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Immunology and Infection

항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기

doi: 10.3791/54421 Published: September 18, 2016

Introduction

대장은 외부 환경에 노출되어 상기 몸체의 큰 표면이다. 상주 균의 광대 한 배열 장내 미생물 (또는 미생물)를 형성하는 인간의 장내 정착. 이는 최대 100 조 미생물 세포로 구성되어 것으로 추정 생물학 1-3에 알려진 가장 인구 밀도가 세균의 서식지 중 하나 구성된다. 망할 놈의 박테리아는 생존과 4를 곱 장내 틈새 시장을 식민지화. 반환에서, 미생물은 유전자 1 인코딩되지 않은 추가 기능 기능 호스트를 부여한다. 예를 들어, 미생물은 상피 세포의 증식을 자극 스스로 호스트가 생성 할 수없는 비타민을 생산하고, 신진 대사를 조절하고 병원균 4-6을 방지합니다. 이 유익한 관계를 감안할 때, 몇몇 저자는 인간이 박테리아와 인간의 유전자 7,8의 혼합이다 "슈퍼 유기체"또는 "holobionts"것을 제안했다. 제 (인간) 호스트에있는 미생물의 수익에 미치는 영향을 감안할 때, 장내 면역 시스템은 루멘에서 자신의 존재를 가능하게뿐만 아니라 내강 측 9-11에서 침입 병원균을 죽일 공생 미생물을 허용 할 필요가있다. 장내 면역 시스템은 무해하고 잠재적으로 유해한 내강 미생물을 구별하는 메커니즘을 개발했다; 그러나 이러한 메커니즘은 아직 잘 (12)을 이해하지 않습니다. 장 무결성을 유지하는 것은 관용과 면역 (13) 사이의 균형을 유지하기 위해 엄격하게 규제 면역 항상성을 필요로한다. 면역 항상성의 불균형은 염증성 장 질환 (IBD) 3,14로 장 질환의 유도에 기여한다.

크론 병 (CD)과 궤양 성 대장염 (UC) : 두 가지 주요 IBD의 유형이있다. 이러한 질병을 가진 환자는 일반적으로 직장 출혈, 심한 설사와 복통 15, 16 겪는다. IBD의 하나의 원인은 아직유전 적 요인, 환경 적 영향 및 조절 이상 면역 반응의 알 수없는,하지만 조합이 질병 개발 (15)의 키 이벤트가 될 수 있습니다.

IBD에 대한 동물 모델은 50 년 이상 사용되어왔다. 지난 수십 년에 새로운 IBD 모델 시스템은 IBD (17, 18)의 발병 기전에 관련된 여러 가지 가설을 테스트하기 위해 개발되었다. 만성 대장염의 가장 특징으로하는 모델은 T 세포의 항상성 (19, 20)의 붕괴를 유도 T 세포 전달 모델이다. 16,21이 모델은 T 및 - (- / SCID 마우스와 같은 RAG 같은) B 세포가 부족 호스트로 면역 된 마우스에서 나이브 T 세포 전사 포함한다. 이 모델에서 질병의 발달은 체중 설사 존재 감소 신체 활동과 손실을 평가 3-10 주 동안 모니터링된다. 이 때문에 낭비 증후군 (16)이라고합니다. 건강한 쥐에 비해 이식 호스트의 대장 조직 thicke입니다R, 짧고 (16) 무거운. T 개의 셀의 전송 모델을 사용하면, T 세포 개체군은 22 IBD의 병인에 기여할 수있는 다른 방법을 이해할 수있다. T 개의 셀 전송 모델은 항원 특이 적 방식으로 질병 과정에 장갑차 및 T 세포 사이의 상호 작용을 분석하지 않는다. 또한 골수 세포 및 림프구 세포 간의 상호 작용은 염증 창자 (23)의 개발을 담당 할 수 있음을 보여왔다. IBD의 많은 부분이 밝혀져 있지만, 질환의 개발로 이어질 초기 사건은 여전히​​ 명확하게 이해되어야한다.

이는 미생물 전송 대장염이없는 것을 도시하고있다 (24)를 확립 할 수 없다. 최근 몇 이론 IBD는 공생 세균 (25)에 대한 면역 반응의 결과 일 수 있음을 시사한다. 저자는 공생 박테리아 말단 부위에 염증을 유발하는 데 필수적인 것이 제안26. 세균 무연 (GF) 동물 장 면역 체계는 일반적으로 (27, 28)을 손상되지만 완전 권한 장 면역계 (29)의 발전에 관련되는 무균 박테리아 결과의 혼합물이 마우스의 집락. 따라서, 미생물은에 걸리기 또는 장내 염증 30, 31의 개발에 대해 보호하는 메커니즘으로 하나, IBD의 발병 기전에 중요한 요소가 될 것으로 보인다. 현재의 이론에서는 유전 적 소인이 IBD 환자 32, dysbiosis 불리는 미생물 불균형의 결과임을 암시하지만, 분명하지 아직 dysbiosis가 원인 또는 병 (12)의 결과 인 경우. IBD의 개발 미생물의 역할을 고려하여, 시험 관내 실험에서 CD4 + T 세포는 장내 세균 (33, 34)와 펄스 장갑차에 의해 활성화 될 수 있음을 보여 주었다.

또한, 항원은 그 도시 된같은 E. 등 다양한 공생 박테리아 종, 대장균, 박 테로이드, Eubacterium테우스는 CD4 + T 세포 (35)를 활성화 할 수 있습니다. 이 세포를 T로 세균의 항원 제시는 IBD의 개발에 대한 중요성을 나타냅니다. 질병 과정에서 미생물에 의해 도출 된 여러 항원의 복잡성을 줄이기 위하여, 대장균 균주은 OVA 항원을 생성하는 생성되었다. - / - 전송 대장염은 RAG에 OVA 특이 적 T 세포를 주입하여 유도 하였다 OVA 동물 발현 E. 집락 대장균.

이 모델은 3 CR1 CX + 의원, 대장 점막 고유 층 (CLP) (36)의 주요 세포 서브 세트가 전송 중에 CD4 + T 세포와 상호 작용하는 것을 암시하는 최근 증거에 기초 37 대장염. 의원은 돌기 (36), (38, 39)를 이용하여 박테리아 등의 미립자 항원 창자 내강, 샘플링. 이전의 연구의원도 40, 41 루멘 장 도입 등의 OVA와 같은 수용성 항원을, 걸릴 수 있음을 보여 주었다. CLP를에 CX (3) CR1 + 의원의 풍요 로움을 감안할 때, 이러한 세포 내강 박테리아를 샘플링하고 CD4 T 세포와 상호 작용할 수있는 가능성이있다. E. 집락 OVA 특이 적 CD4 + T 세포를 이식 한 생쥐의 공 초점 화상 대장균 CFP-OVA는, CX (3) CR1 + 의원은 항원 중심 대장염의 개발 과정 OT-II CD4 + T 세포와 접촉하는 것을 보여준다. 이 모델은 장내 장갑차 만 장내 루멘에 특정 항원을 발현하는 박테리아에 특이적인 T 세포의 항원 제시 공정을 연구 할 수있다.

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Protocol

마우스는 사육과 울름 대학 (울름, 독일)의 동물 시설에서 특정 병원균이없는 (SPF) 조건에서 보관 하였다. 모든 동물 실험은 지역 동물 사용 및 관리위원회와 국립 동물 복지법의 지침에 따라 수행 하였다.

pCFP - OVA 플라스미드 1. 건설

  1. 플라스미드 PCI-OVA (저항 암피실린) 템플릿으로 42을 사용하여 프라이머 Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') 및 Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') (37)를 사용하여 풀 사이즈 OVA 유전자를 증폭. 특정 OVA 플라스미드를 생성하기 위해 프라이머 및 벡터를 SpeI와 라이터 시험 제한 부위를 사용하여 시판의 파지 미드 벡터 내로 (난자 코딩 서열 IE) PCR 산물을 복제.
  2. 플라스미드 패드 1을 사용하여 강한 구성 적 프로모터 P 하이퍼과 함께 CFP 코딩하는 유전자를 증폭 43 CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. 프라이머 및 벡터 (37)의를 SpeI 및 SacI로 제한 부위를 사용하여 특정 OVA-플라스미드 (암피실린 내성)에 CFP 코딩 유전자를 복제. 이 OVA - 코딩 서열에서 CFP 코딩 사이 6 글리신 잔기의 스페이서를 소개합니다.

대장균 pCFP - OVA 2. 건설

  1. 하룻밤 동안 회전 진탕 기에서 37 ℃에서 호기 루리아 베르 타니 (LB) 배지 100 ㎖에 콜라이 균주 DH10B 성장.
  2. -80 ° C에서 글리세롤 주식과 상점을 작성하는 글리세롤의 200 μL와 세균 배양 800 μl를 섞는다.
  3. LB 배지 5ml에 글리세롤 스톡으로부터 대장균 균주 DH10B의 50 μl를 넣고 회전 진탕 비켜 37 ℃에서 호 기적으로 그들을 성장rnight.
  4. 회전 진탕하에 37 ℃에서 LB 배지 250㎖를 가진 당황 1 L 삼각 플라스크에서 배양 전송.
  5. 600 nm에서 광학 밀도 박테리아 성장 (OD 600) 0.5의 다음 30 분 동안 얼음에 문화를 진정. 4 ℃에서 10 분 동안 5,000 XG에서 박테리아를 원심 분리기.
  6. 빙냉 10 % 글리세롤 및 원심 균 100㎖로 4 ℃에서 재현 탁 박테리아에서 10 분 동안 5,000 XG에 빙냉 멸균 H 2 O 원심 균 100㎖로 재현 탁 박테리아를 10 분 동안 5,000 XG에 4 ° C에서. 두 번이 마지막 단계를 반복합니다.
  7. 최종 세척 단계 후, 10 % 글리세롤 700 μL 세균을 재현 탁. -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 50 μL 씩 동결.
  8. 미리 냉장 전기 큐벳 (2mm 전극 거리)에 얼음과 전송에 50 μL 나누어지는을 녹여.
  9. 50 μl의 E.에 플라스미드 DNA (100 NG)의 5 μl를 추가 대장균 aliquoTS. 25 μF, 200 옴 (Ω) 2.5 kV의에 하나의 펄스로 전기를 수행합니다.
  10. 1 ㎖의 사전 가온 SOC 배지 (5g / L의 효모 추출물, 2g / L의 트립 톤, 10 mM 염화나트륨, 2.5 mM의 염화칼륨, 10 mM 염화 마그네슘, 10 mM의 마그네슘 설페이트)에 재현 탁 박테리아 및 37 ° C에서 부화 기적 1 시간 동안.
  11. LB 한천 플레이트에 플레이트 박테리아는 앰피 실린 100 ㎍ / ㎖ (LB 한천의 100 ㎖에 100 ㎎ / ㎖ 암피실린 주식 100 μl를 추가) 하룻밤 호기 37 ° C에서 부화로 보충.
  12. 암피실린 100 μg의 / ㎖로 보충 LB 한천 플레이트에서 하나의 식민지가 다시 행진을 선택합니다. 하룻밤 호기 37 ° C에서 품어.
  13. 단일 콜로니를 선택하고, 플라스미드 아이솔레이션 용 앰피 실린 100 ㎍ / ㎖로 보충 된 LB 배지 10ml에 밤새 그들을 성장. 시중에서 판매하는 플라스미드 미니 준비 키트를 사용하여 30 μl의 DH 2 O (증류수) 제조 업체에 따라 '로 플라스미드 DNA를 용출;의 프로토콜입니다. 제한 분석 및 DNA 시퀀싱 37,42,43하여 플라스미드를 확인합니다.
  14. E.의 긍정적 인 클론의 문화를 설정 LB 배지 100 mL에 대장균 pCFP-OVA는 암피실린 100 μg의 / ㎖로 보충. 회전 진탕 하룻밤에 37 ° C에서 기적 성장.
  15. -80 ° C에서 순수 글리세롤 및 저장의 200 μL와 세균 배양 800 μl를 섞는다.
  16. 실온 (RT)에서 10 분 동안 5,000 XG에서 밤새 배양 나머지 원심 분리하고 인산염 완충 식염수 (PBS)에 펠렛을 재현 탁. 유리 슬라이드에 현탁액의 10 μl를 배치하고, 커버 슬립으로 커버.
  17. CFP-OVA의 발현 형광 (450 nm에서 CFP 여기, 480 nm에서 방출)를 확인하기 위해 표준 형광 현미경으로 샘플을 관찰한다. 배율 400X로 시작하는 박테리아를 분석합니다.
  18. 원심 분리기 10 분, RT 5,000 XG에 하룻밤 문화 박테리아 1 ㎖. 40 μL에 펠렛을 재현 탁PBS 10 분 동안 95 ° C에서 끓인다.
  19. 10 분 동안 30,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 및 웨스턴 블롯 분석 (37)의 상층 액을 사용합니다. 400 : 1로 희석 토끼-발생 방지 OVA 폴리 클로 날 항체를 사용합니다.

OT-II의 3 세대 / 레드 마우스

  1. 구약-II / 레드 마우스 (37)을 생성하기 위해 적색 형광 단백질을 발현 여성 / 남성 마우스로 남성 / 여성 OT-II 마우스 (두 균주 시중에서 판매)을 교차.

4. 비장 세포 분리

  1. 어떤 할로겐화 에테르의 흡입 마취 후 자궁 전위에 의해 OT-II / 레드 쥐를 안락사 상업적으로 이용 가능한 (최대 유도 5 %).
  2. 마우스의 왼쪽 우수한 복부 부분을 잘라 가위를 사용합니다. 이 복부 부분에서 비장 (어두운 붉은 색 타원형 모양)이있다. 그것을 제거하기 위해 가위와 핀셋을 사용합니다.
    1. 구약-II / 레드 마우스의 비장의 압축을 해제하고 (100)를 통해 통과μm의 셀 스트레이너는 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해 1 mL의 주사기의 플런저를 사용하여 50 ㎖ 튜브에 위치. PBS 중 2 회 10 ㎖의 1 % 열 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 여과기를 세척한다.
  3. RT에서 5 분 동안 390 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 적혈구를 용해시키기 위해 예열 용해 완충액 (144 mM의 NH 4 CL, 17 mM 트리스, pH는 7.2) 5 ㎖로 펠렛을 재현 탁. 37 ° C에서 10 분을 품어.
  4. PBS 25 ㎖의 1 % FBS로 보충하여 시료를 세척 하였다. RT에서 5 분 동안 390 XG에 원심 분리기. PBS 10 ㎖의 1 % FBS로 보충 된 상기 펠렛을 재현 탁.
  5. 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 0.4 % 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL를 혼합한다. 1-2 분 동안 품어.
    1. 염색 된 세포의 10 μL와 혈구 챔버를 입력합니다. 사 1 × 1mm 하나의 챔버와 determin의 2 제곱을 현미경으로 세포를 계산평방 당 세포의 평균 수를 전자. 실행 가능한 세포는 흰색, 죽은 세포 파란색 표시가 나타납니다. 세포의 수를 결정 / 희석 인자에 의해 세포 수를 ml로 곱한다. 2 ~ 4 사분면이 계산되는 경우, 사분면의 숫자로 나눕니다.

5. CD4 + CD62 L + T 세포 농축

  1. 제외 또는 선택의 원리를 이용하여 자기 분리 키트를 통한 CD4 + CD62L + T 세포, 비장 세포를 풍부. 여기서, CD4 + T 세포를 분리하고, 상기 CD4 + T 세포의 풀 내의 CD62L + 인구 풍부 양성 선별을 사용하여 음성 선별을 사용한다.
    주 : 음의 선택 과정에서 고립되지는 않습니다 세포, (여기에 모든 CD4 음성 세포가) 자기 마이크로 비드과 함께 특정 항체로 표시되어 있습니다. 컬럼 세척 단계에서 그들이 EASI 수 있도록 CD4 + T 세포가 컬럼을 통해 통과 할 것이다LY 수집. 긍정적 인 선택 절차 세포에 자성 마이크로 비드과 함께 적절한 항체로 표시되어 격리된다. 열 세척 단계 동안 표지 세포는 열에있을 것입니다 그리고 그들은 자기 분야에서 열을 제거하고 버퍼로 세척하여 수집 할 수 있습니다.
  2. 음 선택 절차를 들어, 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA)이 보충 된 차가운 PBS에 40 ㎕의 10 7 전체 비장 세포를 재현 탁. (비 CD4 + T 세포를 특이 적으로 결합하는 항체) (10) 자기 분리 키트와 함께 제공 비오틴 표지 된 항체 칵테일의 μl를 추가하고 얼음에 15 분을 품어.
    1. 차가운 PBS 30 ㎕를 0.5 %의 BSA 및 안티 비오틴 마이크로 비드의 20 μL를 추가로 보충. 얼음에 20 분을 품어.
    2. PBS 10 ml를 5 분 동안 390 XG에 0.5 % BSA와 원심 보충 샘플 추가. 두 번이 단계를 반복합니다. 0.5 % BS 보충 차가운 PBS 1 ml의 세포를 재현 탁에이.
    3. 자기장의 음성 선별 과정의 특정 열을 배치하고 차가운 PBS 3 ㎖로 세정 칼럼에 0.5 % BSA로 보충. 차가운 PBS 3 ㎖로 3 차례 칼럼에 세포 현탁액을 추가 세척은 0.5 % BSA로 보충.
    4. 5 분 390 XG에 유출의 원심 분리기 세포. 컬럼을 통해 유출 통과는 레이블이없는 CD4 + T 세포가 포함되어 있습니다. 0.5 % BSA로 보충 된 1 ml의 PBS에 펠렛을 재현 탁하고, 세포를 계산.
    5. 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 0.4 % 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL를 혼합한다. 1-2 분 동안 품어.
      1. 염색 된 세포의 10 μL와 혈구 챔버를 입력합니다. 사 1 × 1mm 하나의 챔버의 2 제곱을 현미경으로 세포를 세어 평방 당 세포의 평균 수를 결정합니다. 실행 가능한 세포는 흰색, 죽은 세포 파란색 표시가 나타납니다. 세포 / ㎖ CEL 곱셈의 수를 결정희석 요인에 의해 리터 번호. 2 ~ 4 사분면이 계산되는 경우, 사분면의 숫자로 나눕니다.
  3. 긍정적 인 선택 절차는 107 미리 풍부한 CD4 + T 세포 분획 당 CD62L 마이크로 비즈의 10 μl를 추가합니다. 얼음에 15 분을 품어.
    1. PBS 10 ml를 5 분 동안 390 XG에 0.5 % BSA와 원심 보충 샘플 추가. 두 번이 단계를 반복합니다. 차가운 PBS 500 μL에 재현 탁은 0.5 % BSA로 보충.
    2. 자기장에 부정적인 선택 과정에 대한 구체적인 럼 놓고 칼럼에 0.5 % BSA로 보충 된 차가운 PBS 500 μL로 헹군다. 차가운 PBS 500 ㎕를 3 회 칼럼에 세포 현탁액을 추가 세척은 0.5 % BSA로 보충.
    3. 자기장에서 열을 제거하고 적절한 포집 관에 놓습니다. 컬럼에 0.5 % BSA와 보충 PBS 1 ㎖를 추가하고 CD4 + CD62L + T 세포를 세척단단히 열에 플런저를 밀어 열에 s의 유지.
      참고 : 격리 된 CD4 + CD62L + T 세포는 이제 생체 실험 등 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다. CD4 + CD62L + T 세포 분리 키트 제조업체의 지시에 따라, 마이크로 비드 독성 아니다. 작은 크기 (약 50 ㎚)으로 인해, 그들은 세포를 활성화하지 않는 그들은 세포 표면 항원 결정기를 포화되지 않습니다. 따라서, 분리 된 세포는 대장염 37,44,45을 유도하는 면역 결핍 쥐에 전달 될 ​​수있다.
    4. 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 0.4 % 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL를 혼합한다. 1-2 분 동안 품어.
      1. 염색 된 세포의 10 μL와 혈구 챔버를 입력합니다. 사 1 × 1mm 하나의 챔버의 2 제곱을 현미경으로 세포를 세어 평방 당 세포의 평균 수를 결정합니다. 가능한 세포의 appea흰색, 죽은 세포 파란색 나타납니다 r에. 세포의 수를 결정 / 희석 인자에 의해 세포 수를 ml로 곱한다. 이 경우 - 4 사분면이 계산되고, 사분면의 숫자로 나눕니다.

항원 중심 대장염 6. 유도

  1. - / - 생쥐 CX 3 CR1 GFP / + X RAG에 복강 3 × 105 OT-II / 레드 CD4 + CD62L + T 세포를 주입한다. 항원 특이 대장염의 유도, E. 관리 대장균 pCFP-OVA 앞니 뒤에 위관 또는 구두 점안하여 동물 당 PBS 100 ㎕의 1 × 10 8 콜로니 형성 단위 (CFU)의 용량에 모든 둘째 날.
  2. 일주일에 두 번 몸에 이식 된 쥐의 체중과 임상 조건 (마우스의 대변, 대변 일관성과 활동에 혈액의 존재)를 모니터링합니다.

조직 병리학 적 검사 7. 조직 샘플

  1. 일에서 조직 샘플을 채취이전 36, 46 설명 된대로 마우스의 전자 대장은 파라핀에 중성 완충 포르말린 (10 %) 및 embed에 고정합니다.
  2. 제 마이크로톰에 파라핀 샘플은 슬라이드에 장착하고, H & E 염색 (47, 48)을 수행합니다.
  3. 이전에 (47, 48)이 공표 한 대장의 조직 학적 분류 : 일반 (0 점수); 가벼운 대장염 (1 득점), 중간 대장염 (2 득점)과 중증 대장염 (3 득점).

대장 얇은 판의 propria 세포의 8. 분리

  1. 시중에서 판매하는 자궁 경부 전위 어떤 할로겐화 에테르의 흡입 마취 후 (유도 최대 5 %)에 의해 이식 된 쥐를 안락사.
  2. 배면이 위를 향하도록하여 동물을 놓습니다. 요도 개구부에 전방으로 피부를 잡아 집게를 사용합니다. 가슴에 사타구니에서 복부 정중선을 따라 피부를 잘라 가위를 사용합니다. 측면에 피부를 뒤로 잡아 당깁니다.
  3. 투명 복막 근육 벽을 통해 잘라체강을 개방. 맹장 (49) 항문에서 진행 대장을 확인합니다. 2 사지를 절단하고 지방에서 조직을 확보.
  4. 길이 방향 해부 가위를 사용하여 대장을 엽니 다. PBS 25 ml에 포함 된 배양 접시에서 파편과 점액을 제거하기 위해 1 % FBS와 보충 결장 조직을 흔들 핀셋을 사용합니다. 8mm 조각 - 5로 결장을 잘라.
  5. 워시 완충액 20 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브에서 결장 세그먼트를 배치했다. 세척 버퍼 500 ML의 DPBS, 10 mM이 헤 페스 mm로 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)가 포함되어 있습니다.
  6. 최대 속도에서 30 초 동안 튜브를 소용돌이.
  7. 200 rpm으로 10 분간 진탕하면서 37 ℃에서 수욕에서 대장 세그먼트 튜브 부화.
  8. 배양 후, 최대 속도에서 30 초 동안 튜브를 소용돌이.
  9. 상청액을 폐기하고, 세척 완충액 20 ㎖를 함유하는 새로운 50 ㎖ 튜브에서 조직 샘플을 놓는다. 반복 6-9 세 번 단계
  10. 의 S 폐기upernatants와 PBS의 25 ml에 포함 된 배양 접시에서 조직 샘플을 배치합니다. 몇 초 잔여 상피 세포를 제거하는 페트리 접시에 부드럽게 조직 샘플을 흔들 핀셋을 사용합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
  11. 2 × 2mm 2 조각으로 결장 조직을 잘라 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 클로스 트리 디움 histolyticum 0.5 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 타입 VIII 및 DNaseI 10 ​​U / ㎖와 매체의 10ml에 배양을 소화.
  12. 최대 속도에서 30 초 동안 튜브를 소용돌이.
  13. 200 rpm으로 35 분간 진탕하면서 37 ℃에서 수욕에서 대장 단편 부화 최대 속도에서 30 초마다 5 분간 튜브 소용돌이.
  14. 배양의 마지막에, 최대 속도에서 30 초 동안 튜브를 소용돌이.
  15. 새로운 50 ML 튜브에 위치 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달하여 소화 조각을 수집합니다.
  16. 5 분간 400 g에서 20 DPBS ml의 원심 분리를 첨가하여 시료를 세척 하였다. 그런 다음에 resuspend tDPBS 1 ㎖에서 그는 세포.
  17. 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 0.4 % 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL를 혼합한다. 1-2 분 동안 품어.
    1. 염색 된 세포의 10 μL와 혈구 챔버를 입력합니다. 사 1 × 1mm 하나의 챔버의 2 제곱을 현미경으로 세포를 세어 평방 당 세포의 평균 수를 결정합니다. 실행 가능한 세포는 흰색, 죽은 세포 파란색 표시가 나타납니다. 세포의 수를 결정 / 희석 인자에 의해 세포 수를 ml로 곱한다. 2 ~ 4 사분면이 계산되는 경우, 사분면의 숫자로 나눕니다.

FCM 분석 9. 세포 외 염색

  1. 원심 분리기 390 × g으로의 CLP 세포 5 분. FACS (A)의 1 ml의 세포를 재현 탁 (PBS에 1 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충)
    주 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이다. 그것은 저혈압, 냉증, 두통 발작이나 사망의 원인이 될 수 있습니다. (0, 아 지드 화 나트륨의 희석액0.1 % ~ 1.0) 일반적으로 사용자에게 특별한 위험을 제시하지만, 그들은 눈과 피부에 자극을하지 않습니다. 실험실 코트와 일회용 니트릴 장갑의 두 쌍을 입고있는 동안 따라서, 단지 화학 후드에서 아 지드 화 나트륨을 사용합니다.
  2. FACS A에 희석 FcγRIII / II CD16 / CD32에 대한 감독 단일 클론 항체 (단클론 항체) 2.4G2 (0.5 μg의 단클론 항체 / 10 6 세포)로 실온에서 15 분 동안 세포를 품어
  3. 390 X g에서 세포를 원심 분리기 5 분에 FACS (A)의 200 μl를 추가합니다. 두 번이 단계를 반복합니다. 0.5 4 ° C에서 20 분 동안 관련 단클론 항체의 / 10 6 세포를 ng를 가진 세포를 품어. FACS A의 항체 희석
  4. 390 X g에서 세포를 원심 분리기 5 분에 FACS (A)의 200 μl를 추가합니다. 두 번이 단계를 반복합니다. FACS의 A. 100 ㎕의 샘플을 재현 탁
  5. CX (3)으로부터 T 세포를 분석 CR1 GFP / + X RAG - / - OT-II / 37 흐름 cytometer 적색 CD4 T 세포로 재구성 쥐.

10. 공 초점 현미경 분석

  1. OT-II / 레드 CD4 + CD62L + T 세포로 재구성 여부 CX (3) CR1 GFP / + 마우스의 결장을 분석하고 E. 1 × 10 8 CFU로 모든 둘째 날 구두로 공급 대장균 균주 DH10B pCFP-OVA.
  2. 가위와 핀셋을 사용하여 마우스의 결장을 제거합니다. 이 길이 방향으로 해부 가위를 사용하여 엽니 다.
  3. 가위를 사용하여 대장 샘플의 5-8mm 조각을 잘라 유리 슬라이드에 넣고 된 커버와 커버.
  4. 40 / 1.30의 확대에 공 초점 현미경으로 대장 샘플을 분석 할 수 있습니다.
  5. 509 nm에서 488 nm에서 여기 및 방출 세트 필터를 사용하여 녹색 형광 단백질 (GFP)이 표시된 CX (3) CR1 + 의원을 감지합니다.
  6. 58에서 554 nm에서의 여기 및 방출 세팅 된 필터를 사용하여 적색 단백질을 발현하는 CD4 + T 세포를 검출6 나노 미터.
  7. 480 nm에서 450 nm에서 여기 및 방출 세트 필터를 사용하여 대장균 pCFP-OVA를 감지합니다.
  8. 관심 영역을 정의하고, 이전에 공동 위치 파악 분석을 수행하기 위해 50 바와 같이 분산도를 생성한다. 은 Manders와 피어슨의 계수에 따라 중첩 계수 : 2 개의 다른 공식을 사용합니다.

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Representative Results

항원 중심 대장염 모델 E.을 설정하려면 콜라이 균주 강한 구성 적 프로모터 P 하이퍼 (도 1a)의 제어 하에서 발현되는 CFP 유전자가 닭 오브 알부민 단백질과 융합 구조체에 대한 코딩 서열에 융합 된 플라스미드를 포함하는 구성되었다. 형광 현미경 보여줍니다 재조합 E. 대장균 pCFP-OVA가 아니라 부모의 E. 대장균 DH10B는 CFP (그림 1B)를 표현한다. E.을 생산하는 CFP-OVA- 대장균은 시험 관내 OT-II 세포를 활성화 및 E. 대조적으로 IFN-γ의 생산을 유도 할 수있다 CFP를 표현하는 대장균 균주(그림 2 참조). 그림 3a는 E.가 공급 CX (3) CR1 GFP / + 마우스의 대장 조직의 생체 3D 공 촛점 영상을 보여줍니다 대장균 pCFP-OVA. E. 대장균 pCFP-OVA 수상피 세포 및 장 가까이있는 대장 지하실 내에서 검출 될 CX (3) CR1 + 식세포와 공동-지역화. E.의 상대적 비율을 확인하려면 대장균 pCFP-OVA 3 CR1 + 식세포가, 파란색과 녹색의 형광 강도가 산란 말에 의해 결정되었다 정의 CX에 의해 내면화. 분석은 CX (3) CR1 + 세포가 E.의 11.9 ± 1.5 %를 샘플링 것으로 나타났다 대장균 pCFP-OVA는 콜론. OT-II에서 (그림 3B) / 레드 동물에서 발견, CD4 + T 세포 레드 표현과 Vβ 특징으로 유동 세포 계측법 (그림 4)로 표시 5.1 표현은.도 5a는 일반적인 개요를 보여줍니다 항원 구동 대장염 모델입니다. OT-II / 레드 + CD4 + T CD62L는 + 세포는 적응 적 CX (3)에 전송 된 CR1 GFP / + X RAG - / - 다음 E.으로 매초마다 하루 gavaged 된받는 사람대장균 pCFP-OVA. E.에 도전 할 때 대장균 pCFP-OVA는, CX (3) 전송 CR1 GFP / + X RAG - / - 마우스가 체중을 잃고 대장염 (그림 5B)의 임상 증상을 개발 6은 생체 3D 대장 조직 7 일, 14 일, 21 일 후의 공 초점 이미징 그림. 이형 CX의 재구성은 3 CR1 GFP / + X RAG - / - OT-II와받는 사람 / 레드 + 세포 E.에 도전 대장균 pCFP-OVA. 이레 셀 전송 후 몇 CX (3) CR1 + 식세포는 E. 샘플링 한 대장균 pCFP-OVA 및 OT-II는 / 레드 + 세포는 검출되지 않았다. 셀 전송 후 열네 일, CX E. 샘플링 3 CR1 + 식세포를 대장균 pCFP-OVA는 OT-II에 가까운 / 레드 + 세포에 있었다. 스물 일일 전지 후 E. 샘플링3 CR1 + 세포는 CX의 높은 숫자를 전송 대장균 pCFP-OVA 및 OT-II / R근접 CLP를 통해 분산 에디션 + 세포는 3 CR1 + 식세포를 CX합니다.

그림 1
그림 1 : CFP-OVA을 일으키기 E. 관련 제한 사이트와 pCFP - OVA의 대장균. (A)지도, OVA와 밝은 푸른 형광 단백질 CFP를 코딩하는 유전자. (B) 밝은 필드와 야생형 E.의 형광 현미경 이미지 대장균 DH10B, E. 대장균 DH10B pCFP 및 E. 대장균 DH10B pCFP-OVA. 스케일 바 :. 10 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : OTCFP-OVA로 자극 -II 세포는 IFN-γ를 생성합니다. 비장에서 분리 한 후, OT-II 세포는 E.의 지정된 번호로 자극 하였다 대장균 DH10B pCFP-OVA. 세균 세포는 5 μg의 / ㎖ 겐타 마이신 2 시간 배양 한 다음 불 활성화되었다. 배양 72 시간 후에, 상등액을 수집하고, IFN-γ의 농도는 ELISA에 의해 결정된다. 실험은 SEM ± 평균으로 제시 삼중 데이터에서 수행 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : CX (3) CR1 + 식세포 샘플 E. 대장균 pCFP-OVA. (A) CX (3) CR1의 CLP 조직GFP / + 마우스는 1 × 8 E.으로 gavaged 대장균 pCFP-OVA 7 일간 및 생체 공 초점 현미경으로 분석 하였다. 배율 40 배 / 1.30. 스케일 바는 30 μm의 =. (B) 내면화 E.의 비율 대장균 pCFP-OVA는 정량 데이터는 SEM ± 평균으로 제시했다. 맨 - 휘트니 테스트 페이지에서 <0.05가 통계적으로 유의 한 것으로 간주 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
도 4 :. OT-II / 적색 + CD4 + T 세포의 특성 (A) OT-II 유전자 변형 동물 OT-II을 수득하는 적색 형광 단백질을 발현하는 동물과 교배 / 적색 +세포. OT-II는 / 레드 + 세포는 OT-II / 레드의 비장에서 분리 하였다 형질 전환 동물, CD4 및 Vß5.1에 대한 염색 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : OVA 기반 전송 대장염 (A) 항원 구동 대장염 모델의 도식 표현.. E.으로 마우스와 호스트 gavaged 된 모든 둘째 날 - / - OT-II / 레드 + CD4 + T CD62L는 + 세포는 적응 적 3 CR1 GFP / + X RAG는 CX로 옮겨졌다 대장균 pCFP-OVA. 지정된 그룹 (B) 체중은 일주일에 두 번 측정 하였다. ± SEM 체중 감소 (%)을 의미하는 것이 제공된다. 맨 - 휘트니 테스트에서P는 <0.05가 통계적으로 유의 한 것으로 간주 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 :. CX 3 CR1 + 의원은 OVA 기반 전송 대장염 동안 OT-II 셀과 통신 (A) 대장 조직 샘플 OT-II / 레드의 전송 후 7 일, 14 및 21에서 생체 3D 공 초점 영상으로 조사 하였다 - / -받는 사람 CX (3) CR1 GFP / + X RAG에서 + CD4 + T CD62L는 + 세포. 배율 40 배 / 1.30. 스케일 바는 30 μm의 =.

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Discussion

다른 모든 모델과 같이, 상술 한 항원 구동 대장염 모델 기술을 수행하는 연구자는 유의해야 할 몇 가지 문제점을 제시 할 수있다. 구약-II 호스트에서 / 레드 + CD4 + T CD62L + 세포를 주입 할 때, 연구자는 복강에 주사 바늘을 ​​삽입하는 것은 매우 온화하고주의해야합니다. 그렇게하지 ​​않으면 사망에이를 수있는 마우스 또는 질병을 유발하지 않습니다 세포의 피하 투여의 소장의 파열 될 수 있습니다.

일반적으로 마우스는 셀 전송 후 첫 주 동안 체중이 증가 할 것이다. 연구자는 각각 중량 시점에서 동시에 마우스 무게 및 전체 공정에 걸쳐 동일한 무게 저울을 사용한다. 때로는 실험 쥐 실험의 시작에서 그 무게가 18g 이하이며, 특히 낭비 증후군의 징후를 개발하지 않는다. 그러나 이러한 동물 might는 여전히 거시적 평가에서 중요한 장내 염증을 개발한다.

유전자 변형 박테리아로 작업 할 때, 오염이 발생할 수 있습니다. 가 높은 박테리아가 막대 모양 (전형적인 대장균 모양) 형광하고 있는지 분석하기 위해 형광 현미경을 이용하여 CFP-OVA를 발현하는 대장균을 확인하는 것이 좋습니다 이러한 문제를 방지 할 수 있습니다.

제안 된 항원 피구 대장염 관찰에 의존하는 정상 상태 및 염증성 질환 (36, 37)3 CR1 CX + 의원 샘플 내강 공생 박테리아. 항원 구동 대장염 모델에서 T 세포 반응의 유도는 CX 3 CR1 GFP의 콜론에서 OT-II CD4 + T 세포의 고도로 활성화 된 표현형에 의해 입증되었다 / + X RAG - / - 항원과 도전 생쥐 CX는 3 CR1 GFP / + X RAG에서 격리 T 세포에 비해 (37)와 도전을하지 않은 쥐>입니다. - / - 마우스, 호스트는 OVA - 표현 E.에 도전했을 때 대장염 만 유도이의 이전 연구, RAG에서 OT-II T 세포의 입양 전송 후와 일치 대장균 51.

공 촛점 영상은 E.를 샘플링 할 수 있도록 CX (3) CR1 + 식세포가 장 상피 세포에 가까이 위치하고 있습니다 제안 대장균 pCFP-OVA는 및 OT-II / 레드 + CD4 + T 세포와 상호 작용합니다. CX (3) CR1 + 식세포는 E. 샘플링 한 후 대장균 pCFP-OVA 내강 항원 CX (3) CR1 + 식세포에 의해 CD103 + 수지상 세포 (DC가)에 전달된다. CD103 + 수지상 프라임 CD4 T 세포 37,52에 장간막 림프절 (MLN)로 마이그레이션 할 수 있습니다. 프라임 T 세포는 CX (3) CR1 + 식세포가 전자하기 위해 OVA 항원을 보여 CLP에서 조립ffector T 세포가 염증을 유도한다. CX에 의한 항원의 전달 및 프리젠 테이션 3 CR1 + 식세포는 대장염의 개발에서 중요한 이벤트가 될 수있다.

특정 항원을 발현 정의 된 박테리아로 대장염을 유발하는 능력은 대장염 (24)의 발전에 필요한 조건을 연구 할 수있는 기회를 제공한다. T 세포는 장내 미생물의 특이 적 항원에 반응 할 수 있음을 시사 호스트 - / -이 모델은 항원 성 펩티드 (E. coli에 의해 표현 OVA)에 대한 특정 응답 RAG 장내 염증을 유도하기에 충분한 것으로 나타났다. 단일 항원은 동물 모델에서 장내 염증을 유도 할 수 있지만, 단일 항원 인간 IBD의 원인이라고 가정 할 수 없다. 또한, 전사 성 대장염 모델에서 아직 미확인 된 항원과 같은 여러 반응성 일 수있다 따라서, 미지의 특이성을 갖고 나이브 CD4 + T 세포에서 존재미생물. 주요 분석과 연구가 잘 점막 염증 병인에서 특정 항원의 역할을 규명하기 위해 필요하다.

최근 대장염의 다른 동물 모델의 사용은 IBD (53)의 발병 기전의 지식을 확장하게되었다. 복잡성과 질병의 병인에 기인하지만, 최종 경화 (54)이 없다. 상술 한 모델을 이용하여, 이러한 단핵구와 수상 세포 사이의 (I)의 상호 작용뿐만 아니라 아직 명확하지 IBD의 여러 측면을 해결하는 것이 가능하다은 MLN에 장내 수지상 (II)의 이동, (ⅲ) 항원 제시, CX + 3 CR1 식세포에 의한 점막 고유 층의 고유 판 및 이펙터 T 세포 (V) 활성화에 MLN에서 이펙터 T 세포 (IV) 원점. 그러나 추가 연구는 CX (3) CR1 +의 식세포가 / CD4 + T 세포의 상호 작용이 중요한 역할을 담당하는 경우 확인 필요IBD의 발병 기전. 마우스는 인간의 진정으로 대표 할 수 없으며 마우스 모델 인간 IBD이 연구하는 데 사용하는 경우이 염두에 보관해야합니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 244620
Rotary Shake Reiss Laborbedarf e. K. Model 3020 GFL
2 mm gap couvettes  Peqlab Biotechnologie GmbH 71-2020
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-100ML
Gene Pulser Xcell system  BioRad Laboratories GmbH 1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) Difco 244510
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393-5G
SOC Medium Sigma-Aldrich S1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation Kit Roche 11754777001
Agarose Carl Roth GmbH & Co 3810.1
EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 537020 
Gel chamber  PEQLAB Biotechnology GmbH 40-0708
Loading Dye Thermo Fisher R0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder  Thermo Fisher SM0312
Ethidium bromide solution Carl Roth GmbH & Co. KG 2218.3
Photo-documentation system  Decon Science Tech GmbH DeVision G 
DNA sequencing  MWG-Biotech GmbH
Phosphate buffered saline (PBS) Biochrom L182-50
Fluorescent microscope  Zeiss HBO 100
Mini-PROTEAN Tetra System Bio-Rad Laboratories GmbH 1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder  Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue Solution Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
Nitrocellulose membrane  Macherey-Nagel GmbH & Co. KG 741280
Electro blotter  Biometra GmbH 846-015-600
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A6003-25G
Anti-Ovalbumin antibody  Abcam ab181688
Anti-rabbit IgG  HRP Sigma-Aldrich A0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc 32132
Forene Abbott 2594.00.00
FBS Invitrogen 10500-064
Falcon Cell Strainers Fischer Scientific  08-771-2
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134-5G
Tris Base Sigma-Aldrich 10708976001
CD4+ CD62 L+ T isolation kit  Miltenyi Biotec 130-093-227 
MACS LS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Feeding Needle 20G SouthPointe Surgical Supply, Inc FN-7903
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128
Paraffin Sigma-Aldrich 1496904
Hematoxylin Sigma-Aldrich H9627
Eosin Y Sigma-Aldrich 230251 
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779 
Collagenase type VIII Sigma-Aldrich C-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium AppliChem A2044, 9050
Sodium azide Sigma-Aldrich 438456
Mouse BD Fc Block BD Pharmingen 553141
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2  BD Pharmingen 553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5  eBioscience 17-0041-83
FACS Calibur  BD Biosciences
FCS Express V3 software DeNovo
Meta scanning confocal microscope  Zeiss LSM 710 
Zeiss Workstation Zeiss LSM 7
Zeiss ZEM software  Zeiss v4.2.0.121
Maxisorp immuno plates  NUNC, Roskilde 442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase Jackson Immuno Research 016-050-084
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma-Aldrich 71768-5G
mAb R4-6A2 BD Biosciences 551216
mAb XMG1.2  BD Biosciences 554410
TECAN microplate-ELISA reader Tecan
EasyWin software Tecan
DNase I recombinant 4536282001

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References

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항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기
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Rossini, V., Radulovic, K., Riedel, C. U., Niess, J. H. Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells. J. Vis. Exp. (115), e54421, doi:10.3791/54421 (2016).More

Rossini, V., Radulovic, K., Riedel, C. U., Niess, J. H. Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells. J. Vis. Exp. (115), e54421, doi:10.3791/54421 (2016).

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