Summary
Il modello stabilito di cateterizzazione transuretrale dei topi permette lo studio delle patologie della vescica, compreso l'infezione delle vie urinarie, ma può essere eseguito solo nelle femmine. Un nuovo modello di maschio instillazione transuretrale, qui presentato, consentirà la ricerca in un'area segnata da forti differenze cliniche ed epidemiologiche tra i sessi.
Abstract
Infezioni del tratto urinario (UTI) sono estremamente comuni in tutto il mondo, incorrere in spese associate all'assistenza sanitaria e morbosità significativa. Piccoli modelli animali, che riflettano la progressione e l'istituzione di malattia, consentono la dissezione delle interazioni ospite-patogeno e generazione di immunità all'infezione. Nei topi, instillazione intravescicale di uropathogenic Escherichia coli, l'agente causativo in più dell'85% della Comunità acquisito UTI, ricapitola molte delle fasi di infezione osservati in esseri umani. Fino a poco tempo, tuttavia, UTI potrebbe solo essere modellati in animali di sesso femminile. Questa limitazione ha ostacolato lo studio delle differenze sesso-correlate in UTI, così come altre patologie della vescica, come il cancro. Qui, descriviamo un metodo per infondere di topo maschio che permette il confronto diretto tra gli animali femminili e maschili e fornire un protocollo dettagliato per valutare il tessuto della vescica mediante citometria a flusso come un mezzo per comprendere meglio la risposta dell'ospite all'infezione. Insieme, questi approcci saranno di aiuto nell'identificazione di fattori dell'ospite che contribuiscono a pregiudizi di sesso osservati in UTI e altre malattie della vescica-collegate.
Introduction
Infezioni del tratto urinario (UTI) sono una delle infezioni più comuni nei paesi sviluppati1. Tassi di infezione sono simili tra femmine e maschi tra i neonati e gli anziani2. Donne di età premenopausa, tuttavia, hanno un'incidenza notevolmente aumentata di comunità-acquistata UTI rispetto a uomini2,3. Dato che questa malattia influisce principalmente donne, ricerca fondamentale e clinica è prevalentemente concentrata sulla UTI nelle femmine. Tuttavia, UTI negli uomini è una sfida significativa e understudied assistenza sanitaria4. Infatti, poiché UTI negli uomini sono associati con la morbosità più alto, queste infezioni sono ordinariamente definite come complicato4,5.
Come si evolve la nostra comprensione del ruolo centrale delle polarizzazioni di sesso in fisiologia e patologia, nuovi metodi sono necessari per esplorare questo aspetto precedentemente trascurato della malattia. Le differenze del sesso gioca un ruolo essenziale nell'immunità e infezione; le femmine hanno la più alta incidenza della malattia autoimmune, mentre i maschi sono più suscettibili alle infezioni, come la tubercolosi, la malaria e HIV6,7. Cancro alla vescica, un'altra patologia urologica, è sensibilmente più prevalente negli uomini che nelle donne, e diversi studi hanno dimostrato un ruolo per gli androgeni nello sviluppo di malignità8,9,10,11 ,12. In particolare, tuttavia, indagine intravesical terapie per cancro alla vescica è realizzata esclusivamente in animali di sesso femminile, a causa dell'incapacità di cateterismo ripetutamente topo maschio13.
Lo studio della patogenesi UTI si basa pesantemente su modelli del roditore di infezione (per esempio, topi e ratti). Modelli murini di UTI possono impiegare uropathogens originariamente isolato da infezioni umane, come ad esempio uropathogenic Escherichia coli (UPEC), Klebsiella, enterococco, stafilococcoo Proteus14. In genere, i batteri vengono introdotti nella cateterizzazione della vescica tramite l'uretra. Dopo l'infezione, vesciche e reni può essere rimosso per valutare i parametri specifici di infezione, come colonizzazione batterica, danni ai tessuti o host risposta immunitaria15,16. Universalmente, tuttavia, solo gli animali femminili sono utilizzati per la ricerca UTI. Infatti, molti studi hanno notato che, per ragioni anatomiche, la cateterizzazione di topo maschio non è possibile13,17,18,19. Più recentemente, è stato descritto un approccio chirurgico per instillazione maschile, in cui l'addome è aperto, la vescica è spostata esternamente applicando leggera pressione all'apertura nell'addome e batteri vengono iniettati nella vescica20. Questo approccio consente a infezione maschio, a costo di intervento chirurgico. Così, un avvertimento importante di questo approccio include l'influenza della infiammazione, sul risultato di infezione, come il potenziale di indurre una risposta antinfiammatoria di guarigione all' incisione21. Come i nostri interessi vi sono la comprensione bias di sesso in risposta alla malattia, abbiamo sviluppato un metodo di instillazione intravescicale batterica in di topo maschio che rispecchia maggiormente l'approccio transuretrale non chirurgica consolidata utilizzato in femminile roditori22 .
Il nostro modello si basa su una metodologia consolidata e offre la possibilità di confrontare direttamente la risposta immunitaria a UTI in animali maschili e femminili. Questo metodo verrà permesso di dissezione delle differenze basate sul sesso nell'infezione e potenzialmente offrire indizi molecolari e cellulari delle pronunciate differenze nella suscettibilità e risposta all'infezione tra i sessi. Inoltre, questo modello ha valore di là di studi UTI, permettendo la creazione di modelli per studiare altre malattie di vescica-collegate, ad esempio cancro alla vescica, prostatite, sindrome della vescica a sotto - o sovra - attivo e cistite interstiziale.
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Protocol
Mouse esperimenti sono stati condotti in conformità con l'approvazione di numero di protocollo 2012-0024 dalla Comité d' ' éthique en expérimentation animale Paris Centre et Sud (comitato etico per la sperimentazione animale), in applicazione del europeo direttiva 2010/63 DELL'UNIONE EUROPEA.
1. preparazione dei cateteri
- Preparare una cannula di accesso endovenoso pediatrica per ogni gruppo di topi infetti. Utilizzando il meccanismo a molla integrato, cedere ogni cannula del suo ago, come indicato dal produttore. Gettare gli aghi, conservando solo la cannula endovenosa di plastica.
- Sterilizzare i cateteri in cappa a flusso laminare per ciclo di un raggi ultravioletti (U.V.), in genere 25-30 min.
Nota: Cateteri possono essere utilizzati per più di un mouse, tuttavia un nuovo catetere deve essere utilizzato tra gruppi sperimentali, i sessi o ceppi batterici.
2. preparazione di Uropathogenic Escherichia coli infezione
- Almeno due giorni prima dell'infezione, utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, striatura UPEC dall'azione batterica congelate su una piastra di agar di brodo di Luria (LB), contenenti antibiotici se appropriato. Incubare a 37 ° C durante la notte. Piastre possono essere memorizzati a 4 ° C fino a una settimana.
- In una sterile beuta da 100 ml, inoculare 10ml LB, contenenti antibiotici se del caso, con una singola Colonia dalla piastra LB e incubare in piedi a 37 ° C durante la notte (circa 16-18 ore).
Nota: In piedi culture consentono l'espressione di tipo 1 pili, che sono necessari per infezione23. Colture cresciute agitazione avrà meno efficiente espressione pili e pertanto incoerenti tassi di infezione. - Misurare la densità ottica (OD)600 della cultura durante la notte e calcolare il numero di batteri / ml utilizzando una curva di crescita pre-determinato. Come un esempio, per il ceppo UPEC UTI89, OD600 = 0.35 è equivalente a 2 x 108 CFU / ml, quindi, una cultura durante la notte con un OD600 = 2.4 sarebbe equivalente a 13,7 x 108 CFU / ml. determinare empiricamente la relazione tra la OD600 e batteri vitali con ogni nuovo ceppo impiegato per l'infezione.
-
Determinare la quantità di batteri necessari considerando il numero di animali infetti e che ogni mouse dovrebbe ricevere circa 107 unità formanti colonie (CFU) in 50 µ l di PBS. Includere nel calcolo del volume morto ~ 130 µ l del nocciolo del catetere e la siringa e 100 µ l necessari per determinare l'inoculo.
- Spin la sospensione batterica in una microcentrifuga da tavolo a 17.000 x g per 1 min e risospendere il pellet batterico risultante a 2 x 108 CFU / ml in PBS. In serie diluire un'aliquota di questa sospensione e piastra su agar LB, con antibiotici, se del caso determinare l'esatta inoculo per ogni infezione.
- Disegnare l'inoculo batterico in una siringa da 1 ml e fissare il catetere all'estremità della siringa. Picchiettare la siringa per rimuovere tutta l'aria e premere lo stantuffo per riempire lo spazio di aria morta del catetere prima di iniziare l'instillazione.
3. preparazione dei topi
- Anestetizzare topi tramite l'iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg ketamina e 5 mg/kg xylazina. Calore supplementare può essere fornito.
- Garantire che ogni mouse è completamente sedata comprimendo il grassatore con media pressione. Topi sono completamente sedati quando non reagiscono e richiedono 3-5 min per raggiungere questo stato.
- Mettere topi supina ed esercitare una pressione media al basso ventre di svuotare la vescica di urina. Vesciche completo sentono come un pisello sotto la pelle tra le creste di ileac.
Nota: Per inalazione isoflurane è stata usata per cateterismo topi femmina15,22, tuttavia, non è stato testato se topi maschi sono sufficientemente anestetizzati da isoflurane inalate per questa procedura.
4. transuretrale instillazione di topi femmina
- Usando la mano non dominante, posizionare il pollice sulla coda e un dito della stessa mano sull'addome del mouse e applicare una leggera pressione in direzione per tenere il mouse saldamente in posizione opposta.
-
Posizionare la punta del catetere perpendicolare al mouse all'orifizio uretra. Con una leggera pressione, far scorrere il catetere nell'uretra, fino a quando l'hub soddisfa l'orifizio uretra, mentre simultaneamente abbassa la siringa in modo che sia parallela al piano di lavoro. Il catetere non richiede lubrificazione. Non forzare o spingere il catetere nell'uretra. Il catetere deve scorrere senza intoppi e facilmente nell'uretra, con poca o nessuna resistenza.
- Prima di instillare l'inoculo (punto 4.3), una volta il catetere è a posto, molto delicatamente tirare la pelle dell'addome verso la testa del mouse con il dito da non-dominante della mano che è già sull'addome del mouse (punto 4.1). Se il catetere è inserito nell'uretra, i tessuti che compongono l'orifizio dell'uretra non si muovono, mentre se il catetere è posizionato in modo non corretto nella vagina, il tessuto si muoverà fino e dal catetere. Questo rapido test dovrebbe essere eseguito su ogni mouse.
- Quando l'hub del catetere incontra l'orifizio uretra, lentamente Pipettare 50 µ l dell'inoculo batterico. Un tasso lento instillazione minimizza il reflusso vescico-ureterale nel rene. Rimuovere lentamente il catetere per evitare perdite, sopra un conteggio di 5. Posto topi nelle loro gabbie in posizione supina.
5. transuretrale instillazione di topo maschio
- Collocare due pollice pinza cranialmente e caudalmente ai genitali esterni del mouse. Ritrarre il prepuzio per esporre completamente il pene di glans. Una volta che il pene è posizionato esternamente, rilasciare il forcipe di pollice.
- Riposizionare il forcipe per stabilizzare il pene sporgente perpendicolare all'animale, che tiene l'organo delicatamente ma teso. Visualizzare il meato uretrale e introdurre con cautela il catetere nella piccola apertura sulla punta dell'organo. Guidare delicatamente il catetere nel pene, verso il corpo del mouse, mantenendo leggera tensione con il forcipe. Il catetere non richiede lubrificazione. Non forzare il catetere nel pene; il catetere deve scorrere senza intoppi nell'uretra, che indica il corretto posizionamento.
- Una volta che l'hub del catetere soddisfa la punta del pene, molto lentamente di dispensare 50 µ l di inoculo, mantenendo la posizione del pene. La qualità dell'instillazione può notare in questo momento secondo un punteggio di qualità di instillazione predeterminato, come quello mostrato in Figura 2.
- Ritrarre il catetere lentamente, nel corso di un conteggio di 5, per evitare perdite di inoculo. Posto topi nelle loro gabbie in posizione supina. Animali dovrebbero iniziare a recuperare 30-45 min dopo la somministrazione dell'anestetico.
6. determinazione di CFU negli organi infetti
- Agli intervalli di tempo predeterminati, sacrificio topi utilizzando approvato procedure operative standard (ad es., la dislocazione cervicale o sovradosaggio di anidride carbonica). Inumidire l'addome accuratamente con etanolo al 70% per minimizzare la contaminazione di pelliccia.
- Fare un'incisione attraverso il terzo inferiore dell'addome del mouse di almeno 2 cm con le forbici e rimuovere asetticamente la vescica e qualsiasi altro organi desiderati, compreso ma non limitato a, reni, testicoli, vescicole seminali o ghiandole prepuziali, in 5 ml salvapercussore in polipropilene tubi contenenti 1 ml di PBS sterile. Mantenere tutti i campioni sul ghiaccio.
- Omogeneizzare gli organi con un omogeneizzatore palmare finché non rimane quasi nessun tessuto solido, circa il 15-60 sec a seconda dell'organo. Grasso non omogeneizzare bene ed è facilmente riconoscibile come tessuto beige-bianco lucido. Gettare il grasso prima di o dopo omogeneizzazione. Lavare l'omogeneizzatore in etanolo seguita da PBS tra ogni sperimentale o gruppo di organo.
Nota: In genere, utilizza omogeneizzatori palmare o omogeneizzatori di laminatoio del branello. Mentre tutti questi sistemi hanno dato risultati simili, come determinato dal confronto diretto di batterica CFU a 24 ore dopo l'infezione, le condizioni ottimali per omogeneizzare il tessuto ospite, preservando la vitalità batterica dovrebbero essere determinate empiricamente prima eseguendo questo protocollo ordinariamente. - Effettuare diluizioni seriali di sospensioni organo omogeneizzato. Diluizioni su piastre di agar LB, contenenti antibiotici quando appropriato, del piatto e incubare pernottamento (~ 15 hr) a 37 ° C. UPEC ceppi hanno tempi di raddoppiamento molto rapidi e come tale, dovrebbe prestare attenzione a non Incubare le piastre di agar troppo a lungo perché questo ostacolerà la capacità di contare diverse colonie.
7. analisi citofluorimetrica di tessuto della vescica
- Preparare il tampone di digestione contenente collagenasi a 34 unità/mL e dnasi a 100 µ g/mL, in PBS. Tenere il ghiaccio. Preparare una provetta conica da 15 ml per animale per essere analizzati e aliquota 1 ml di tampone di digestione per tubo.
- Timepoints predeterminato, sacrificio topi utilizzando approvato procedure operative standard (ad es., la dislocazione cervicale o sovradosaggio di biossido di carbonio). Inumidire l'addome accuratamente con etanolo al 70% per minimizzare la contaminazione di pelliccia.
-
Fare un'incisione attraverso il terzo inferiore dell'addome del mouse di almeno 2 cm con le forbici e rimuovere l'intera vescica. Trita bene con le forbici, tagliare la vescica in 2-3 mm2 pezzi, in genere circa 8 pezzi di dimensioni.
- Aggiungere una vescica macinata per ogni provetta contenente tampone di digestione. Agitare per lavare il tessuto della vescica macinate nel buffer di digestione. Tenere il ghiaccio fino a quando tutte le vesciche sono sezionati e macinate.
- Incubare macinate vesciche per 60-75 min a 37 ° C, con agitazione vigorosa a mano per 5 s ogni 15 min. Quando il tessuto ha un aspetto vetroso trasparente, simile a carta velina bagnata, la digestione è completa. Digestione prolungata rimuoverà le proteine di superficie dalle cellule necessari per l'identificazione e dovrebbe essere evitata.
- Inattivare gli enzimi di digestione aggiungendo 2-3 mL di tampone di citometria a flusso ghiacciato (PBS contenente 2% siero bovino fetale (FBS) e 0,2 mM EDTA) e mescolare delicatamente. Inserire le provette sul ghiaccio.
- Per garantire una sospensione unicellulare e rimuovere tutto il tessuto connettivo, passare il contenuto del tubo attraverso un filtro 100 µm, posizionato in una provetta conica da 15 mL. Premere delicatamente qualsiasi tessuto residuo attraverso il filtro con la fine di un stantuffo della siringa. Lavare il filtro con un ulteriori 2 mL di tampone di citometria a flusso. Mantenere i campioni su ghiaccio.
- Lavare i campioni mediante centrifugazione per 7 min a 200 x g, 4 ° C. Risospendere il pellet in 100 µ l flusso cytometry buffer Fc blocco contenitore, diluito a 5 µ g/mL e il trasferimento a un 96 pozzetti fondo piatto rotondo. Dopo 10-15 min, aggiungere 100 µ l desiderato anticorpo cocktail per ogni campione. Incubare i campioni per 30-45 min, sul ghiaccio, al riparo dalla luce.
Nota: Blocco di Fc è un reagente usato per impedire il legame della porzione Fc degli anticorpi alle cellule che esprimono i recettori Fc. Suo scopo è quello di ridurre al minimo il legame non specifico anticorpo. Determinazione degli anticorpi da utilizzare dipenderà l'ipotesi nell'esperimento in fase di test e deve essere selezionata con ingresso dalla letteratura. Nella Figura 3, per misurare l'infiltrazione delle cellule immuni nel complesso, un anticorpo anti-CD45 è stato impiegato, che è una proteina delle cellule pan-immunitario. - Lavare i campioni mediante centrifugazione per 7 min a 200 x g, 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in 200 µ l tampone di citometria a flusso e tramandare una provetta polistirolo da 5 ml appena prima dell'acquisizione su un citometro a flusso campioni attraverso un colino di cella 40 µm.
- Raccogliere il campione intero sul citofluorimetro. Una buona digestione produrrà 200.000-400.000 cellule, con 8.000-10.000 CD45+ cellule immuni da ingenuo vesciche del mouse, mentre gli organi infetti conterrà più cellule16 (Figura 3).
Nota: Campioni preparati per analisi cytometric di flusso non possono essere utilizzati per valutare CFU. Non si consiglia di dividere la vescica in due parti, come non esiste alcuna prova per dimostrare tale colonizzazione UPEC o l'infiltrazione delle cellule immuni è uniforme in tutto il tessuto.
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Representative Results
Lo sviluppo del presente protocollo, coorti dei topi C57Bl/6 maschili e femminili all'età di 6-8 settimane sono stati infusi e batterici onere valutato in vesciche a intervalli di tempo che vanno da 1 ora a 30 giorni. I risultati di questi studi sono dettagliati altrove (Zychlinsky Scharff et al., in sospeso). Qui, presentiamo i dati rappresentativi da infezioni di 24 ore. In particolare, la carica batterica era equivalente tra topi maschi e femmine alle 24 ore post-infezione (Figura 1). Piccola variazione in carica batterica è stata osservata all'interno di ogni gruppo 24 ore post-infezione, simile a quello che è stato segnalato in topi femmina15,16.
Se la cura è presa per vesciche sufficientemente vuote di urina prima dell'infezione, perdita significativa dell'inoculo è osservata raramente nei topi femmina. Tuttavia, instillazione nel topo maschio ha provocato notevoli quantità di inoculo batterico fuoriuscita dall'uretra, particolarmente durante la fase di sviluppo del presente protocollo. Per determinare se la perdita di inoculo al momento dell'infezione influenzato colonizzazione o l'istituzione dell'infezione, abbiamo impiegato un sistema di rating per ogni instillazione. Ogni instillazione è stato valutato su una scala da 1 a 5, dove 1 è la colonizzazione batterica e più ottima era determinato 24 ore post-infezione (Figura 2, box). Mentre questo sistema era investigatore dipendente, e quindi potenzialmente soggettivo, l'autore principale di questo studio determinato tutti i punteggi immediatamente dopo instillazione, prima della valutazione della carica batterica in vesciche infetti. Nessuna differenza statisticamente significativa ha esistito fra il CFU ottenuto da animali con punteggi differenti instillazione, come valutato da un test non parametrico di Kruskal-Wallis confrontando il grado medio di ogni colonna con il grado medio di ogni altra colonna (p = 0.17) e la correzione per i confronti multipli utilizzando test di un Dunn. Da questa analisi, si può concludere che suboptimale instillazioni (Punteggio > 3), con conseguente notevole perdita di inoculo batterico durante l'infezione, non influiscono significativamente colonizzazione batterica a 24 ore (Figura 2, grafico). In particolare, con esperienza, la frequenza di colatura in di topo maschio ha diminuito significativamente.
Infine, l'obiettivo nello sviluppo di questo modello era di confrontare direttamente la risposta immunitaria verso UPEC negli animali maschili e femminili. Per verificare se l'infiltrazione cellulare è alterata tra i sessi in risposta a UTI, il numero di CD45+ cellule immuni in ingenuo e infetti coorti di topi femminili e maschi sono state valutate tramite flusso cytometry. Mentre il numero delle cellule immunitarie presenti negli animali ingenuo non era differente fra i topi femminili e maschili (p = 0,95), c'era un aumento statisticamente significativo in infiltrazione nelle vesciche di topi femminili infetti (p = 0,0015) (Figura 3A-B).
Figura 1: UPEC colonizza vesciche maschili e femminili con uguale efficienza. Sei a topi C57Bl/6 8 settimane di età maschili e femminili erano instillato con 107 CFU di UPEC. 24 ore post-infezione, vesciche erano asetticamente rimosso per enumerare la carica batterica. Trama raffigura CFU/vescica. Ogni punto è un mouse, rappresentanza esperimento di 5 mostrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La qualità di instillazione non correla con carica batterica a 24 ore dopo l'infezione. Sei a topi C57Bl/6 8 settimane di età maschili e femminili erano instillato con 107 CFU di UPEC. Immediatamente dopo ogni instillazione, un singolo ricercatore assegnato un punteggio di qualità per l'instillazione, come definito da criteri specifici (lettura). 24 ore post-infezione, vesciche erano asetticamente rimosso per enumerare la carica batterica. Trama raffigura la qualità assegnato il punteggio contro CFU/vescica. Ogni puntino è un mouse, figurano 5 esperimenti in pool. p = 0.17, test di Kruskal-Wallis confrontando il grado medio di ogni colonna con il grado medio di ogni altra colonna con test post-hoc di Dunn per i confronti multipli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'infiltrazione delle cellule immuni è aumentato nei topi femmina in risposta a UTI. Sei a 8 settimana vecchi topi C57Bl/6 maschili e femminili sono stati infusi o non con 107 CFU di UPEC. Punto rappresentativo trame raffigurano le cellule della vescica totale con CD45+ cellule immunitarie gated in rosa da ingenuo o topi infettati. Il grafico mostra il numero assoluto di CD45+ le cellule immunitarie nelle vesciche da ingenui o 24hr infettati topi. Ogni puntino è un mouse, 2 pool esperimenti sono mostrati. p-valori determinati da test di Mann-Whitney. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Transuretrale instillazione di topo maschio offre molte nuove opportunità di ricerca sull'influenza del sesso sui malattia mucosa della vescica, ma anche presenta varie sfide. Innanzitutto, una limitazione è che l'instillazione inizialmente può risultare per essere tecnicamente difficile, con conseguente eccessiva infiammazione durante l'inserimento del catetere. Miglioramento nella tecnica può essere raggiunto tramite l'instillazione di topi morti con una soluzione colorata, come colorante blu di Evans. Per confermare che l'instillazione ha esito positivo, devono essere ispezionati visivamente vesciche e il volume di liquido infuso può essere valutato mediante estrazione con una siringa per tubercolina. L'importanza dei movimenti lenti e delicati non può essere sopravvalutata: ci dovrebbe essere alcuna resistenza e nessuna forza utilizzato per inserire il catetere, come questo si tradurrà in eccesso infiammazione e danno tissutale. Se eseguita correttamente, il catetere scivolerà senza sforzo nell'uretra. Se si avverte resistenza o ostruzione, è meglio rimuovere il catetere e tentare nuovamente di inserimento.
Correlando la qualità dell'instillazione di carica batterica 24 ore dopo l'infezione, abbiamo dimostrato che una tecnica imperfetta, in cui una piccola quantità di inoculo batterico è persa al momento dell'infezione, risulta ancora in robusto colonizzazione della vescica. Utilizzando questo protocollo, un investigatore dovrebbe mirare a raggiungere instillazioni senza perdite. Tuttavia, la robustezza della procedura assicura che imperfette instillazioni continuerà a fornire dati utili e risultati interpretabili.
Il grande vantaggio della nostra tecnica sopra l'unico metodo alternativo pubblicato di infezione della vescica maschile è il suo approccio non invasivo, non chirurgico. Il nostro approccio mediante instillazione transuretrale segue il percorso fisiologico attraverso l'uretra fino alla vescica, senza compromettere l'integrità strutturale dell'addome. La tecnica invasiva, descritta da Olson e colleghi20, comprende fattori inerenti alle procedure chirurgiche, quali infiammazione, guarigione ritardata e risultante tessuto cicatriziale. Particolarmente rilevante per quanto riguarda gli studi di risposta immunitaria all'infezione è la risposta dell'organismo al trauma chirurgico. Questo include la formazione di un ambiente pro-infiammatorie e potenziali granulazione dei tessuti, come pure un programma di guarigione ferita antinfiammatori come parte del processo di guarigione. Questi fattori rappresentano influenze indesiderate all'interno l'impostazione sperimentale.
Infine, l'obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un metodo che permette il confronto diretto delle risposte immunitarie maschile e femminile durante il corso di UTI, che può essere applicata per gli studi futuri affrontare l'influenza del sesso sulla malattia mucosa della vescica, quale l'infezione e la biologia del tumore. Come un vantaggio distinto secondo, il metodo descritto qui specchi utilizzati nei topi femmina per decenni19. Così, gli esperimenti condotti in topi maschi con questa tecnica sono paragonabili a un ampio corpo di ricerca esistente. I nostri esperimenti hanno rivelato che esistono differenze nella risposta e che queste differenze possono fornire gli indizi per comprendere le disparità basate sul sesso in risposta alle infezioni delle mucose, così come altre malattie della vescica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr Matthieu Rousseau per lettura critica del manoscritto e il laboratorio di immunologia-dendritiche per loro spunti utili durante lo sviluppo di questo progetto e protocollo. Questo lavoro è stato in parte sostenuto da finanziamenti dall'Unione europea settimo quadro programma Marie Curie azione (PCIG11-GA-2012-3221170 e la Immuno-oncologia LabEx (MAI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0.7 mm external diameter, 14 mM long | BD Medical | 381811 or 381411* | * catalog number is country-dependent |
| inoculating loop | Greiner Bio-One | 731171 | |
| LB Miller broth | Difco | 244620 | |
| LB Miller agar | Difco | 244520 | |
| Cuvettes | Bio-rad | 223-9955 | |
| syringes | B Braun | 9166017V | |
| Thumb (Adson) forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 5 ml tubes, polypropylene | Falcon | 352063 | |
| Tissue Ruptor disposable probes | Qiagen | 990890 | |
| 15 ml flip cap tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| DNAse | Invitrogen | 18047019 | |
| Liberase TM | Sigma-Aldrich | 5401119001 | should be aliquotted and stored at -20 °C to avoid repeated freeze-thaw |
| 100 µM MACS SmartStrainers | Miltenyi | 130-098-463 | compatible with 15 ml tubes, preferred |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352360 | compatible with 50 ml tubes, if MACS Smart Strainers are not available |
| 96 well plate | Falcon | 353077 | |
| Fc block | BD Pharmingen | 553142 | anti-CD16/CD32 |
| anti-mouse CD45 antibody | BD Biosciences | 561487 | many different fluorescent conjugation options are available |
| 5 ml tubes polystyrene with filter cap | Falcon | 352235 | |
| insulin syringe | Terumo | BS05M2913 | |
| hand held homogenizer | Qiagen | 9001272 | TissueRuptor |
| flow cytometer | BD Biosciences | N/A | Fortessa SORP |
| Flow cytometry software | BD Biosciences | N/A | Diva |
References
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