Summary
De gevestigde model van transuretrale catheterisatie van muizen kan de studie blaas aandoeningen, met inbegrip van infectie van de urinewegen, maar kan alleen worden uitgevoerd bij vrouwtjes. Een nieuw model van mannelijke transuretrale instillation, gepresenteerde, kan onderzoek op een gebied dat gekenmerkt door sterke klinische en epizoötiologische verschillen tussen de geslachten.
Abstract
Infecties van de urinewegen (UTI) zijn zeer gemeenschappelijk wereldwijd, significante morbiditeit en gezondheidszorg-geassocieerde kosten oplopen. Kleine dierlijke modellen, die nauwkeurig vestiging van de ziekte en de progressie, toestaan dat dissectie van gastheer-pathogeen interacties en generatie van immuniteit tegen infectie. Bij muizen, intravesicale instillation van uropathogenic E. coli, de verwekker in meer dan 85% van de communautaire verworven UTI, recapituleert veel van de stadia van de infectie bij de mens in acht genomen. Tot voor kort echter kon UTI alleen worden gemodelleerd bij vrouwelijke dieren. Deze beperking heeft belemmerd de studie van sex-gerelateerde verschillen in UTI, evenals andere blaas aandoeningen, zoals kanker. Hier beschrijven we een methode voor het indruppelen van mannelijke muizen waarmee directe vergelijking tussen vrouwelijke en mannelijke dieren en bieden een gedetailleerd protocol om te beoordelen van blaas weefsel door stroom cytometry als een middel om host reacties op infectie beter te begrijpen. Deze benaderingen zullen samen, hulp bij de identificatie van gastheer factoren die aan seksuele vooroordelen waargenomen in UTI en andere blaas-geassocieerde ziekten bijdragen.
Introduction
Infecties van de urinewegen (UTI) zijn een van de meest voorkomende infecties in ontwikkelde landen1. Infectie tarieven zijn vergelijkbaar tussen vrouwtjes en mannetjes bij pasgeborenen en de oudere2. Premenopausal volwassen vrouwen, echter, hebben een sterk verhoogde incidentie van Gemeenschap-verworven UTI in vergelijking met mannen2,3. Gezien het feit dat deze ziekte invloed voornamelijk vrouwen, is fundamenteel en klinisch onderzoek overwegend gericht op UTI bij vrouwtjes. Urineweginfecties bij mannen is echter een aanzienlijke en understudied gezondheidszorg uitdaging4. Inderdaad, omdat Urineweginfecties bij mannen worden geassocieerd met hogere morbiditeit, deze infecties worden routinematig gedefinieerd als ingewikkeld4,5.
De evolutie van ons begrip van de centrale rol van seksuele vooroordelen in de Fysiologie en pathologie zijn nieuwe methoden nodig om te ontdekken dit eerder verwaarloosde aspect van ziekte. Geslacht verschillen spelen een essentiële rol in de immuniteit en infectie; vrouwtjes hebben een hogere incidentie van auto-immune ziekte, terwijl de mannetjes zijn meer vatbaar voor bepaalde infecties, zoals tuberculose, malaria en HIV6,7. Blaaskanker, een andere urologische pathologie, is aanzienlijk vaker voor bij mannen dan bij vrouwen, en verschillende studies hebben aangetoond een rol voor androgenen in de ontwikkeling van maligniteit8,9,10,11 ,12. Met name is echter onderzoek van intravesicale therapieën voor blaaskanker gebeurt uitsluitend bij vrouwelijke dieren, gezien het onvermogen om herhaaldelijk catheterize mannelijke muizen13.
De studie van UTI pathogenese leunt op knaagdieren modellen van infectie (bijvoorbeeld, muizen en ratten). Lymfkliertest modellen van Urineweginfecties kunnen tewerkstellen uropathogens oorspronkelijk geïsoleerd van menselijke infecties, zoals uropathogenic E. coli (UPEC), Klebsiella, Proteus, Staphylococcusof Enterococcus14. Meestal worden bacteriën in de blaas via catheterisatie van urethra binnengebracht. Na infectie, blazen en nieren kan worden verwijderd om de specifieke parameters van infecties, zoals bacteriële kolonisatie, weefselschade of15,16van de immuunrespons van de gastheer te beoordelen. Universeel, echter, worden slechts vrouwelijke dieren gebruikt voor onderzoek van de UTI. Inderdaad, veel studies hebben opgemerkt dat, als gevolg van anatomische redenen, catheterisatie van mannelijke muizen niet mogelijk13,17,18,19. Meer recentelijk, een chirurgische benadering van mannelijke instillatietest is beschreven, waarin de buik is geopend, de blaas wordt extern verplaatst door zachte druk op de opening in de buik te passen en bacteriën worden ingespoten in de blaas20. Deze aanpak maakt het mogelijk mannelijke infectie, ten koste van de chirurgische ingreep. Een belangrijke caveat van deze aanpak bevat dus, de invloed van ontsteking, over de resultaten van infectie zoals het potentieel voor het opwekken van een anti-inflammatoire wondgenezing reactie op de insnijding21. Als onze belangen omvatten geslacht bias in reactie op ziekte begrijpen ontwikkelde we een methode van bacteriële intravesicale instillation in mannelijke muizen die meer overeenkomt met de reeds lang gevestigde niet-chirurgische transuretrale aanpak gebruikt in vrouwelijke knaagdieren22 .
Ons model bouwt voort op een vastgelegde methode en biedt de mogelijkheid om rechtstreeks vergelijken de host immuunrespons op Urineweginfecties bij vrouwelijke en mannelijke dieren. Deze methode zal toelaten dissectie van geslacht gebaseerde verschillen in infectie, en potentieel bieden moleculaire en cellulaire aanwijzingen op de uitgesproken verschillen in de gevoeligheid en de reactie op de infectie tussen de seksen. Dit model heeft bovendien waarde buiten UTI studies, waardoor de oprichting van modellen te onderzoeken van andere blaas-geassocieerde ziekten, zoals blaaskanker, prostatitis, onder - of over - actieve blaas syndroom en interstitiële cystitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muis experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig goedkeuring van protocolnummer 2012-0024 door het Comité d'éthique nl expérimentation animale Paris Centre et Sud (de ethische commissie voor dierproeven), in toepassing van de Europese richtlijn 2010/63 EU.
1. bereiding van katheters
- Bereiden een pediatrische intraveneuze-access canule voor elke groep van muizen worden besmet. Met behulp van de ingebouwde veermechanisme, afstoten elke canule van de naald, volgens de instructies van de fabrikant. Gooi de naalden, behoud van alleen de kunststof intraveneuze canule.
- Steriliseren katheters in een laminaire flow-kap voor één ultraviolet (U.V.) cyclus, meestal 25-30 min.
Opmerking: Katheters kunnen worden gebruikt voor meer dan één muis, maar een nieuwe katheter moet worden gebruikt tussen experimentele groepen, seksen of bacteriestammen.
2. bereiding van Uropathogenic E. coli infectie
- Ten minste twee dagen vóór de infectie, met behulp van een steriele inoculatie lus, streak UPEC uit een bevroren bacteriële voorraad op een agarplaat Luria Bouillon (LB), die bevatten antibiotica indien nodig. Incubeer bij 37 ° C's nachts. Platen kunnen bij 4 ° C gedurende maximaal één week worden opgeslagen.
- In een steriele erlenmeyer van 100 ml, 10 ml LB, met antibiotica indien van toepassing, met een enkele kolonie van de LB-plaat beënten en incuberen bij 37 ° C's nachts (ongeveer 16-18 hr) staande.
Opmerking: Staande culturen toestaan de uitdrukking van type 1 pili, die nodig zijn voor infectie23. Culturen gegroeid schudden zal hebben minder efficiënt pili uitdrukking, en dus, inconsistente cijfers voor infecties. - Meet de optische dichtheid (OD)600 van de overnachting cultuur en berekenen van het aantal bacteriën per ml met behulp van een vooraf bepaalde groeicurve. Als een voorbeeld voor UPEC stam UTI89, OD600 = 0,35 is gelijk aan 2 x 108 CFU / ml, dus een overnachting cultuur met een OD600 = 2.4 zou gelijkwaardig 13,7 x 108 kve per ml. empirisch bepalen de relatie tussen de OD600 en levensvatbare bacteriën met elke nieuwe stam werkzaam voor infectie.
-
Bepaal de hoeveelheid bacteriën die nodig gezien het aantal dieren besmet zijn en dat elke muis ongeveer 107 kolonie-vormende eenheden (kve verdient) in 50 µl PBS. Opnemen in de berekening het dode volume van ~ 130 µl van de katheter en spuit kern en 100 µl nodig voor het bepalen van het entmateriaal.
- Draai de bacteriële suspensie in een tafelblad microcentrifuge bij 17.000 x g gedurende 1 minuut en resuspendeer de resulterende bacteriële pellet op 2 x 108 CFU / ml in PBS. Serieel Verdun een aliquoot gedeelte van deze schorsing en plaat op LB agar, met antibiotica indien van toepassing, om te bepalen van het exacte entmateriaal voor elke infectie.
- Trekken van de bacteriële entmateriaal in een spuit van 1 ml en bevestig de katheter aan het einde van de spuit. Tik op de spuit om te verwijderen alle lucht en drukt de zuiger te vullen de ruimte van de dode lucht in de katheter voordat u begint met de instillation.
3. voorbereiding van de muizen
- Anesthetize muizen via intraperitoneale injectie van 100 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine. Aanvullende warmte kan worden verstrekt.
- Ervoor zorgen dat elke muis is volledig verdoofd door het knijpen van de struikrover met gemiddelde druk. Muizen zijn volledig verdoofd wanneer ze niet reageren en vereisen van 3-5 min om deze staat te bereiken.
- Muizen liggende plaatsen en middelgrote druk uitoefenen op de onderbuik te legen van de blaas van urine. Volledige blazen voelt als een erwt onder de huid tussen de ileac toppen.
Opmerking: Geïnhaleerde Isofluraan heeft geweest tweedehands voor catheterize vrouwelijke muizen15,22, echter het is niet getest of mannelijke muizen zijn voldoende verdoofd door geïnhaleerde Isofluraan voor deze procedure.
4. transuretrale Instillation van vrouwelijke muizen
- Met behulp van de niet-dominante hand, plaats van de duim op de staart en een vinger van de dezelfde hand op de buik van de muis en het toepassen van zachte druk in tegengestelde richtingen om de muis stevig op zijn plaats te houden.
-
Plaats het uiteinde van de katheter loodrecht op de muis op de urethrale opening. Met zachte druk, schuif de katheter in de urethra, totdat de hub voldoet aan de urethrale opening, terwijl het tegelijkertijd het verlagen van de spuit zodat deze parallel loopt met het werkoppervlak. De katheter vereist geen smering. Duw niet en kracht van de katheter in de urethra. De katheter moet soepel en gemakkelijk schuif in de urinebuis, met weinig tot geen weerstand.
- Voordat het wekken van het entmateriaal (stap 4.3), eenmaal is de katheter op zijn plaats, heel zachtjes trekken de buikhuid naar het hoofd van de muis met de vinger van de niet-dominante hand die nog op de buik van de muis (stap 4.1). Als de katheter in de urethra, het samenstellen van de opening van de urinebuis weefsel wordt niet verplaatst, terwijl als de katheter onjuist in de vagina geplaatst is, het weefsel omhoog en weg van de katheter verplaatsen zal. Deze snelle test moet worden uitgevoerd op elke muis.
- Als de hub van de katheter de urethrale opening ontmoet, langzaam afzien 50 µl van de bacteriële entmateriaal. Een langzame instillation tarief minimaliseert vesicoureteral reflux in de nier. Verwijder langzaam de katheter ter voorkoming van lekkage, over een telling van 5. Muizen in hun kooien in een liggende positie plaatsen.
5. transuretrale Instillation van mannelijke muizen
- Plaats twee duim pincet cranially en caudally naar externe genitaliën van de muis. Intrekken van de voorhuid om volledig de eikel bloot te stellen. Zodra de penis extern geplaatst wordt, laat de verlostang duim.
- Het verplaatsen van de verlostang om te stabiliseren van de uitstekende penis loodrecht op het dier, het houden van het orgel, zachtjes maar gemeten. Visualiseer de urethrale neusgang en zorgvuldig het introduceren van de katheter in de kleine opening aan het uiteinde van het orgel. Zachtjes begeleiden de katheter in de penis, naar het lichaam van de muis, behoud van zachte spanning met de pincet. De katheter vereist geen smering. Forceer niet de katheter in de penis; de katheter moet soepel glijden in de urinebuis, met vermelding van de juiste plaatsing.
- Zodra de hub van de katheter voldoet aan het puntje van de penis, heel langzaam afzien 50 µl van het entmateriaal, terwijl het handhaven van de positie van de penis. De kwaliteit van de instillation kan worden genoteerd op dit moment volgens een vooraf bepaalde instillation kwaliteitsscore, als afgebeeld in Figuur 2.
- Intrekken van de katheter langzaam, over een aantal 5, om te voorkomen lekkage van het entmateriaal. Muizen in hun kooien in een liggende positie plaatsen. Dieren moeten beginnen te herstellen van de 30-45 min na de toediening van de verdoving.
6. bepaling van CFU in besmette organen
- Op vooraf bepaalde tijdstippen goedgekeurde offer muizen met behulp van operationele standaardprocedures (b.v., cervicale dislocatie of kooldioxide overdosis). Bevochtig de buik grondig met 70% ethanol om besmetting te minimaliseren door het bont.
- Maak een incisie over het onderste derde van de muis in de buik van ten minste 2 cm met behulp van schaar en aseptisch verwijderen van de blaas en andere gewenste organen, met inbegrip van maar niet beperkt tot, nieren, testis, zaadblaasjes of preputiale klieren, in 5 ml polypropyleen module GLB buizen met 1 ml steriele PBS. Houd alle monsters op het ijs.
- Meng de organen met een handbediende homogenizer tot bijna geen solide weefsel blijft, ongeveer 15 tot 60 sec afhankelijk van het orgel. Vet doet niet meng goed, en is gemakkelijk te herkennen als glanzend beige-wit weefsel. Vet voorafgaand aan of volgende homogenisering negeren. Wassen van de homogenizer in ethanol gevolgd door PBS tussen elk experimentele of orgel groep.
Opmerking: Gebruik meestal handheld homogeniseerders of kraal molen homogeniseerders. Terwijl al deze systemen hebben leverde vergelijkbare resultaten, zoals bepaald door directe vergelijking van bacteriële kve in 24 uur na infectie, moeten de optimale omstandigheden te homogeniseren gastheer weefsel met behoud van bacteriële levensvatbaarheid empirisch vóór worden vastgesteld routinematig uitvoeren van dit protocol. - Uitvoeren van seriële verdunningen van de gehomogeniseerde orgel schorsingen. Verdunningen op LB agar platen, met antibiotica indien nodig, plaat en incubeer overnachting (~ 15 hr) bij 37 ° C. UPEC stammen hebben zeer snelle verdubbeling tijden en als zodanig moet worden gewaakt om niet broeden de agar platen te lang omdat dit de mogelijkheid om afzonderlijke kolonies tellen zal belemmeren.
7. stroming cytometrische analyse van blaas weefsel
- Spijsvertering buffer met collagenase bij 34 eenheden/mL en DNase bij 100 µg/mL, in PBS voor te bereiden. Houd op ijs. Bereiden een conische tube van 15 ml per dier te worden geanalyseerd en aliquoot 1 ml spijsvertering buffer per buis.
- Op vooraf bepaalde tijdstippen goedgekeurde offer muizen met behulp van operationele standaardprocedures (bijvoorbeeld cervicale dislocatie of kooldioxide overdosis). Bevochtig de buik grondig met 70% ethanol om besmetting te minimaliseren door het bont.
-
Maak een incisie over het onderste derde van de muis in de buik van ten minste 2 cm met behulp van schaar en de volledige blaas verwijderen. Gehakt goed met een schaar, snijden de blaas in 2-3 mm2 formaat stukken, meestal ongeveer 8 stuks.
- Voeg één gehakt blaas per buis met spijsvertering buffer. Schud om te wassen gehakt blaas weefsel in de buffer van de spijsvertering. Houd op ijs totdat alle blazen zijn ontleed en gehakt.
- Incubeer gehakt blazen gedurende 60-75 minuten bij 37 ° C, met een krachtig schudden met de hand voor 5 s elke 15 min. Wanneer het weefsel een glasachtig transparante uitstraling heeft, lijkend op natte tissue papier, is vertering voltooid. Langdurige spijsvertering oppervlakte eiwitten wordt verwijderd uit de cellen die nodig zijn voor de identificatie en moet worden vermeden.
- Inactivering van de spijsvertering enzymen door toevoeging van 2-3 mL ijskoud stroom cytometry buffer (PBS met 2% foetale runderserum (FBS) en 0,2 mM EDTA) en meng voorzichtig. Plaats de buizen op ijs.
- De inhoud van de tube passeren een 100 µm filter in een conische tube van 15 mL geplaatst om de schorsing van een enkele cel en te verwijderen van elk bindweefsel. Druk zachtjes op eventuele resterende weefsel door het filter met het einde van de zuiger van een injectiespuit. Was het filter met een extra 2 mL stroom cytometry buffer. Houd de monsters op ijs.
- Wassen van monsters door centrifugeren gedurende 7 minuten bij 200 x g, 4 ° C. Resuspendeer pellets in 100 µL stroom cytometry buffer met Fc blok, verdund tot 5 µg/mL en overdracht aan een 96-Wells ronde bodemplaat. Voeg 100 µL gewenst antilichaam cocktail aan elk monster na 10-15 min. Incubeer monsters gedurende 30-45 minuten, op ijs, beschermd tegen licht.
Opmerking: Fc blok is een reagens gebruikt om te voorkomen dat de binding van het Fc deel van antilichamen tegen cellen uiten Fc receptoren. Het doel ervan is om te minimaliseren van niet-specifieke antilichaam binding. Bepaling van antilichamen te gebruiken zullen afhankelijk van de hypothese wordt getest in het experiment en moet worden geselecteerd met input uit de literatuur. In Figuur 3, voor het meten van de totale immuun cel infiltratie, een anti-CD45 antistof werkte, dat is een pan-immuun cel eiwitten. - Wassen van monsters door centrifugeren gedurende 7 minuten bij 200 x g, 4 ° C. Resuspendeer cel pellets in 200 µL stroom cytometry buffer en een 40 µm cel zeef monsters passeren op een 5 ml polystyreen buis vlak voor acquisitie op een stroom cytometer.
- Het gehele monster verzameld op de cytometer van de stroom. Een goede vertering zal opleveren 200.000-400.000 cellen, met 8.000-10.000 CD45+ immuuncellen van naïeve muis blazen, terwijl besmette organen meer bevatten zal cellen16 (Figuur 3).
Opmerking: Monsters voorbereid flow cytometrische analyse niet worden gebruikt om te evalueren van de CFU. Het is niet aanbevolen om de blaas gesplitst in twee delen, zoals geen bewijs bestaat om aan te tonen dat kolonisatie van UPEC of immuun cel infiltratie uniform in de gehele van het weefsel is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de ontwikkeling van dit protocol leeftijd cohorten van vrouwelijke en mannelijke C57Bl/6 muizen 6 tot 8 weken werden bijgebracht, en bacteriële belasting geëvalueerd in blazen op tijdstippen, variërend van 1 uur tot 30 dagen. De resultaten van deze studies zijn gedetailleerd elders (Zychlinsky Scharff et al., in behandeling). Hier presenteren we representatieve gegevens uit 24 hr infecties. Met name, was bacteriële belasting gelijk tussen mannelijke en vrouwelijke muizen op 24uur na infectie (Figuur 1). Weinig variatie in bacteriële belasting werd waargenomen binnen elke groep 24 uur na infectie, vergelijkbaar met wat werd gemeld in vrouwelijke muizen15,16.
Als voldoende lege Bladders van urine voordat de infectie is gezorgd, wordt aanzienlijke lekkage van het entmateriaal zelden waargenomen bij vrouwelijke muizen. Echter, instillation in mannelijke muizen resulteerde in significante hoeveelheden van bacteriële entmateriaal lekken van de urethra, met name tijdens de ontwikkelingsfase van dit protocol. We gebruikt om te bepalen of verlies van entmateriaal ten tijde van infectie beïnvloed kolonisatie of de vestiging van infectie, een rating-systeem voor elke instillation. Elke instillation werd gescoord op een schaal van 1-5, met 1 wordt het meest optimale en bacteriële kolonisatie was vastbesloten 24uur na infectie (Figuur 2, box). Terwijl dit systeem onderzoeker afhankelijk was, en daarom mogelijk subjectief, de voornaamste schrijver van deze studie vastbesloten alle scores onmiddellijk na instillation, voorafgaand aan de evaluatie van bacteriële belasting in besmette blazen. Geen statistisch significante verschillen bestaan tussen de CFU verkregen van andere dieren met verschillende instillation scores, zoals beoordeeld door een niet-parametrische Kruskal-Wallis test vergelijken de gemiddelde rang van elke kolom met de gemiddelde rang van elke tweede kolom (p = 0.17) en corrigeren voor meerdere vergelijkingen met behulp van een Dunns test. Uit deze analyse, kan worden geconcludeerd dat suboptimaal instillations (score > 3), wat resulteert in aanzienlijke lekkage van bacteriële entmateriaal gedurende infectie, doen geen aanzienlijke gevolgen voor bacteriële kolonisatie op 24 hr (ZieFiguur 2, grafiek). Met name met de ervaring, de frequentie van lekken in mannelijke muizen aanzienlijk verminderd.
Tenslotte, de doelstelling bij de ontwikkeling van dit model was de immune reactie op UPEC in vrouwelijke en mannelijke dieren direct te vergelijken. Om te testen of cellulaire infiltratie is gewijzigd tussen de geslachten in reactie op de UTI, het aantal CD45+ immuuncellen in naïef en geïnfecteerde cohorten van vrouwelijke en mannelijke muizen werden beoordeeld door stroom cytometry. Terwijl het aantal immuuncellen in naïeve dieren aanwezig niet verschillend tussen vrouwelijke en mannelijke muizen was (p = 0.95), was er een statistisch significante toename van de infiltratie in het blazen van geïnfecteerde vrouwelijke muizen (p = 0.0015) (Figuur 3A-B).
Figuur 1: UPEC koloniseert vrouwelijke en mannelijke blazen met gelijke doelmatigheid. 6 tot 8 weken oude vrouwelijke en mannelijke C57Bl/6 muizen werden ingeprent met 107 CFU van UPEC. 24 uur na infectie, blazen aseptisch werden verwijderd om het opsommen van bacteriële belasting. Perceel beeldt CFU/blaas. Elke stip is één muis, representatieve experiment van 5 getoond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: De kwaliteit van Instillation doet niet correleren met bacteriële belasting op 24uur na infectie. 6 tot 8 weken oude vrouwelijke en mannelijke C57Bl/6 muizen werden ingeprent met 107 CFU van UPEC. Een enkele onderzoeker toegewezen onmiddellijk na elke instillation, een kwaliteitsscore aan de instillation, zoals gedefinieerd door specifieke criteria (boxed tekst). 24 uur na infectie, blazen aseptisch werden verwijderd om het opsommen van bacteriële belasting. Perceel beeldt de toegewezen kwaliteit score versus CFU/blaas. Elke stip is één muisklik, 5 gepoolde experimenten worden weergegeven. p = 0.17, Kruskal-Wallis test vergelijken de gemiddelde rang van elke kolom met de gemiddelde rang van elke tweede kolom met post hoc Dunns test op meerdere vergelijkingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Immuun cel infiltratie is gestegen bij vrouwelijke muizen in reactie op de UTI. Zes tot 8 week oude vrouwelijke en mannelijke C57Bl/6 muizen werden ingeprent of niet met 107 CFU van UPEC. Representatieve dot plots verbeelden de cellen van de totale blaas met CD45+ immuuncellen gated roze van naïef of besmette muizen. Grafiek toont het absolute aantal CD45+ immuuncellen in blazen van naïef of 24 hr besmette muizen. Elke stip is één muis, 2 gepoolde experimenten worden weergegeven. p-waarden bepaald door Mann-Whitney-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transuretrale instillation van mannelijke muizen biedt veel nieuwe onderzoeksmogelijkheden naar de invloed van geslacht op blaas mucosal ziekte, maar ook verschillende uitdagingen. Plaats een beperking is dat de instillation aanvankelijk blijken kan te zijn technisch moeilijk, wat resulteert in buitensporige ontsteking tijdens het inbrengen van de katheter. Verbetering van de techniek kan worden bereikt door de instillation van dode muizen met een gekleurde oplossing, zoals Evans blauwe kleurstof. Om te bevestigen dat de instillatietest succesvol is, blazen moeten visueel worden geïnspecteerd en het volume van ingeprent vloeistof kan worden geëvalueerd door extractie met een tuberculine-injectiespuit. Het belang van trage, zachte bewegingen kan niet genoeg worden benadrukt: er moet geen weerstand en geen kracht gebruikt voor het invoegen van de katheter, aangezien dit in overmaat ontsteking en weefselbeschadiging resulteren zal. Wanneer goed uitgevoerd, zal de katheter moeiteloos glijden in de urinebuis. Als weerstand of obstructie wordt gevoeld, is het beste te verwijderen van de katheter en probeer te brengen inbrengen.
Door de kwaliteit van de instillation bacteriële belasting 24uur na infectie correleren, we laten zien dat een onvolmaakte techniek, waarin een kleine hoeveelheid van de bacteriële entmateriaal verloren op het moment van infectie is, nog steeds in robuuste kolonisatie van resulteert de blaas. In gebruik makend van dit protocol, moet een onderzoeker streven naar lekvrije instillations. De robuustheid van de procedure verzekert echter dat onvolmaakt instillations nog steeds nuttige gegevens en interpreteerbaar resultaten bieden zal.
Het grote voordeel van onze techniek over de enige gepubliceerde alternatieve methode van mannelijke blaasontsteking is de niet-invasieve, niet-chirurgische aanpak. Onze aanpak met behulp van transuretrale instillation volgt de fysiologische route via de urinebuis naar de blaas, zonder het verstoren van de structurele integriteit van de buik. De invasieve techniek, beschreven door Olson en collega's20, inclusief factoren die inherent zijn aan de chirurgische procedures, met inbegrip van ontsteking, vertraagde genezing, en daaruit voortvloeiende littekenweefsel. Met name relevant zijn met betrekking tot de studies van de immuunrespons voor infectie is van het organisme antwoord op chirurgisch trauma. Het gaat hierbij om de vorming van een pro-inflammatoire milieu en potentiële weefsel granulatie, evenals een anti-inflammatoire wond genezing programma als onderdeel van het genezingsproces. Deze factoren vertegenwoordigen ongewenste invloeden binnen de experimentele setting.
Tot slot, het doel van deze studie was het ontwikkelen van een methode waarmee directe vergelijking van mannelijke en vrouwelijke immuunrespons in de loop van UTI, die kan worden toegepast op toekomstige studies aanpakken van de invloed van geslacht op blaas mucosal ziekte, zoals besmetting en Kankerbiologie. Als een tweede verschillend voordeel beschreven de methode hier spiegels die in vrouwelijke muizen voor decennia19 gebruikt. Experimenten in mannelijke muizen met deze techniek zijn dus vergelijkbaar met een breed lichaam van het lopende onderzoek. Onze experimenten is gebleken dat verschillen in reactie bestaan en dat deze verschillen aanknopingspunten bieden kunnen voor het begrip van geslacht gebaseerde verschillen in reactie op de mucosal infecties, evenals andere ziekten van de blaas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Matthieu Rousseau voor kritische lezing van het manuscript en het laboratorium van dendritische Immunobiologie voor hun nuttige inzichten tijdens de ontwikkeling van dit protocol en project. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiële middelen van de Europese Unie zevende kader programma Marie Curie actie (PCIG11-GA-2012-3221170 en de Immuno-oncologie LabEx (MOI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0.7 mm external diameter, 14 mM long | BD Medical | 381811 or 381411* | * catalog number is country-dependent |
| inoculating loop | Greiner Bio-One | 731171 | |
| LB Miller broth | Difco | 244620 | |
| LB Miller agar | Difco | 244520 | |
| Cuvettes | Bio-rad | 223-9955 | |
| syringes | B Braun | 9166017V | |
| Thumb (Adson) forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 5 ml tubes, polypropylene | Falcon | 352063 | |
| Tissue Ruptor disposable probes | Qiagen | 990890 | |
| 15 ml flip cap tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| DNAse | Invitrogen | 18047019 | |
| Liberase TM | Sigma-Aldrich | 5401119001 | should be aliquotted and stored at -20 °C to avoid repeated freeze-thaw |
| 100 µM MACS SmartStrainers | Miltenyi | 130-098-463 | compatible with 15 ml tubes, preferred |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352360 | compatible with 50 ml tubes, if MACS Smart Strainers are not available |
| 96 well plate | Falcon | 353077 | |
| Fc block | BD Pharmingen | 553142 | anti-CD16/CD32 |
| anti-mouse CD45 antibody | BD Biosciences | 561487 | many different fluorescent conjugation options are available |
| 5 ml tubes polystyrene with filter cap | Falcon | 352235 | |
| insulin syringe | Terumo | BS05M2913 | |
| hand held homogenizer | Qiagen | 9001272 | TissueRuptor |
| flow cytometer | BD Biosciences | N/A | Fortessa SORP |
| Flow cytometry software | BD Biosciences | N/A | Diva |
References
- Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11 (3), 551-581 (1997).
- Harper, M., Fowlis, G. Management of urinary tract infections in men. Trends in Urology, Gynaecology & Sexual Health. 12 (1), 30-35 (2007).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat Rev Urol. 7 (12), 653-660 (2010).
- Lipsky, B. A. Urinary tract infections in men. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis, and treatment. Ann Intern Med. 110 (2), 138-150 (1989).
- Conway, L. J., Carter, E. J., Larson, E. L. Risk Factors for Nosocomial Bacteremia Secondary to Urinary Catheter-Associated Bacteriuria: A Systematic Review. Urol Nurs. 35 (4), 191-203 (2015).
- Markle, J. G., Fish, E. N.
- Yu, C. Y., Whitacre, C. C. Sex, MHC and complement C4 in autoimmune diseases. Trends Immunol. 25 (12), 694-699 (2004).
- Castelao, J. E., et al. Gender- and smoking-related bladder cancer risk. J Natl Cancer Inst. 93 (7), 538-545 (2001).
- Donsky, H., Coyle, S., Scosyrev, E., Messing, E. M. Sex differences in incidence and mortality of bladder and kidney cancers: national estimates from 49 countries. Urol Oncol. 32 (1), 40-e31 (2014).
- Garg, T., et al. Gender Disparities in Hematuria Evaluation and Bladder Cancer Diagnosis: A Population-Based Analysis. J Urol. , (2014).
- Dobruch, J., et al. Gender and Bladder Cancer: A Collaborative Review of Etiology, Biology, and Outcomes. Eur Urol. , (2015).
- Hsu, J. W., et al. Decreased tumorigenesis and mortality from bladder cancer in mice lacking urothelial androgen receptor. Am J Pathol. 182 (5), 1811-1820 (2013).
- El Behi, M., et al. An essential role for decorin in bladder cancer invasiveness. EMBO Mol Med. 5 (12), 1835-1851 (2013).
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Am J Med. 113, Suppl 1A. 05S-13S (2002).
- Ingersoll, M. A., Kline, K. A., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. G-CSF induction early in uropathogenic Escherichia coli infection of the urinary tract modulates host immunity. Cell Microbiol. 10 (12), 2568-2578 (2008).
- Mora-Bau, G., et al. Macrophages Subvert Adaptive Immunity to Urinary Tract Infection. PLoS Pathog. 11 (7), e1005044 (2015).
- Oliveira, P. A., et al. Technical Report: Technique of Bladder Catheterization in Female Mice and Rats for Intravesical Instillation in Models of Bladder Cancer. (Conference Title)39th Scand-LAS and ICLAS Joint Meeting. 36, 5-9 (2009).
- Seager, C. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2 (12), 1008-1014 (2009).
- Hagberg, L., et al. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin). Infect Immun. 40 (1), 273-283 (1983).
- Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. J Am Soc Nephrol. , (2015).
- Knipper, J. A., et al. Interleukin-4 Receptor alpha Signaling in Myeloid Cells Controls Collagen Fibril Assembly in Skin Repair. Immunity. 43 (4), 803-816 (2015).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Development of intracellular bacterial communities of uropathogenic Escherichia coli depends on type 1 pili. Cell Microbiol. 9 (9), 2230-2241 (2007).
