In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).
Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.
המעי הוא השטח הגדול ביותר של הגוף, כי הוא חשוף לסביבה החיצונית. מערכים מכריעים של חיידקי תושב ליישב את המעי האנושי כדי ליצור את החיידקים במעי (או microflora). זה מוערך להכיל עד 100 טריליון תאים מיקרוביאליים ומהווה אחד בתי הגידול החיידקים הצפופים ביותר הידוע בביולוגיה 1-3. ב GIT חיידקים ליישב נישה המעי שבו הם לשרוד ולהתרבות 4. בתמורה, החיידקים מעניקים מארח עם תכונות פונקציונליות נוספות לא מקודדות על הגנום שלו 1. לדוגמא החיידקים ממגרים את השגשוג של תאי אפיתל, מייצרים ויטמינים שמארח לא יכול לייצר בעצמם, המווסתים את חילוף חומרים ומגנים מפני פתוגנים 4-6. בהינתן יחסים מועילים זו, חלק מהחברים הציעו כי בני אדם הם "סופר-אורגניזמים" או "holobionts" כי הם תערובת של גני חיידקי אדם 7,8. לאור ההשפעה המיטיבה של החיידקים על המארח (אדם), מערכת החיסון במעי צריך לסבול חיידקים commensal לאפשר קיומם לומן אלא גם להרוג את הפתוגנים לפלוש מצד לומינל 9-11. המערכת החיסונית של המעי פיתחה מנגנונים להבחין בין מזיק מזיקים חיידקים לומינל; אולם המנגנונים האלה עדיין אינם מובנים היטב 12. שמירה על שלמות מעיים דורשת הומאוסטזיס חיסוני מוסדר בחוזקה כדי לשמור על האיזון בין הסובלנות חסינה 13. חוסר איזון הומאוסטזיס חיסון תורם לזירוז של מחלות מעיים כמו מחלות מעי דלקתיות (IBD) 3,14.
ישנם שני סוגים עיקריים של IBD: מחלת קרוהן (CD) וקוליטיס כיבית (UC). חולים עם מחלות אלו בדרך כלל סובלים דימום רקטלי, לשלשולים חריפים וכאבי בטן 15,16. הגורם היחיד של IBD עדייןלא ידוע, אלא שילוב של גורמים גנטיים, השפעות סביבתיות תגובות חיסוניות dysregulated עשוי להיות האירוע המרכזי לפיתוח מחלה 15.
במודלים של בעלי חיים עבור IBD שימשו במשך למעלה מ -50 שנה. בעשורים האחרונים מערכות הדגם החדש IBD פותחו כדי לבדוק את השערות שונות בנוגע בפתוגנזה של IBD 17,18. המודל הטוב ביותר המאופיין של קוליטיס כרוני הוא המודל המדבק התא שגורם שיבוש הומאוסטזיס T-cell 19,20. מודל זה כרוך בהעברת תאי T נאיביים מעכברי immunocompetent לתוך מארחים חסרי T ו- B-תאי (כגון RAG – / – ועכברי SCID) 16,21. התפתחות המחלה במודל זה קיים מעקב על 3-10 שבועות על ידי הערכת נוכחות של שלשול, פעילות גופנית מופחתת, וירידה במשקל הגוף. זה מה שנקרא תסמונת לבזבז 16. לעומת העכברים הבריאים הרקמה גסת צבאות מושתלים היא Thicker, קצר וכבד 16. שימוש במודל העברת תאי T, אפשר להבין עד כמה שונה אוכלוסיות תאי T יכולות לתרום בפתוגנזה של IBD 22. המודל העברת תאי T אינו מנתח את יחסי הגומלין בין נגמ"שים ותאי T בתהליך המחלה בצורה אנטיגן ספציפי. הוכח כי אינטראקציה בין תאי מיאלואידית ותאי הלימפה יכולה להיות אחראית על הפיתוח של דלקת מעי 23. אף שהיבטים רבים של IBD הובהרו, האירועים הראשוניים להוביל להתפתחות המחלה עדיין צריכים להיות מובנים באופן ברור.
הוכח כי בהעדר קוליטיס העברת חיידקים לא ניתן להקים 24. לאחרונה, מספר תאוריות מראות כי IBD יכול להיות תוצאה של תגובה חיסונית נגד חיידקי commensal 25. גם מחברים הציעו כי חיידקים commensal חיוניים כדי לגרום דלקת במעי דיסטלי26. בשנת נבט חינם (GF) חיות מערכת החיסון במעי נפגעת בדרך כלל 27,28, אבל קולוניזציה של עכברים אלה בתערובת של תוצאות חיידקים ללא ספציפיים לפתוגן בפיתוח של מערכת החיסון במעי המוסמכת מלא 29. לפיכך, החיידקים נראה שיש מרכיב מפתח בפתוגנזה של IBD, או כמנגנון כי גוזר או מגינה מפני התפתחות של דלקת מעיים 30,31. התיאוריות נוכחיות מראות כי IBD היא תוצאה של חוסר איזון מיקרוביאלי, שנקרא dysbiosis, בחולי נטייה גנטית 32, אבל זה לא ברור עדיין אם dysbiosis הוא הגורם או התוצאה של המחלה 12. בהתחשב בתפקיד של מיקרואורגניזמים בפיתוח IBD, בניסויים במבחנה הראו כי תאי T מסוג CD4 + יכול להיות מופעל על ידי נגמ"שים פעמו עם חיידקים במעיים 33,34.
יתר על כן, הוכח כי אנטיגנים ממינים של חיידקים שונים commensal, כגון E. coli, Bacteroides, Eubacterium ו פרוטאוס, מסוגל להפעיל תאים מסוג CD4 + T 35. זה מצביע על כך הצגת אנטיגנים חיידקיים לתאי T. הוא בעל חשיבות לפיתוח IBD. כדי להפחית את המורכבות של אנטיגנים מרובים שמפיקים מיקרופלורת בתהליך המחלה, זן E.coli נוצר שמייצר את אנטיגן OVA. קוליטיס ההעברה הושר על ידי הזרקת תאי T OVA הספציפיים לתוך RAG – / – חיות יישב עם להביע OVA E. coli.
מודל זה מבוסס על ראיות שנעשו לאחרונה והראו כי CX 3 CR1 + חברי פרלמנט, קבוצת משנה תא מרכזי שכבת הרירית המיוחדת הגסה (CLP) 36, נמצאים באינטראקציה עם תאי CD4 + T במהלך העברת קוליטיס 37. חברי פרלמנט לדגום את חלל המעי לאנטיגן חלקיקים, כגון חיידקים, באמצעות הדנדריטים שלהם 36, 38,39. לימודים קודמיםהוכיחו כי חברי פרלמנט יכול גם לקחת את אנטיגנים מסיסים, כגון OVA, מוחדר המעי לומן 40,41. בהתחשב שפע של חברי פרלמנט CX 3 CR1 + ב CLP, יתכן כי תאים אלה יכולים לטעום חיידקים לומינל ולתקשר עם תאים מסוג CD4 T. הדמיה Confocal של עכברים מושתלים עם תאי OVA ספציפי CD4 + T יישבו עם E. coli CFP-OVA, מראים כי CX 3 CR1 + חברי פרלמנט נמצאים בקשר עם OT-II CD4 + T תאים במהלך התפתחות קוליטיס מונחה אנטיגן. מודל זה מאפשר לימוד של תהליך מצגת אנטיגן בין נגמ"שים מעיים T תאים ספציפיים רק לחיידקים להביע אנטיגן מסוים לומן המעי.
כמו בכל מודל אחר, מודל קוליטיס מונחה אנטיגן שתואר לעיל רשאי להציג כמה בעיות שחוקר ביצוע הטכניקה חייב להיות מודע. כאשר הזרקת OT-II / אדום + CD4 + T CD62L + התאים המארחים, החוקר חייב להיות מאוד עדין וזהיר להכניס את המחט לתוך חלל הצפק. אי ביצוע הוראה זו עלולה לגרום…
The authors have nothing to disclose.
JHN is supported by the Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-19 | |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
Percoll (density 1.124 g/ml) | Biochrome | L-6145 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
FACS Calibur | BD Biosciences | ||
FCS Express V3 software | DeNovo | ||
Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
EasyWin software | Tecan |