا تحدى مع E. القولونية pCFP-OVA. بعد سبعة أيام نقل الخلية قد أخذت منها عينات سوى عدد قليل من CX 3 CR1 + البالعات E. القولونية pCFP-OVA وOT-II / لم تكتشف الخلايا الحمراء +. أربعة عشر يوما بعد نقل الخلايا، CX 3 CR1 + البالعات التي اخذت عينات E. وتقع القولونية pCFP-OVA قريبة من OT-II / أحمر + الخلايا. بعد واحد وعشرين يوما خلية نقل عدد كبير من CX 3 CR1 + الخلايا التي أخذت عينات E. القولونية pCFP-OVA وOT-II / Rإد + الخلايا، مشتتين في أنحاء CLP على مقربة من CX 3 CR1 + البالعات.

شكل 1
الشكل 1: CFP-OVA إنتاج E. القولونية. (A) خريطة pCFP-OVA مع تقييد مواقع ذات الصلة، والجينات ترميز OVA وزرقاء لامعة البروتين الفلوري CFP. (ب) حقل مشرق والصور المجهرية الفلورسنت من النوع البري E. القولونية DH10B، E. القولونية DH10B pCFP و E. القولونية DH10B pCFP-OVA. مقياس شريط: 10 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: OTخلايا-II حفز مع CFP-OVA إنتاج الإنترفيرون γ بعد بمعزل عن الطحال، وحفز خلايا OT-II مع الأرقام المشار إليها من E. القولونية DH10B pCFP-OVA. تم إبطال مفعولها الخلايا البكتيرية بعد حضانة 2 ساعة مع 5 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. بعد 72 ساعة من الثقافة، تم جمع supernatants وتركيزات IFN-γ يحدده إليسا. أجريت تجارب في يثلث والبيانات المقدمة كما يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): CX 3 CR1 + البالعات عينة E. القولونية pCFP-OVA. (A) الأنسجة CLP من CX 3 CR1GFP / + الفئران gavaged مع 1 × 10 8 E. القولونية pCFP-OVA لمدة 7 أيام وتحليلها بواسطة خارج الحي المجهري متحد البؤر. التكبير 40X / 1.30. شريط النطاق = 30 ميكرون. (ب) نسبة E. المنضوية القولونية pCFP-OVA quantitated وقدمت البيانات كما يعني ± SEM. في مان ويتني اختبار ص <اعتبر 0.05 ذات دلالة إحصائية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: توصيف OT-II / أحمر + CD4 + T خلايا (A) OT-II الحيوانات المعدلة وراثيا وعبرت مع الحيوانات التعبير عن بروتين أحمر فلوري للحصول OT-II / أحمر +الخلايا. OT-II / تم عزل خلايا الأحمر + من الطحال من OT-II / الأحمر الحيوانات المعدلة وراثيا، الملون لCD4 وVß5.1 وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: نقل مدفوعة OVA-التهاب القولون (أ) تمثيل تخطيطي للمستضد مدفوعة نموذج التهاب القولون. تم نقل OT-II / أحمر + CD4 + T + CD62L خلايا adoptively إلى CX 3 CR1 GFP / س + الفريق الاستشاري - / - تم gavaged الفئران وتستضيف كل يوم الثاني على التوالي مع E. القولونية pCFP-OVA. وقد تم قياس الوزن (ب) الجسم من المجموعات المشار إليها مرتين في الأسبوع. يعني ± SEM فقدان وزن الجسم (٪) وتقدم. في اختبار مان ويتنيف <0.05 اعتبر ذات دلالة إحصائية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6: CX 3 CR1 + النواب التواصل مع خلايا OT-II خلال يحركها OVA نقل التهاب القولون تم فحص (A) عينات انسجة القولون من خارج الحي 3D التصوير متحد البؤر في يوم 7 و 14 و 21 بعد نقل OT-II / الأحمر + CD4 + T + CD62L الخلايا في CX 3 CR1 GFP / س + الفريق الاستشاري - / - المتلقين. التكبير 40X / 1.30. شريط النطاق = 30 ميكرون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كما هو الحال مع كل نموذج آخر، نموذج التهاب القولون يحركها مستضد المذكورة أعلاه قد تقدم عدد قليل من القضايا التي المحقق أداء هذه التقنية يجب أن تكون على علم. عندما حقن OT-II / أحمر + CD4 + T + CD62L الخلايا في الدولة المضيفة، يجب أن يكون محقق لطيف جدا ودقيق لادخال الإبرة في التجويف البريتوني. قد يؤدي عدم القيام بذلك سيؤدي في تمزق في الأمعاء من الفأرة التي قد تؤدي إلى الوفاة، أو إدارة تحت الجلد من الخلايا التي لا تحفز اي مرض.

عادة، سوف الفئران زيادة الوزن خلال الأسبوع الأول بعد نقل الخلية. المحقق ينبغي أن تزن الفئران في نفس الوقت في كل نقطة زمنية الوزن واستخدام نفس الرصيد وزنها في جميع أنحاء الإجراء بأكمله. في بعض الأحيان فئران التجارب، وخصوصا عندما وزنهم في بداية التجربة أقل من 18 غراما، لا تتطور أي علامات متلازمة الهزال. ومع ذلك، migh هذه الحيواناتر يزال تطوير التهاب الأمعاء كبير قيد التقييم العيانية.

عند العمل مع البكتيريا المعدلة وراثيا، يمكن أن يحدث التلوث. لتجنب هذه القضايا فإنه ينصح بشدة للتحقق من القولونية التعبير CFP-OVA باستخدام المجهر الفلورسنت لتحليل ما إذا كانت البكتيريا هي الفلورسنت وهي على شكل قضيب (شكل القولونية نموذجي).

يعتمد مستضد المقترحة يحركها التهاب القولون على ملاحظة أن CX 3 CR1 + النواب البكتيريا المتعايشة عينة اللمعية في حالة مستقرة وخلال حالات الالتهابات 36،37. وقد ثبت تحريض الخلايا التائية الردود في نموذج التهاب القولون يحركها مستضد من النمط الظاهري تنشيط للغاية من خلايا OT-II CD4 + T من كولون من CX 3 CR1 GFP / + س الاستشاري - / - الفئران تحدى مع المستضد، بالمقارنة مع خلايا T معزولة عن CX 3 CR1 GFP / + س الاستشاري 37. وهذا يتفق مع الدراسات السابقة التي، بعد نقل بالتبني من الخلايا OT-II تي في الفريق الاستشاري - / - الفئران، والناجم عن التهاب القولون فقط عندما طعن المضيفين مع، معربا عن OVA E. القولونية 51.

وتشير التصوير متحد البؤر التي CX 3 CR1 + البالعات وتقع على مقربة من ظهارة الأمعاء حتى يتمكنوا من أخذ عينات E. القولونية pCFP-OVA والتفاعل مع OT-II / خلايا الأحمر + CD4 + T. بعد أن عينات CX 3 CR1 + البالعات E. يتم تسليم القولونية pCFP-OVA مستضد اللمعية إلى CD103 + الخلايا الجذعية (DCS) من خلال CX 3 CR1 + البالعات. CD103 + البلدان النامية قادرون على الهجرة إلى العقدة الليمفاوية المساريقي (مليون) إلى رئيس الوزراء خلايا CD4 T 37،52. خلايا T تستعد تجميع في CLP حيث تظهر CX 3 CR1 + البالعات مستضد OVA إلى البريدخلايا ffector تي للحث على التهاب. تسليم وتقديم المستضد بواسطة CX 3 CR1 + البالعات يمكن أن يكون حدثا رئيسيا في تطور التهاب القولون.

القدرة على إحداث التهاب القولون مع بكتيريا تعرف معربا عن مستضد معين يوفر الفرصة لدراسة الظروف اللازمة لتطوير التهاب القولون 24. ويظهر هذا النموذج أن استجابة محددة لالببتيد الأنتيجين (OVA التي أعرب عنها كولاي) هي كافية للحث على التهاب الأمعاء في الفريق الاستشاري - / - المضيفين، مما يشير إلى أن الخلايا T قد تستجيب لمستضد معين من الأمعاء الدقيقة. ومستضد واحد يمكن أن تحفز التهاب الأمعاء في النماذج الحيوانية ولكن لا يمكن افتراض أن المستضدات واحدة هي السبب في مرض التهاب الأمعاء البشرية. وعلاوة على ذلك، في نموذج التهاب القولون نقل هناك ساذجة خلايا CD4 + T التي لها خصوصية غير معروفة، وبالتالي قد يكون رد الفعل إلى متعددة، بدءا من المستضدات لم تحدد هويتهم بعد، منوالجراثيم. وهناك حاجة إلى تحليل ودراسات كبيرة لتوضيح أفضل لدور مستضد معين في التسبب في التهاب الغشاء المخاطي.

في السنوات الأخيرة أدى استخدام نموذج حيواني مختلفة من التهاب القولون إلى التوسع في معرفة التسبب في مرض التهاب الأمعاء 53. ولكن نظرا لتعقيد والتسبب في هذا المرض، وليس هناك علاج نهائي 54. باستخدام نموذج وصفها، فمن الممكن لمعالجة العديد من جوانب IBD التي لم يتم توضيحها بشكل جيد حتى الآن، مثل (ط) التفاعلات بين وحيدات الخلايا الجذعية، (ب) الهجرة من البلدان النامية المعوية إلى مليون، (ج) تقديم المستضد، (د) صاروخ موجه من المستجيب الخلايا التائية من MLN إلى الصفيحة المخصوصة و (ت) تفعيل المستجيب خلايا تي في الصفيحة المخصوصة التي كتبها CX 3 CR1 + البالعات. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتأكيد ما اذا كان CX 3 CR1 + بلعمية / CD4 + T تفاعل الخلايا يلعب دورا رئيسيا فيالتسبب IBD. الفئران لا يمكن أن يكون ممثلا حقيقيا للإنسان وهذا يجب أن يوضع في الاعتبار عند استخدام نماذج الماوس لدراسة الإنسان IBD 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 244620
Rotary Shake Reiss Laborbedarf e. K. Model 3020 GFL
2 mm gap couvettes  Peqlab Biotechnologie GmbH 71-2020
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-100ML
Gene Pulser Xcell system  BioRad Laboratories GmbH 1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) Difco 244510
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393-5G
SOC Medium Sigma-Aldrich S1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation Kit Roche 11754777001
Agarose Carl Roth GmbH & Co 3810.1
EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 537020 
Gel chamber  PEQLAB Biotechnology GmbH 40-0708
Loading Dye Thermo Fisher R0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder  Thermo Fisher SM0312
Ethidium bromide solution Carl Roth GmbH & Co. KG 2218.3
Photo-documentation system  Decon Science Tech GmbH DeVision G 
DNA sequencing  MWG-Biotech GmbH
Phosphate buffered saline (PBS) Biochrom L182-50
Fluorescent microscope  Zeiss HBO 100
Mini-PROTEAN Tetra System Bio-Rad Laboratories GmbH 1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder  Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue Solution Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
Nitrocellulose membrane  Macherey-Nagel GmbH & Co. KG 741280
Electro blotter  Biometra GmbH 846-015-600
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A6003-25G
Anti-Ovalbumin antibody  Abcam ab181688
Anti-rabbit IgG  HRP Sigma-Aldrich A0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc 32132
Forene Abbott 2594.00.00
FBS Invitrogen 10500-064
Falcon Cell Strainers Fischer Scientific  08-771-2
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134-5G
Tris Base Sigma-Aldrich 10708976001
CD4+ CD62 L+ T isolation kit  Miltenyi Biotec 130-093-227 
MACS LS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Feeding Needle 20G SouthPointe Surgical Supply, Inc FN-7903
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128
Paraffin Sigma-Aldrich 1496904
Hematoxylin Sigma-Aldrich H9627
Eosin Y Sigma-Aldrich 230251 
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779 
Collagenase type VIII Sigma-Aldrich C-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium AppliChem A2044, 9050
Sodium azide Sigma-Aldrich 438456
Mouse BD Fc Block BD Pharmingen 553141
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2  BD Pharmingen 553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5  eBioscience 17-0041-83
FACS Calibur  BD Biosciences
FCS Express V3 software DeNovo
Meta scanning confocal microscope  Zeiss LSM 710 
Zeiss Workstation Zeiss LSM 7
Zeiss ZEM software  Zeiss v4.2.0.121
Maxisorp immuno plates  NUNC, Roskilde 442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase Jackson Immuno Research 016-050-084
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma-Aldrich 71768-5G
mAb R4-6A2 BD Biosciences 551216
mAb XMG1.2  BD Biosciences 554410
TECAN microplate-ELISA reader Tecan
EasyWin software Tecan
DNase I recombinant 4536282001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
  3. Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
  4. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
  5. Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
  6. Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
  7. Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
  8. Sleator, R. D. The human superorganism - of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
  9. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
  10. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
  11. Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111 (2011).
  12. Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
  13. Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
  14. Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
  15. Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, Suppl 1. E86-E93 (2010).
  16. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
  17. Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
  18. Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
  19. Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
  20. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
  21. Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
  22. Barnett, M., Fraser, A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis - Treatments, Special Populations and the Future. O'Connor, M. InTech. (2011).
  23. Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
  24. Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
  25. Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
  26. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
  27. Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
  28. Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
  29. Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
  30. Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
  31. van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
  32. Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
  33. Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
  34. Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
  35. Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
  36. Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
  37. Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
  38. Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
  39. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
  40. Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. (2013).
  41. Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
  42. Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
  43. Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
  44. Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
  45. Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. (2015).
  46. Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer's patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
  47. Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
  48. Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
  49. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
  50. Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6, (3), 177-188 (2013).
  51. Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
  52. Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
  53. Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404 (2012).
  54. Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).
تطوير التهاب القولون نموذج مدفوعة مستضد لدراسة عرض المستضدات التي كتبها مستضد الخلايا إلى خلايا T
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rossini, V., Radulovic, K., Riedel, C. U., Niess, J. H. Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells. J. Vis. Exp. (115), e54421, doi:10.3791/54421 (2016).More

Rossini, V., Radulovic, K., Riedel, C. U., Niess, J. H. Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells. J. Vis. Exp. (115), e54421, doi:10.3791/54421 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter