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Immunology and Infection

एक छोटे से जानवर के मॉडल में मूत्र पथ के संक्रमण: नर और मादा चूहों के Transurethral कैथीटेराइजेशन

Published: December 1, 2017 doi: 10.3791/54432
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Unité d’Immunobiologie des Cellules Dendritiques, Department of Immunology, Institut Pasteur, INSERM U818, 2Genentech

Summary

चूहों के transurethral कैथीटेराइजेशन के स्थापित मॉडल मूत्र पथ के संक्रमण सहित मूत्राशय विकृतियों के अध्ययन की अनुमति देता है, लेकिन केवल महिलाओं में किया जा सकता है । पुरुष transurethral जगाकर का एक नया मॉडल, यहां प्रस्तुत है, लिंगों के बीच मजबूत नैदानिक और महामारी विज्ञान के मतभेदों के द्वारा चिह्नित क्षेत्र में अनुसंधान सक्षम होगा ।

Abstract

मूत्र पथ के संक्रमण (यूटीआई) दुनिया भर में बहुत आम हैं, महत्वपूर्ण रुग्णता और स्वास्थ्य संबंधी खर्चों का खर्च । छोटे जानवर मॉडल है, जो सही रोग स्थापना और प्रगति को प्रतिबिंबित, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत और संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा की पीढ़ी के विच्छेदन की अनुमति । चूहों में, uropathogenic ई. कोलाईके intravesical जगाकर, समुदाय के ८५% से अधिक में प्रेरणा का एजेंट यूटीआई का अधिग्रहण किया, recapitulates संक्रमण के चरणों के कई मनुष्यों में मनाया । हाल ही में, हालांकि, यूटीआई केवल मादा जानवरों में मॉडलिंग की जा सकती है । इस सीमा ने यूटीआई में सेक्स संबंधी मतभेदों के अध्ययन में रुकावट डाली है, साथ ही अन्य मूत्राशय विकृतियों, जैसे कैंसर । यहां, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए पुरुष चूहों कि महिला और पुरुष जानवरों के बीच सीधी तुलना की अनुमति देता है और एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए एक बेहतर संक्रमण को मेजबान प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए एक साधन के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा मूत्राशय के ऊतकों का आकलन । साथ में, इन दृष्टिकोणों मेजबान कारकों की पहचान में सहायता करेगा कि यौन यूटीआई और अंय मूत्राशय से जुड़े रोगों में मनाया पक्षपात के लिए योगदान ।

Introduction

मूत्र पथ के संक्रमण (यूटीआई) विकसित देशों में सबसे आम संक्रमणों में से एक हैं1. संक्रमण की दर नवजात और बुजुर्गों के बीच महिलाओं और पुरुषों के बीच समान हैं2. रजोनिवृत्ति वयस्क महिलाओं, तथापि, समुदाय के एक बहुत वृद्धि हुई घटना-पुरुषों की तुलना में यूटीआई का अधिग्रहण किया2,3। यह देखते हुए कि इस रोग मुख्यतः महिलाओं पर प्रभाव डालता है, मौलिक और नैदानिक अनुसंधान भारी महिलाओं में यूटीआई पर ध्यान केंद्रित किया है । हालांकि, पुरुषों में यूटीआई एक महत्वपूर्ण और अध्ययन स्वास्थ्य देखभाल चैलेंज4है । वास्तव में, क्योंकि पुरुषों में यूटीआई उच्च रुग्णता के साथ जुड़े रहे हैं, इन संक्रमणों नियमित रूप से जटिल4,5के रूप में परिभाषित कर रहे हैं ।

शरीर विज्ञान और विकृति में सेक्स पूर्वाग्रहों के केंद्रीय भूमिका की हमारी समझ के रूप में विकसित, नए तरीकों रोग के इस पहले से उपेक्षित पहलू का पता लगाने के लिए आवश्यक हैं । सेक्स मतभेद उन्मुक्ति और संक्रमण में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं; महिलाओं को स्व-प्रतिरक्षित रोग के उच्च घटना है, जबकि पुरुषों और अधिक कुछ संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, जैसे तपेदिक, मलेरिया, और एचआईवी6,7. मूत्राशय कैंसर, एक और urologic विकृति विज्ञान, काफी अधिक महिलाओं की तुलना में पुरुषों में प्रचलित है, और कई अध्ययनों से द्रोह के विकास में एण्ड्रोजन के लिए एक भूमिका दिखाई है8,9,10,11 ,12. विशेष रूप से, हालांकि, मूत्राशय के कैंसर के लिए intravesical चिकित्सा की जांच महिला जानवरों में विशेष रूप से किया जाता है, के लिए असमर्थता के कारण बार catheterize पुरुष चूहों13.

यूटीआई रोगजनन का अध्ययन संक्रमण (उदा., चूहों और चूहों) के कुतर मॉडलों पर काफी निर्भर करता है । यूटीआई के Murine मॉडल मूल रूप से मानव संक्रमण, जैसे uropathogenic ई. कोलाई (UPEC), Klebsiella, Enterococcus, Staphylococcus, या प्राणी14से पृथक uropathogens को रोजगार दे सकते हैं । आमतौर पर, जीवाणु मूत्रमार्ग के कैथीटेराइजेशन के माध्यम से मूत्राशय में पेश कर रहे हैं । निम्नलिखित संक्रमण, मूत्राशय और गुर्दे बैक्टीरिया औपनिवेशीकरण, ऊतक क्षति, या मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में संक्रमण के विशिष्ट मापदंडों का आकलन करने के लिए हटाया जा सकता है15,16. सार्वभौमिक, तथापि, यूटीआई अनुसंधान के लिए केवल मादा जानवरों का उपयोग किया जाता है । वास्तव में, कई अध्ययनों से उल्लेख किया है कि, संरचनात्मक कारणों के कारण, पुरुष चूहों की कैथीटेराइजेशन संभव नहीं है13,17,18,19. हाल ही में, पुरुष जगाकर के लिए एक शल्य दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है, जिसमें पेट खोला है, मूत्राशय बाहरी पेट में खोलने के लिए कोमल दबाव लागू करने से विस्थापित है, और बैक्टीरिया20मूत्राशय में इंजेक्ट कर रहे हैं । यह दृष्टिकोण शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप की कीमत पर, पुरुष संक्रमण सक्षम बनाता है । इस प्रकार, इस दृष्टिकोण की एक प्रमुख चेतावनी सूजन के प्रभाव में शामिल है, संक्रमण के परिणाम पर इस तरह की क्षमता के रूप में एक विरोधी भड़काऊ घाव-चीरा21के लिए हीलिंग प्रतिक्रिया पैदा करने के लिए. के रूप में हमारी रुचियों रोग के जवाब में सेक्स पूर्वाग्रह समझ में शामिल हैं, हम पुरुष चूहों में बैक्टीरियल intravesical जगाकर की एक विधि विकसित की है कि अधिक बारीकी से लंबे समय से स्थापित गैर सर्जिकल transurethral दृष्टिकोण मादा कुतर में इस्तेमाल किया22 .

हमारे मॉडल एक स्थापित पद्धति पर बनाता है और सीधे महिला और पुरुष जानवरों में यूटीआई के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की तुलना करने की क्षमता प्रदान करता है । इस विधि सेक्स के विच्छेदन-संक्रमण में अंतर आधारित की अनुमति है, और संभावित संवेदनशीलता और लिंग के बीच संक्रमण के जवाब में स्पष्ट मतभेद के लिए आणविक और सेलुलर सुराग की पेशकश करेगा । इसके अतिरिक्त, इस मॉडल यूटीआई अध्ययन से परे मूल्य है, मॉडल की स्थापना के लिए अंय मूत्राशय से संबंधित रोगों, जैसे मूत्राशय कैंसर, prostatitis, के तहत या अधिक सक्रिय मूत्राशय सिंड्रोम, और मध्यवर्ती cystitis की जांच की अनुमति ।

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Protocol

माउस प्रयोगों Comité d'éthique en expérimentation एनिमल्स पेरिस केंद्र एट सूद द्वारा प्रोटोकॉल संख्या 2012-0024 के अनुमोदन के अनुसार आयोजित किया गया (पशु प्रयोग के लिए आचार समिति), यूरोपीय निर्देश के आवेदन में 2010/63 संघ.

1. कैथेटर की तैयारी

  1. संक्रमित होने के लिए चूहों के प्रत्येक समूह के लिए एक बाल चिकित्सा नसों का उपयोग प्रवेशनी तैयार करें । इनबिल्ट स्प्रिंग तंत्र का उपयोग करते हुए, अपने सुई के प्रत्येक प्रवेशनी अपहरण, के रूप में निर्माता द्वारा निर्देश दिया । सुई त्यागें, केवल प्लास्टिक नसों प्रवेशनी के संरक्षण ।
  2. एक लामिना प्रवाह हूड में एक पराबैंगनी (U.V.) चक्र, आमतौर पर 25-30 मिनट के लिए कैथेटर निष्फल ।
    नोट: कैथेटर्स एक से अधिक माउस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एक नया कैथेटर प्रयोगात्मक समूहों, लिंगों, या जीवाणु उपभेदों के बीच इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

2. संक्रमण के लिए Uropathogenic ई. कोलाई की तैयारी

  1. संक्रमण से कम दो दिन पहले, एक बाँझ टीका पाश का उपयोग कर, एक Luria शोरबा (पौंड) आगर प्लेट पर एक जमे हुए जीवाणु शेयर से UPEC लकीर, एंटीबायोटिक दवाओं युक्त अगर उचित. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर मशीन । प्लेटें एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. एक १०० मिलीलीटर बाँझ Erlenmeyer कुप्पी में, लगाना 10 मिलीलीटर पौंड, एंटीबायोटिक दवाओं युक्त अगर उपयुक्त, पौंड प्लेट और ३७ डिग्री सेल्सियस रात भर में खड़े मशीन से एक एकल कॉलोनी के साथ (लगभग 16-18 hr).
    नोट: स्थाई संस्कृतियों प्रकार की अभिव्यक्ति की अनुमति 1 पिली, जो संक्रमण के लिए आवश्यक है23। संस्कृतियों मिलाते हुए कम कुशल पिली अभिव्यक्ति होगा, और इसलिए, संक्रमण की असंगत दरों ।
  3. रात की संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो)६०० को मापने और एक पूर्व निर्धारित वृद्धि वक्र का उपयोग कर मिलीलीटर प्रति बैक्टीरिया की संख्या की गणना । एक उदाहरण के रूप में, UPEC तनाव UTI89 के लिए, आयुध डिपो६०० = ०.३५ प्रति मिलीलीटर 2 x 108 CFU के बराबर है, इस प्रकार, एक आयुध डिपो के साथ एक रात भर संस्कृति६०० = २.४ १३.७ x 10 के बराबर होगा8 CFU प्रति मिलीलीटर । Empirically के बीच संबंध निर्धारित करें आयुध डिपो६०० और हर नए संक्रमण के लिए कार्यरत तनाव के साथ व्यवहार्य बैक्टीरिया ।
  4. पशुओं की संख्या को ध्यान में रखते हुए संक्रमित होने के लिए आवश्यक बैक्टीरिया की मात्रा का निर्धारण और प्रत्येक माउस ५० μl पंजाब में लगभग 107 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) प्राप्त करना चाहिए । गणना में शामिल ~ १३० µ कैथेटर और सिरिंज पिंड और १०० µ एल के मृत मात्रा इनोक्युलम निर्धारित करने के लिए आवश्यक.
    1. 1 मिनट के लिए १७,००० x g पर एक तालिका के microcentrifuge में बैक्टीरियल सस्पेंशन स्पिन और 2 x पर जिसके परिणामस्वरूप बैक्टीरियल गोली reसस्पेंड 108 CFU प्रति एमएल पंजाब में । प्रश्नपत्र इस निलंबन और प्लेट के पौंड आगर पर एक aliquot पतला, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ यदि उपयुक्त हो, प्रत्येक संक्रमण के लिए सटीक इनोक्युलम निर्धारित करने के लिए ।
  5. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में बैक्टीरियल इनोक्युलम ड्रा और सिरिंज के अंत करने के लिए कैथेटर देते हैं । किसी भी हवा को दूर करने के लिए सिरिंज को टैप करें और सवार को जगाकर शुरुआत से पहले कैथेटर में डेड एयर स्पेस को भरने के लिए दबाना ।

3. चूहों की तैयारी

  1. Anesthetize चूहों के माध्यम से intraperitoneal इंजेक्शन १०० मिलीग्राम/किलो ketamine और 5 मिलीग्राम/xylazine । पूरक गर्मी प्रदान की जा सकती है ।
  2. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक माउस मध्यम दबाव के साथ footpad निचोड़ द्वारा पूरी तरह से बेहोश है । चूहों पूरी तरह से बेहोश कर रहे है जब वे प्रतिक्रिया नहीं है और इस राज्य तक पहुंचने के लिए 3-5 मिनट की आवश्यकता है ।
  3. जगह चूहों लापरवाह और मूत्र के मूत्राशय को खाली करने के लिए निचले पेट के लिए मध्यम दबाव लागू होते हैं । पूर्ण मूत्राशय ileac शिखाओं के बीच त्वचा के नीचे एक मटर की तरह लग रहा है ।
    नोट: सांस isoflurane catheterize महिला चूहों के लिए इस्तेमाल किया गया है15,22, तथापि, यह परीक्षण नहीं किया गया है कि पुरुष चूहों पर्याप्त इस प्रक्रिया के लिए साँस isoflurane द्वारा anesthetized हैं.

4. मादा चूहों का Transurethral जगाकर

  1. गैर प्रमुख हाथ का उपयोग करना, पूंछ और माउस के पेट पर एक ही हाथ की एक उंगली पर अंगूठे जगह और दिशाओं का विरोध करने के लिए जगह में दृढ़ता से माउस पकड़ में कोमल दबाव लागू होते हैं ।
  2. मूत्रमार्ग छिद्र पर माउस को सीधा कैथेटर की नोक रखें । यह काम सतह के समानांतर है, जबकि एक साथ सिरिंज को कम करने, जबकि कोमल दबाव के साथ, मूत्रमार्ग में कैथेटर स्लाइड, जब तक हब मूत्रमार्ग छिद्र मिलता है । कैथेटर कोई स्नेहन की आवश्यकता है । पुश या मूत्रमार्ग में कैथेटर बल नहीं है । कैथेटर सुचारू रूप से और आसानी से मूत्रमार्ग में, कोई प्रतिरोध करने के लिए थोड़ा के साथ स्लाइड चाहिए ।
    1. इनोक्युलम (चरण ४.३) जगाकर पहले, एक बार कैथेटर जगह में है, बहुत धीरे गैर से उंगली के साथ माउस के सिर की ओर उदर त्वचा खींच-प्रमुख हाथ है कि माउस के पेट पर पहले से ही है (४.१ कदम) । यदि कैथेटर मूत्रमार्ग में है, मूत्रमार्ग छिद्र रचना ऊतक कदम नहीं होगा, जबकि अगर कैथेटर योनि में गलत तरीके से रखा गया है, ऊतक ऊपर और कैथेटर से दूर ले जाएगा । यह तेजी से परीक्षण प्रत्येक माउस पर किया जाना चाहिए ।
  3. जब कैथेटर का हब मूत्रमार्ग छिद्र से मिलता है, धीरे बैक्टीरियल इनोक्युलम के ५० µ एल बांटना । एक धीमी गति से जगाकर दर गुर्दे में vesicoureteral भाटा को कम करता है । धीरे से रिसाव को रोकने के लिए कैथेटर को हटाने, 5 की गिनती पर. अपने पिंजरे में चूहों को एक लापरवाह स्थिति में रखें ।

5. पुरुष चूहों का Transurethral जगाकर

  1. दो अँगूठे संदंश के कपाल और caudally को माउस के बाहरी जननांग पर रखें. पूरी तरह से मुंड लिंग को बेनकाब करने के लिए चमड़ी वापस लेना । एक बार लिंग बाहरी रूप से तैनात है, अंगूठे संदंश जारी ।
  2. संदंश स्थिति जानवर को सीधा फैला लिंग को स्थिर करने के लिए, धीरे लेकिन tautly अंग धारण । मूत्रमार्ग कुहर कल्पना और ध्यान से अंग की नोक पर छोटे खोलने में कैथेटर परिचय । धीरे से लिंग में कैथेटर गाइड, माउस के शरीर की ओर, संदंश के साथ कोमल तनाव को बनाए रखने । कैथेटर कोई स्नेहन की आवश्यकता है । कैथेटर लिंग में मजबूर मत करो; कैथेटर मूत्रमार्ग में सुचारू रूप से स्लाइड, सही प्लेसमेंट का संकेत चाहिए ।
  3. एक बार कैथेटर का हब शिश्न की नोक से मिलता है, बहुत धीरे इनोक्युलम के ५० µ एल तिरस्कृत, जबकि लिंग की स्थिति को बनाए रखने. एक पूर्व निर्धारित जगाकर गुणवत्ता स्कोर, जैसे कि चित्र 2में दिखाए गए के अनुसार इस समय को जगाकर की गुणवत्ता पर ध्यान दिया जा सकता है ।
  4. कैथेटर धीरे से वापस लेना, 5 की गिनती पर, इनोक्युलम के रिसाव को रोकने के लिए. अपने पिंजरे में चूहों को एक लापरवाह स्थिति में रखें । पशुओं के लिए 30-45 संवेदनाहारी के प्रशासन के बाद मिन ठीक शुरू कर देना चाहिए ।

6. संक्रमित अंगों में CFU का निर्धारण

  1. पूर्व निर्धारित समय-अंक में, बलिदान चूहों अनुमोदित मानक संचालन प्रक्रियाओं का उपयोग (उदा, ग्रीवा विस्थापन या कार्बन डाइऑक्साइड ओवरडोज) । ७०% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से पेट गीला करने के लिए फर से संदूषण को कम करने के लिए ।
  2. कैंची और aseptically का उपयोग कम 2 सेमी की माउस के पेट के निचले तीसरे पार एक चीरा बनाओ मूत्राशय और किसी भी अन्य वांछित अंगों को हटाने, सहित, लेकिन सीमित करने के लिए नहीं, गुर्दे, वृषण, लाभदायक बुलबुले, या preputial ग्रंथियों, में 5 मिलीलीटर के लिए स्नैप कैप ट्यूब युक्त 1 मिलीलीटर बाँझ पंजाबियों. सभी नमूनों को बर्फ पर रखें ।
  3. Homogenize एक handheld homogenizer के साथ अंगों जब तक लगभग कोई ठोस ऊतक रहता है, लगभग 15-60 sec अंग पर निर्भर करता है । वसा अच्छी तरह से homogenize नहीं है, और चमकदार बेज रंग सफेद ऊतक के रूप में आसानी से पहचानने योग्य है । homogenization से पहले या बाद में फैट छोड़ें । प्रत्येक प्रयोगात्मक या अंग समूह के बीच पंजाब के बाद इथेनॉल में homogenizer धो लें ।
    नोट: आमतौर पर, handheld homogenizers या मनका मिल homogenizers का उपयोग करें । जबकि इन प्रणालियों के सभी समान परिणाम प्राप्त हुआ है, के रूप में 24 hr के बाद संक्रमण में बैक्टीरियल CFU की प्रत्यक्ष तुलना द्वारा निर्धारित, बैक्टीरियल व्यवहार्यता के संरक्षण जबकि homogenize मेजबान ऊतक के लिए इष्टतम शर्तों empirically निर्धारित किया जाना चाहिए पहले यह प्रोटोकॉल नियमित रूप से प्रदर्शन कर रहा है ।
  4. homogenized अंग सस्पेंशन के धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन । प्लेट पौंड आगर प्लेट पर कमजोर पड़ने, एंटीबायोटिक दवाओं युक्त जब उचित है, और रात भर की मशीन (~ 15 hr) ३७ डिग्री सेल्सियस पर । UPEC उपभेदों बहुत तेजी से दोहरीकरण बार है और इस तरह के रूप में, देखभाल के लिए भी लंबे समय प्लेटों मशीन नहीं लिया जाना चाहिए, क्योंकि यह व्यक्तिगत कालोनियों गिनती करने की क्षमता में बाधा होगी ।

7. मूत्राशय के ऊतकों का प्रवाह Cytometric विश्लेषण

  1. ३४ इकाइयों पर collagenase युक्त पाचन बफर तैयार करें/एमएल और DNase में १०० µ g/एमएल, पंजाब में । बर्फ पर रखो । तैयार १ १५ एमएल शंकु ट्यूब प्रति पशु विश्लेषण किया जा करने के लिए और ट्यूब प्रति 1 मिलीलीटर पाचन बफर aliquot ।
  2. पूर्व निर्धारित timepoints पर, बलिदान चूहों अनुमोदित मानक संचालन प्रक्रियाओं का उपयोग (जैसे, ग्रीवा विस्थापन या कार्बन डाइऑक्साइड अधिक मात्रा) । ७०% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से पेट गीला करने के लिए फर से संदूषण को कम करने के लिए ।
  3. कैंची का उपयोग कम 2 सेमी की है माउस पेट के निचले तीसरे भर में एक चीरा बनाओ और पूरे मूत्राशय को हटा दें । कैंची के साथ अच्छी तरह से कीमा, 2-3mm 2 आकार के टुकड़ों में मूत्राशय काटने, आमतौर पर के बारे में 8 टुकड़े ।
    1. पाचन बफर युक्त ट्यूब प्रति एक कीमा बनाया हुआ मूत्राशय जोड़ें । के लिए पाचन बफर में कीमा बनाया हुआ मूत्राशय ऊतक धोने शेक । बर्फ पर रखें जब तक सभी मूत्राशय और विच्छेदित कर रहे हैं ।
  4. ६०-७५ मिनट में ३७ ° c के लिए, 5 एस हर 15 मिनट के लिए हाथ से जोरदार मिलाते के साथ की मशीन भरती मूत्राशय । जब ऊतक एक गिलास पारदर्शी उपस्थिति है, गीले टिशू पेपर जैसी, पाचन पूरा हो गया है । लंबे समय तक पाचन पहचान के लिए आवश्यक कोशिकाओं से सतह प्रोटीन को दूर करेगा और बचा जाना चाहिए ।
  5. बर्फ शीत प्रवाह cytometry बफर के 2-3 मिलीलीटर जोड़कर पाचन एंजाइमों को निष्क्रिय (2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और ०.२ mM EDTA युक्त पंजाब) और धीरे मिश्रण । बर्फ पर ट्यूबों प्लेस ।
  6. एक सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए और किसी भी संयोजी ऊतक को हटाने के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में रखा १०० µm फिल्टर के माध्यम से ट्यूब की सामग्री को पारित । धीरे एक सिरिंज सवार के अंत के साथ फिल्टर के माध्यम से किसी भी शेष ऊतक दबाएँ. एक अतिरिक्त 2 मिलीलीटर प्रवाह cytometry बफर के साथ फिल्टर धो लो । बर्फ पर नमूने रखें ।
  7. २०० x g, 4 ° c पर 7 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा नमूनों को धो लें । १०० में छर्रों reसस्पेंड µ l प्रवाह cytometry बफर युक्त एफसी ब्लॉक, 5 µ जी के लिए पतला/एमएल और एक ९६-अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट को हस्तांतरण । 10-15 मिनट के बाद, प्रत्येक नमूने के लिए १०० µ l वांछित एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें । 30-45 मिनट के लिए, बर्फ पर, प्रकाश से रक्षा की मशीन नमूने ।
    नोट: एफसी ब्लॉक एक एजेंट को एफसी रिसेप्टर्स एक्सप्रेस कोशिकाओं को एंटीबॉडी के एफसी भाग के बंधन को रोकने के लिए इस्तेमाल किया है । इसका उद्देश्य विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को कम करना है । उपयोग करने के लिए एंटीबॉडी का निर्धारण प्रयोग में परीक्षण किया जा रहा परिकल्पना पर निर्भर करेगा और साहित्य से इनपुट के साथ चयन किया जाना चाहिए । चित्रा 3में, समग्र प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ को मापने के लिए, एक विरोधी CD45 एंटीबॉडी कार्यरत था, जो एक पान प्रतिरक्षा सेल प्रोटीन है ।
  8. २०० x g, 4 ° c पर 7 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा नमूनों को धो लें । २०० µ l प्रवाह cytometry बफर में सेल छर्रों reसस्पेंड और बस एक प्रवाह cytometer पर अधिग्रहण करने से पहले एक 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब पर एक ४० µm सेल छलनी के माध्यम से नमूने पास ।
  9. फ्लो cytometer पर पूरा नमूना लीजिए । एक अच्छा पाचन २००,०००-४००,००० कोशिकाओं निकलेगा, ८,०००-१०,००० CD45 के साथ+ भोले माउस मूत्राशय से प्रतिरक्षा कोशिकाओं, जबकि संक्रमित अंगों अधिक कोशिकाओं16 (चित्रा 3) शामिल होंगे.
    नोट: प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए तैयार नमूनों का मूल्यांकन CFU के लिए नहीं किया जा सकता. यह दो भागों में मूत्राशय विभाजित करने के लिए अनुशंसित नहीं है के रूप में कोई सबूत नहीं है कि UPEC औपनिवेशीकरण या प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ ऊतक भर में एक समान है प्रदर्शित करने के लिए मौजूद है ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के विकास में, महिला और पुरुष C57Bl के साथियों 6 से 8 सप्ताह की आयु वर्ग के 6 चूहों, और बैक्टीरियल बोझ मूत्राशय में समय 1 hr से 30 दिनों से लेकर अंक में मूल्यांकन किया गया । इन अध्ययनों से परिणाम कहीं विस्तृत रहे है (Zychlinsky Scharff एट अल., लंबित) । यहां, हम 24 मानव संसाधन संक्रमण से प्रतिनिधि डेटा प्रस्तुत करते हैं । विशेष रूप से, बैक्टीरियल बोझ पुरुष और महिला चूहों के बीच 24 घंटा बाद संक्रमण (चित्रा 1) में बराबर था. बैक्टीरियल बोझ में थोड़ा भिन्नता प्रत्येक समूह के भीतर मनाया गया था 24 hr के बाद संक्रमण, क्या महिला चूहों में बताया गया है15,16.

यदि ध्यान संक्रमण से पहले मूत्र की पर्याप्त खाली मूत्राशय के लिए लिया जाता है, इनोक्युलम के महत्वपूर्ण रिसाव शायद ही कभी मादा चूहों में मनाया जाता है । हालांकि, पुरुष चूहों में जगाकर, विशेष रूप से इस प्रोटोकॉल के विकास के चरण के दौरान, मूत्रमार्ग से बैक्टीरियल इनोक्युलम लीक की महत्वपूर्ण मात्रा में हुई । यह निर्धारित करने के लिए कि संक्रमण के समय इनोक्युलम की हानि औपनिवेशीकरण या संक्रमण की स्थापना पर प्रभाव डालती है, हम प्रत्येक जगाकर के लिए एक रेटिंग प्रणाली नियोजित करते हैं । प्रत्येक जगाकर 1-5 के पैमाने पर बनाए गए थे, 1 के साथ सबसे इष्टतम जा रहा है, और बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण 24 घंटा बाद संक्रमण(चित्रा 2, बॉक्स) निर्धारित किया गया था । हालांकि इस प्रणाली के जांचकर्ता निर्भर था, और इसलिए, संभावित व्यक्तिपरक, इस अध्ययन के प्राथमिक लेखक निर्धारित सभी स्कोर तुरंत जगाकर निंनलिखित, संक्रमित मूत्राशय में बैक्टीरियल बोझ के मूल्यांकन से पहले । कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद अलग जगाकर स्कोर के साथ पशुओं से प्राप्त CFU के बीच अस्तित्व में, के रूप में एक nonparametric Kruskal-वालिस परीक्षण हर दूसरे कॉलम (पी = ०.१७) का मतलब रैंक के साथ प्रत्येक स्तंभ का मतलब रैंक की तुलना द्वारा मूल्यांकन और एक डन परीक्षण का उपयोग कर कई तुलना के लिए सुधार । इस विश्लेषण से, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि उपइष्टतम जगाती (स्कोर > 3), संक्रमण के दौरान बैक्टीरियल इनोक्युलम के पर्याप्त रिसाव में जिसके परिणामस्वरूप, काफी जीवाणु औपनिवेशीकरण प्रभाव नहीं 24 hr (चित्रा 2, ग्राफ). विशेष रूप से, अनुभव के साथ, पुरुष चूहों में लीक की आवृत्ति काफी कम.

अंत में, इस मॉडल को विकसित करने में उद्देश्य सीधे महिला और पुरुष जानवरों में UPEC प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की तुलना करने के लिए किया गया था । यह परीक्षण करने के लिए कि क्या यूटीआई के जवाब में लिंगों के बीच सेलुलर घुसपैठ को बदला गया है, स्त्री और पुरुष चूहों के भोले और संक्रमित साथियों में CD45+ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या का आकलन प्रवाह cytometry द्वारा किया गया । जबकि भोली जानवरों में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या महिला और पुरुष चूहों (पी = ०.९५) के बीच अलग नहीं था, वहां घुसपैठ में संक्रमित मादा चूहों (पी = ०.००१५) (चित्र 3 बी) के मूत्राशय में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थी ।

Figure 1
चित्र 1: UPEC कवक स्त्री और पुरुष मूत्राशय समान कुशलता के साथ । छह से 8 सप्ताह पुराने महिला और पुरुष C57Bl/6 चूहों UPEC के 107 CFU के साथ जगाकर थे । 24 hr के बाद संक्रमण, मूत्राशय बैक्टीरिया का बोझ गणना करने के लिए aseptically हटाया गया । भूखंड CFU/मूत्राशय को दर्शाया गया है । प्रत्येक डॉट एक माउस, 5 के प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: जगाकर की गुणवत्ता में 24 hr के बाद संक्रमण बैक्टीरियल बोझ के साथ सहसंबंधी नहीं है । छह से 8 सप्ताह पुराने महिला और पुरुष C57Bl/6 चूहों UPEC के 107 CFU के साथ जगाकर थे । प्रत्येक जगाकर के तुरंत बाद, एक शोधकर्ता को जगाकर एक गुणवत्ता स्कोर सौंपा, जैसा कि विशिष्ट मानदंडों (बॉक्सिंग टेक्स्ट) द्वारा परिभाषित किया गया है । 24 hr के बाद संक्रमण, मूत्राशय बैक्टीरिया का बोझ गणना करने के लिए aseptically हटाया गया । भूखंड आवंटित गुणवत्ता स्कोर बनाम CFU/ प्रत्येक डॉट एक माउस है, 5 परित प्रयोग दिखाए जाते हैं । p = ०.१७, Kruskal-वालिस परीक्षण एकाधिक तुलना के लिए पोस्ट हॉक डन के परीक्षण के साथ हर दूसरे कॉलम का मतलब रैंक के साथ प्रत्येक कॉलम के मतलब रैंक की तुलना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: यूटीआई के जवाब में मादा चूहों में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ बढ़ जाती है. छह से 8 सप्ताह पुराने महिला और पुरुष C57Bl/6 चूहों UPEC के 107 CFU के साथ या नहीं जगाकर थे । प्रतिनिधि डॉट भूखंडों CD45+ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ कुल मूत्राशय कोशिकाओं को चित्रित भोली या संक्रमित चूहों से गुलाबी में gated । ग्राफ CD45 की निरपेक्ष संख्या से पता चलता है+ भोले या 24 मानव संसाधन संक्रमित चूहों से मूत्राशय में प्रतिरक्षा कोशिकाओं. प्रत्येक डॉट एक माउस है, 2 परित प्रयोग दिखाए जाते हैं । मान-Whitney परीक्षण द्वारा निर्धारित पी-मान. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

पुरुष चूहों के Transurethral जगाकर मूत्राशय श्लैष्मिक रोग पर सेक्स के प्रभाव में कई नए अनुसंधान के अवसर प्रदान करता है, लेकिन यह भी कई चुनौतियों का प्रस्तुत करता है । सबसे महत्वपूर्ण, एक सीमा है कि जगाकर शुरू में तकनीकी रूप से कठिन साबित हो सकता है, कैथेटर प्रविष्टि के दौरान अत्यधिक सूजन में जिसके परिणामस्वरूप । तकनीक में सुधार ऐसे इवांस ब्लू डाई के रूप में एक रंग का समाधान के साथ मृत चूहों के जगाकर द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । कि जगाकर सफल होता है की पुष्टि करने के लिए, मूत्राशय नेत्रहीन निरीक्षण किया जाना चाहिए और एक ट्यूबरकुलिन सिरिंज के साथ निष्कर्षण द्वारा जगाकर तरल की मात्रा का मूल्यांकन किया जा सकता है । धीमी गति से, कोमल आंदोलनों का महत्व नहीं किया जा सकता है: कोई प्रतिरोध होना चाहिए और कोई बल कैथेटर डालने के लिए इस्तेमाल किया, के रूप में यह अतिरिक्त सूजन और ऊतक नुकसान में परिणाम होगा । जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, कैथेटर सहजता से मूत्रमार्ग में स्लाइड होगा । प्रतिरोध या रुकावट महसूस किया जाता है, तो यह कैथेटर को दूर करने और सम्मिलन का प्रयास करने के लिए सबसे अच्छा है ।

बैक्टीरियल बोझ 24 hr बाद संक्रमण करने के लिए जगाकर की गुणवत्ता correlating द्वारा, हम प्रदर्शन किया है कि एक अपूर्ण तकनीक, जिसमें जीवाणु इनोक्युलम की एक छोटी राशि संक्रमण के समय खो दिया है, अभी भी के मजबूत औपनिवेशीकरण में परिणाम मूत्राशय. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने में, एक अंवेषक को रिसाव मुक्त जगाती प्राप्त करने के उद्देश्य चाहिए । हालांकि, प्रक्रिया की मजबूती सुनिश्चित करता है कि अपूर्ण जगाती अभी भी उपयोगी डेटा और व्याख्यात्मक परिणाम प्रदान करेगा ।

पुरुष मूत्राशय संक्रमण के केवल प्रकाशित वैकल्पिक पद्धति पर हमारी तकनीक के महान लाभ अपने गैर इनवेसिव, गैर शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण है । transurethral का उपयोग कर हमारे दृष्टिकोण मूत्राशय के लिए मूत्रमार्ग के माध्यम से शारीरिक मार्ग, पेट की संरचनात्मक अखंडता को बाधित करने के बिना इस प्रकार है । इनवेसिव तकनीक, ओल्सन और सहकर्मियों द्वारा वर्णित20, सूजन सहित शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए निहित कारकों, विलंबित चिकित्सा, और परिणामी निशान ऊतक भी शामिल है । संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन के संबंध में विशेष रूप से प्रासंगिक शल्य आघात के लिए जीव की प्रतिक्रिया है । यह एक समर्थक भड़काऊ वातावरण और संभावित ऊतक दानेदार, साथ ही चिकित्सा की प्रक्रिया के भाग के रूप में एक विरोधी भड़काऊ घाव हीलिंग कार्यक्रम के गठन में शामिल हैं । इन कारकों प्रयोगात्मक सेटिंग के भीतर अवांछनीय प्रभावों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

अंत में, इस अध्ययन का उद्देश्य एक तरीका है कि यूटीआई के दौरान पुरुष और महिला प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति देता है विकसित किया गया था, जो भविष्य में मूत्राशय श्लैष्मिक रोग पर सेक्स के प्रभाव को संबोधित अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, ऐसे संक्रमण के रूप में और कैंसर जीव विज्ञान । एक दूसरा अलग लाभ के रूप में, विधि यहां वर्णित दर्पण है कि दशकों के लिए महिला चूहों में इस्तेमाल किया19। इस प्रकार, इस तकनीक के साथ पुरुष चूहों में प्रदर्शन प्रयोगों मौजूदा अनुसंधान के एक व्यापक शरीर के लिए तुलनीय हैं. हमारे प्रयोगों से पता चला है कि प्रतिक्रिया में मतभेद मौजूद है और इन मतभेदों को श्लैष्मिक संक्रमण के जवाब में सेक्स आधारित असमानताओं को समझने के लिए सुराग प्रदान कर सकते हैं, साथ ही मूत्राशय के अंय रोगों ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि और इस प्रोटोकॉल और परियोजना के विकास के दौरान उनके उपयोगी अंतर्दृष्टि के लिए वृक्ष Immunobiology की प्रयोगशाला के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ Matthieu रूसो धंयवाद । इस काम के हिस्से में यूरोपीय संघ के सातवें ढांचे के कार्यक्रम मैरी क्यूरी कार्रवाई (PCIG11-GA-2012-3221170, और bliss-ऑन्कोलॉजी LabEx (माई) से धन द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0.7 mm external diameter, 14 mM long BD Medical 381811 or 381411* * catalog number is country-dependent
inoculating loop Greiner Bio-One 731171
LB Miller broth Difco 244620
LB Miller agar Difco 244520
Cuvettes Bio-rad 223-9955
syringes B Braun 9166017V
Thumb (Adson) forceps Fine Science Tools 11006-12
5 ml tubes, polypropylene Falcon 352063
Tissue Ruptor disposable probes Qiagen 990890
15 ml flip cap tubes Thermo Scientific 362694
DNAse Invitrogen 18047019
Liberase TM Sigma-Aldrich 5401119001 should be aliquotted and stored at -20 °C to avoid repeated freeze-thaw
100 µM MACS SmartStrainers  Miltenyi 130-098-463 compatible with 15 ml tubes, preferred
100 µm cell strainers  Falcon 352360 compatible with 50 ml tubes, if MACS Smart Strainers are not available
96 well plate Falcon 353077
Fc block BD Pharmingen 553142 anti-CD16/CD32
anti-mouse CD45 antibody BD Biosciences 561487 many different fluorescent conjugation options are available
5 ml tubes polystyrene with filter cap Falcon 352235
insulin syringe Terumo BS05M2913
hand held homogenizer Qiagen 9001272 TissueRuptor
flow cytometer BD Biosciences N/A Fortessa SORP 
Flow cytometry software BD Biosciences N/A Diva

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References

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एक छोटे से जानवर के मॉडल में मूत्र पथ के संक्रमण: नर और मादा चूहों के Transurethral कैथीटेराइजेशन
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Zychlinsky Scharff, A., Albert, M.… More

Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice. J. Vis. Exp. (130), e54432, doi:10.3791/54432 (2017).

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