Summary
Le modèle établi de cathétérisme transuréthrale de la souris permet l’étude des pathologies de la vessie, y compris les infections urinaires, mais ne peut être effectué chez les femelles. Un nouveau modèle de mâle instillation transurétrale, présenté ici, permettra des recherches dans une région marquée par fortes différences cliniques et épidémiologiques entre les sexes.
Abstract
Infections des voies urinaires (IVU) sont extrêmement répandues dans le monde entier, encourir une morbidité significative et des dépenses associées aux soins. Petits modèles animaux, qui reflètent la progression et l’établissement de la maladie, permettent la dissection des interactions hôte-pathogène et génération d’immunité aux infections. Chez la souris, l’instillation intravésicale des uropathogènes e. coli, l’agent causal dans plus de 85 % de la communauté acquis UTI, reprend bon nombre des étapes de l’infection chez les humains. Jusqu'à récemment, toutefois, UTI pourrait seulement être modélisé chez les femelles. Cette limitation a freiné l’étude des différences liées au sexe dans l’infection urinaire, mais aussi des autres pathologies de la vessie, comme le cancer. Nous décrivons ici une méthode pour inculquer des souris mâles qui permet une comparaison directe entre mâles et femelles animaux et fournir un protocole détaillé afin d’évaluer le tissu de la vessie par cytométrie en flux comme un moyen de mieux comprendre les réactions de l’hôte à l’infection. Ensemble, ces approches facilitera l’identification des facteurs de l’hôte qui contribuent à des biais de sexe observées dans l’infection urinaire et d’autres maladies associées à la vessie.
Introduction
Infections des voies urinaires (IVU) sont l’une des infections plus courantes dans les pays développés,1. Les taux d’infection sont similaires entre les femmes et les hommes chez les nouveau-nés et les personnes âgées2. Premenopausal femmes adultes, cependant, ont une incidence beaucoup plue d’UTI extra-hospitalière par rapport aux hommes2,3. Étant donné que cette maladie produit des effets principalement femmes, recherche fondamentale et clinique vise une écrasante majorité le UTI chez les femelles. Toutefois, l’infection urinaire chez les hommes est un défi de santé importants et sous-étudié4. En effet, infection urinaire chez les hommes sont associés à une morbidité plus élevée, ces infections sont habituellement définies sous la forme compliquée4,5.
À mesure que notre compréhension du rôle central des biais de sexe dans la physiologie et la pathologie évolue, nouvelles méthodes sont nécessaires pour explorer cet aspect précédemment négligé de la maladie. Différences entre les sexes jouent un rôle essentiel dans l’immunité et infection ; les femelles ont une incidence plus élevée d’une maladie auto-immune, tandis que les mâles sont plus sensibles à certaines infections, telles que la tuberculose, le paludisme et le VIH6,7. Cancer de la vessie, une autre pathologie urologique, est significativement plus fréquent chez les hommes que chez les femmes, et plusieurs études ont montré un rôle des androgènes dans le développement d’une tumeur maligne8,9,10,11 ,,12. Notamment, toutefois, l’enquête de thérapies intravésicale pour cancer de la vessie est effectuée exclusivement chez les femelles, en raison de l’incapacité de section à plusieurs reprises des souris mâles13.
L’étude de la pathogenèse de l’infection urinaire s’appuie fortement sur les modèles de rongeurs d’infection (par exemple, les souris et rats). Les modèles murins d’infection urinaire peuvent employer uropathogènes isolé à l’origine d’infections humaines, comme uropathogènes e. coli (UPEC), Klebsiella, Enterococcus, Staphylococcus, Proteusou14. En général, les bactéries sont introduits dans la vessie par cathétérisme de l’urètre. Suite à une infection, des vessies et des reins peut être enlevée pour évaluer les paramètres spécifiques de l’infection, tels que la colonisation bactérienne, des lésions tissulaires ou hôte réponse immunitaire15,16. Universellement, cependant, seulement les animaux femelles sont utilisés pour la recherche de l’UTI. En effet, plusieurs études ont noté que, pour des raisons anatomiques, cathétérisme des souris mâles n’est pas possible de13,17,18,19. Plus récemment, une approche chirurgicale à l’instillation mâle a été décrit, dans laquelle l’abdomen est ouvert, la vessie est déplacée à l’extérieur en appliquant une légère pression à l’ouverture dans l’abdomen et bactéries sont injectées dans la vessie de20. Cette approche permet l’infection masculine, au prix d’une intervention chirurgicale. Ainsi, un bémol majeur de cette approche comprend l’influence de l’inflammation, sur l’issue de l’infection, tels que le potentiel de provoquer une réponse anti-inflammatoire de cicatrisation de l' incision21. Comme nos intérêts incluent la compréhension des préjugés sexuels en réponse à la maladie, nous avons développé une méthode d’instillation intravésicale bactérienne chez les souris mâles qui correspond le mieux à l’approche transuréthrale non-chirurgicale longtemps utilisée chez des rongeurs femelles22 .
Notre modèle s’appuie sur une méthodologie éprouvée et offre la possibilité de comparer directement la réponse immunitaire de hôte à l’infection urinaire chez les animaux mâles et femelles. Cette méthode va permettre la dissection des différences fondées sur le sexe dans l’infection et potentiellement offrir des indices moléculaires et cellulaires pour les différences marquées dans la sensibilité et la réponse à l’infection entre les sexes. En outre, ce modèle a valeur au-delà des études de l’UTI, permettant la mise en place de modèles d’étude d’autres maladies associées à la vessie, comme le cancer de la vessie, prostatite, sous - ou over - active les syndrome de la vessie et la cystite interstitielle.
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Protocol
Expériences de souris ont été réalisées conformément à l’approbation du protocole numéro 2012-0024 par le Comité de "éthique en expérimentation animale Paris Centre et Sud (le Comité d’éthique pour l’expérimentation animale), en application de la Directive 2010/63 européen UNION EUROPÉENNE.
1. préparation des cathéters
- Préparer une canule intraveineuse-accès pédiatrique pour chaque groupe de souris infectées. En utilisant le mécanisme à ressort intégré, dépouiller chaque canule de son aiguille, tel qu’indiqué par le fabricant. Jeter les aiguilles, conservant seulement la canule intraveineuse en plastique.
- Stériliser les cathéters dans une hotte à flux laminaire pour cycle un rayonnement ultraviolet (UV), généralement de 25 à 30 min.
Remarque : Cathéters peuvent être utilisés pour plus d’une souris, mais un nouveau cathéter doit être utilisé entre les groupes expérimentaux, sexes ou les souches bactériennes.
2. préparation des uropathogènes e. coli Infection
- Au moins deux jours avant l’infection, en utilisant une boucle de l’inoculation stérile, strie UPEC provenant d’un stock de bactéries congelé sur une gélose de bouillon Luria (LB), contenant des antibiotiques si nécessaire. Incuber à 37 ° C pendant la nuit. Plaques peuvent être stockés à 4 ° C pendant une semaine.
- Dans un erlenmeyer stérile de 100 ml, ensemencer 10 ml LB, contenant des antibiotiques si nécessaire, avec une seule colonie de la plaque LB et incuber debout à 37 ° C pendant la nuit (environ 16-18 h).
Nota : Les cultures permanentes acceptent l’expression de type 1 pili, qui sont nécessaires pour infection23. Cultures cultivées secouant aura moins efficace expression pili et par conséquent, incompatibles taux d’infection. - Mesurer la densité optique (do)600 , de la culture au jour le jour et calculer le nombre de bactéries / ml à l’aide d’une courbe de croissance prédéterminée. Comme exemple, pour la souche UPEC UTI89, OD600 = 0,35 équivaut à 2 x 108 UFC / ml, ainsi, une culture d’une nuit ou plus avec un OD600 = 2.4 équivaudrait à 13,7 x 108 UFC par ml. déterminer empiriquement la relation entre le OD600 et des bactéries viables avec chaque nouvelle souche utilisée pour l’infection.
-
Déterminer la quantité de bactéries nécessaires en tenant compte du nombre d’animaux infectés et que chaque souris devraient recevoir environ 107 unités formant colonie (UFC) dans 50 µl de PBS. Inclure dans le calcul le volume mort de ~ 130 µl de l’essentiel du cathéter et de la seringue et 100 µl nécessaires pour déterminer l’inoculum.
- Faites tourner la suspension bactérienne dans une micro-centrifugeuse table à 17 000 x g pendant 1 min et Resuspendre le culot bactérien qui en résulte à 2 x 108 UFC / ml dans du PBS. En série, diluer une aliquote de cette suspension et la plaque sur une gélose LB, le cas échéant, de déterminer l’inoculum exacte pour chaque infection par des antibiotiques.
- Dessiner l’inoculum bactérien dans une seringue de 1 ml et fixer le cathéter à l’extrémité de la seringue. Tapez sur la seringue pour enlever tout l’air et appuyer sur le poussoir pour remplir l’espace sans circulation d’air dans le cathéter avant de commencer l’instillation.
3. préparation des souris
- Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de xylazine kétamine et 5 mg/kg de 100 mg/kg. Chauffage d’appoint peut être fourni.
- Veiller à ce que chaque souris sont sous sédation entièrement en serrant le coussinet plantaire avec la pression du fluide. Souris sont entièrement sous sédation lorsqu’ils ne font pas réagir et nécessite 3-5 minutes pour arriver à cet État.
- Placez la souris en position couchée et appliquez une pression moyenne sur le bas-ventre de vider la vessie de l’urine. Vessie pleine envie d’un petit pois sous la peau entre les crêtes ileac.
Remarque : Par inhalation isoflurane a été utilisé pour la section des souris femelles15,22, cependant, il n’a pas été testé si les souris mâles sont suffisamment anesthésiés par inhalation isoflurane pour cette procédure.
4. transuréthrale Instillation de souris femelles
- À l’aide de la main non dominante, placez le pouce sur la queue et un doigt de la main sur l’abdomen de la souris et appliquez une légère pression pour s’opposer au sens pour maintenir la souris fermement en place.
-
Placer l’embout du cathéter perpendiculaire à la souris à l’orifice urétral. Avec une pression modérée, glissez le cathéter dans l’urètre, jusqu'à ce que le hub répond à l’orifice urétral, tout en réduisant simultanément la seringue afin qu’elle soit parallèle à la surface de travail. Le cathéter ne nécessite aucun graissage. Ne pas pousser ou forcer le cathéter dans l’urètre. Le cathéter doit glisser en douceur et facilement dans l’urètre, avec peu ou pas de résistance.
- Avant d’instiller l’inoculum (étape 4.3), une fois le cathéter est en place, très doucement, tirez la peau abdominale, vers la tête de la souris avec le doigt de la non dominantes à la main qui est déjà sur le ventre de la souris (étape 4.1). Si le cathéter est dans l’urètre, les tissus composant l’orifice de l’urètre ne bougera pas, considérant que si le cathéter est mal placé dans le vagin, les tissus seront déplace vers le haut et loin le cathéter. Ce test rapid devrait être effectué sur chaque souris.
- Lorsque la plaque tournante du cathéter remplit l’orifice urétral, lentement administrer 50 µl de l’inoculum bactérien. Un taux d’instillation lente réduit les reflux vésico-urétéral dans le rein. Retirer lentement le cathéter pour éviter les fuites, sur un nombre de 5. Placez les souris dans leur cage en position couchée.
5. transuréthrale Instillation de souris mâles
- Placer deux pouce Pince parotidien et direction caudale aux organes génitaux externes de la souris. Rétracter le prépuce pour exposer entièrement le gland du pénis. Une fois que le pénis est placé à l’extérieur, relâcher la pince pouce.
- Repositionner la pince afin de stabiliser le pénis saillant perpendiculairement à l’animal, tenant l’organe doucement mais tendu. Visualiser le méat urétral et soigneusement introduire le cathéter dans la petite ouverture à l’extrémité de l’organe. Guidez le cathéter dans le pénis, vers le corps de la souris, en maintenant une tension douce avec la pince. Le cathéter ne nécessite aucun graissage. Ne forcez pas le cathéter dans le pénis ; le cathéter doit glisser en douceur dans l’urètre, indiquant l’emplacement exact.
- Une fois la plaque tournante du cathéter répond à l’extrémité du pénis, très lentement administrer 50 µl de l’inoculum, tout en conservant la position du pénis. La qualité de l’instillation peut être observée en ce moment selon un score de qualité de l’instillation prédéterminée, comme celui illustré à la Figure 2.
- Retirer le cathéter lentement, au nombre de 5, pour éviter les fuites de l’inoculum. Placez les souris dans leur cage en position couchée. Animaux devrait commencer à récupérer 30-45 min après l’administration de l’anesthésie.
6. détermination de l’UFC dans les organes infectés
- À des moments prédéterminés, sacrifice de souris à l’aide d’approuvé modes opératoires normalisés (par exemple, dislocation cervicale ou surdose de dioxyde de carbone). Humidifier l’abdomen soigneusement avec de l’éthanol 70 % pour minimiser la contamination de la fourrure.
- Faire une incision dans le tiers inférieur de l’abdomen de la souris d’au moins 2 cm à l’aide de ciseaux et aseptiquement enlever la vessie et toute autre organes voulues, y compris mais sans s’y limiter, reins, testicules, vésicules séminales ou glandes préputiales, dans 5 ml bouchon en polypropylène pression tubes contenant 1 ml de PBS stérile. Conserver tous les échantillons sur la glace.
- Homogénéiser les organes avec un homogénéisateur poche jusqu'à ce que presque aucun tissu plein ne reste, environ 15-60 sec selon l’organe. La graisse ne pas bien homogénéiser et est facilement reconnaissable comme le tissu beige-blanc brillant. Jeter la graisse avant ou après homogénéisation. Laver l’homogénéisateur en éthanol suivie de PBS entre chaque expérimentales ou d’un groupe de l’orgue.
Remarque : Utilisent généralement les homogénéisateurs poche ou homogénéisateurs de moulin de perle. Alors que tous ces systèmes ont donné des résultats semblables, tel que déterminé par la comparaison directe des CFU bactérienne à 24 heures après l’infection, les conditions optimales d’homogénéiser les tissus de l’hôte tout en préservant la viabilité bactérienne doivent être déterminées de manière empirique avant effectuer régulièrement le présent protocole. - Effectuer des dilutions successives de suspensions orgue homogénéisé. Plaque des dilutions sur plaques de gélose LB, contenant des antibiotiques lorsque cela est approprié et incuber pendant la nuit (~ 15 h) à 37 ° C. Les souches UPEC ont des temps de doublement très rapides et à ce titre, il faut ne pas Incuber les boîtes de gélose trop longtemps parce que cela va entraver la capacité de compter les colonies individuelles.
7. cytométrie du tissu de la vessie
- Préparer un tampon digestion contenant la collagénase à 34 unités/mL et DNase à 100 µg/mL dans du PBS. Rester sur la glace. Préparer un tube conique de 15 ml par animal à analyser et tampon digestion aliquote de 1 ml par tube.
- À des intervalles prédéterminés, sacrifice de souris à l’aide d’approuvé modes opératoires normalisés (par exemple, la dislocation cervicale ou surdose de dioxyde de carbone). Humidifier l’abdomen soigneusement avec de l’éthanol 70 % pour minimiser la contamination de la fourrure.
-
Faire une incision dans le tiers inférieur de l’abdomen de la souris d’au moins 2 cm à l’aide de ciseaux et enlever tout le boudin. Viande hachée bien avec des ciseaux, découper la vessie en 2-3 mm2 petits morceaux, en général environ 8 morceaux.
- Ajouter une vessie hachée par tube contenant un tampon de la digestion. Secouez pour laver les tissus de la vessie hachées dans le tampon de la digestion. Rester sur la glace jusqu'à ce que toutes les outres sont disséqués et hachées.
- Incuber les vessies hachées pendant 60 à 75 min à 37 ° C, avec une agitation vigoureuse à la main pendant 5 s toutes les 15 min. Lorsque le tissu a un aspect vitreux transparent, qui ressemble à papier de soie humide, la digestion est terminée. Digestion prolongée va supprimer les protéines de surface des cellules nécessaires à l’identification et doit être évitée.
- Inactiver les enzymes de la digestion en ajoutant 2-3 mL de tampon de cytométrie en flux glacee (PBS contenant 2 % sérum fœtal (SVF) et 0,2 mM EDTA) et mélanger doucement. Placer les tubes sur la glace.
- Pour assurer une suspension monocellulaire et supprimer n’importe quel tissu conjonctif, passer le contenu du tube à travers un filtre 100µm placé dans un tube conique de 15 mL. Appuyez doucement sur n’importe quel tissu restant à travers le filtre avec la fin d’un piston de la seringue. Lavez le filtre avec un tampon de cytométrie de flux supplémentaires de 2 mL. Conserver les échantillons sur la glace.
- Laver les échantillons par centrifugation pendant 7 min à 200 x g, 4 ° C. Remettre en suspension les boulettes dans 100 µL écoulement cytometry tampon Fc bloc conteneur, diluée à 5 µg/mL et le transfert d’un 96 puits autour de la plaque inférieure. Après 10-15 min, ajouter 100 µL désiré anticorps cocktail à chaque échantillon. Incuber les échantillons pendant 30-45 min, sur la glace, abri de la lumière.
Remarque : Le bloc Fc est un réactif utilisé pour empêcher la fixation de la portion Fc des anticorps dirigés contre les cellules exprimant les récepteurs Fc. Son but est de minimiser les anticorps non spécifiques. Détermination des anticorps à utiliser sera dépendante de l’hypothèse testée dans l’expérience et doit être sélectionnée avec l’apport de la littérature. Dans la Figure 3, pour mesurer l’infiltration de cellules immunitaires dans l’ensemble, un anticorps anti-CD45 était employé, qui est une protéine de pan-immunitaire cellulaire. - Laver les échantillons par centrifugation pendant 7 min à 200 x g, 4 ° C. Remettre en suspension les granules cellulaires dans 200 µL de tampon de cytométrie en flux et transmettre des échantillons à travers un tamis de cellule 40 µm sur un tube de 5 ml en polystyrène juste avant acquisition sur un cytomètre en flux.
- Recueillir la totalité de l’échantillon sur le cytomètre en flux. Une bonne digestion produira 200 000-400 000 cellules, avec 8 000-10 000 CD45+ des cellules immunitaires de vessies de souris naïves, tandis que les organes infectés contiendra plusieurs cellules16 (Figure 3).
Remarque : Les échantillons préparés pour cytométrie ne peuvent servir à évaluer l’UFC. Il n’est pas recommandé de diviser la vessie en deux parties, car aucune preuve n’existe pour démontrer que la colonisation UPEC ou infiltration de cellules immunitaires est uniforme dans l’ensemble du tissu.
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Representative Results
Dans l’élaboration du présent protocole, des cohortes de souris C57Bl/6 femelles et mâles âgés de 6 à 8 semaines ont été instillée et bactérienne charge évaluée dans les vessies aux points de temps allant de 1 h à 30 jours. Les résultats de ces études sont détaillées ailleurs (Zychlinsky Scharff et al., en attente). Ici, nous présentons des données représentatives d’infections 24hr. Notamment, la charge bactérienne était équivalente entre les souris mâles et femelles à 24 heures après l’infection (Figure 1). Peu de variation de la charge bactérienne a été observée au sein de chaque groupe 24 h après l’infection, semblable à ce qui a été rapporté chez des souris femelles15,16.
Si il est pris soin de vessies vides suffisamment d’urine avant l’infection, des fuites importantes de l’inoculum sont rarement observée chez les souris femelles. Cependant, instillation de souris mâles conduit à des quantités importantes de l’inoculum bactérien qui fuit de l’urètre, surtout pendant la phase de développement du présent protocole. Pour déterminer si perte d’inoculum au moment de l’infection touchés à la colonisation ou l’établissement de l’infection, nous avons utilisé un système de notation pour chaque instillation. Chaque instillation a été cotée sur une échelle de 1 à 5, 1 étant la colonisation bactérienne et plus optimale a été déterminée de 24 h après l’infection (Figure 2, box). Alors que ce système était le chercheur dépendant, et donc potentiellement subjective, le principal auteur de cette étude déterminé tous les scores obtenus immédiatement après l’instillation, avant l’évaluation de la charge bactérienne dans les vessies infectés. Aucune différence statistiquement significative a existé parmi l’UFC issu d’animaux avec des scores différents instillation, tel qu’évalué par un test non paramétrique de Kruskal-Wallis en comparant la position moyenne de chaque colonne avec le rang moyen de toutes les autres colonnes (p = 0,17) et la correction pour les comparaisons multiples à l’aide du test d’un Dunn. De cette analyse, on peut conclure que sous-optimal instillations (score > 3), entraînant une fuite importante d’inoculum bactérien pendant l’infection, n’influenceront pas significativement la colonisation bactérienne à 24 heures (Figure 2, graphique). Notamment, avec l’expérience, la fréquence des fuites chez les souris mâles diminue considérablement.
Enfin, l’objectif dans le développement de ce modèle a été de comparer directement la réponse immunitaire à la marque UPEC chez les animaux mâles et femelles. Pour tester si l’infiltration cellulaire est altérée entre les sexes en réponse à l’infection urinaire, le nombre de CD45+ des cellules immunitaires dans naïve et infecté des cohortes des souris mâles et femelles ont été évaluées par cytométrie en flux. Alors que le nombre de cellules immunitaires présentes dans animaux naïfs ne différait pas entre les souris mâles et femelles (p = 0,95), il y avait une augmentation statistiquement significative de l’infiltration dans les vessies de souris femelles infectées (p = 0,0015) (Figure 3 a-B).
Figure 1 : UPEC colonise les vessies féminins et masculins avec la même efficacité. Six à souris de C57Bl/6 femelles et mâles âgés de 8 semaines ont instillé avec 107 UFC de UPEC. 24 heures après l’infection, les vessies étaient aseptiquement enlevé pour énumérer la charge bactérienne. Intrigue dépeint CFU/vessie. Chaque point est une souris, expérience représentatif de 5 illustré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La qualité de l’Instillation n’est pas corrélée avec la charge bactérienne à 24 heures après l’infection. Six à souris de C57Bl/6 femelles et mâles âgés de 8 semaines ont instillé avec 107 UFC de UPEC. Immédiatement après chaque instillation, chercheur unique attribué un score de qualité à l’instillation, tel que défini par des critères spécifiques (encadré). 24 heures après l’infection, les vessies étaient aseptiquement enlevé pour énumérer la charge bactérienne. Intrigue représente la qualité attribuée score contre UFC/vessie. Chaque point est une souris, 5 expériences regroupées sont présentées. p = 0,17, test de Kruskal-Wallis en comparant la position moyenne de chaque colonne avec le rang moyen de toutes les autres colonnes avec test de Dunn a posteriori pour les comparaisons multiples. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Infiltration de cellules immunitaires est augmentée chez les souris femelles en réponse à UTI. 6 à 8 semaine souris C57Bl/6 âgées mâles et femelles ont été inculquées ou non avec 107 UFC de UPEC. Point représentatif parcelles représentent les cellules de vessie totale avec CD45+ cellules immunitaires bloquées en rose de naïf ou infectés par la souris. Graphique présente le nombre absolu de CD45+ des cellules immunitaires dans les vessies de naïf ou souris 24hr infecté. Chaque point est une souris, 2 expériences regroupées sont présentées. p-valeurs déterminées par le test de Mann-Whitney. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Instillation transuréthrale de souris mâles vous propose de nombreuses nouvelles possibilités de recherche sur l’influence du sexe sur la maladie muqueuse de la vessie, mais présente aussi plusieurs défis. Avant tout, une seule limitation est que l’instillation au départ pourrait pour être techniquement difficile, ce qui entraîne une inflammation excessive durant l’insertion du cathéter. Amélioration de la technique est possible par l’instillation de souris mortes avec une solution colorée, comme colorant bleu d’Evans. Pour confirmer que l’instillation est réussie, vessies devraient faire l’objet d’une inspection visuelle et le volume de liquide instillée peut être évalué par extraction avec une seringue à tuberculine. L’importance des mouvements lents et douces ne peut pas être exagérée : il devrait y avoir aucune résistance et aucune force permet d’insérer le cathéter, car cela se traduira par excès inflammation et des lésions tissulaires. Lorsque exécuté correctement, le cathéter se glisser sans effort dans l’urètre. Si une résistance ou un obstacle est perçue, il est préférable de retirer le cathéter et retentez d’insertion.
En corrélant la qualité de l’instillation à charge bactérienne 24 h après l’infection, nous avons démontré qu’une technique imparfaite, dans laquelle une petite quantité de l’inoculum bactérien est perdue au moment de l’infection, génère toujours une colonisation robuste de la vessie. En utilisant ce protocole, un enquêteur devrait viser à atteindre les instillations sans fuite. Toutefois, la robustesse de la procédure assure que les instillations imparfaites encore fournira des données utiles et des résultats interprétables.
Le grand avantage de notre technique au cours de la seule méthode alternative publiée d’infection de la vessie masculine est son approche non invasive, non chirurgical. Notre approche à l’aide de l’instillation transuréthrale suit le parcours physiologique dans l’urètre jusqu'à la vessie, sans perturber l’intégrité structurale de l’abdomen. La technique invasive, décrite par Olson et ses collègues20, inclut des facteurs inhérents aux interventions chirurgicales, notamment : inflammation, retardée de cicatrisation et le tissu cicatriciel qui en résulte. Particulièrement pertinente en ce qui concerne les études de la réponse immunitaire à l’infection est la réponse de l’organisme au traumatisme chirurgical. Cela comprend la formation d’un milieu pro-inflammatoires et potentiels granulation des tissus, ainsi un programme de guérison de la plaie anti-inflammatoires dans le cadre du processus de guérison. Ces facteurs représentent des influences indésirables dans le cadre expérimental.
Enfin, l’objectif de cette étude était de développer une méthode qui permet une comparaison directe des réponses immunitaires mâles et femelles au cours des infections urinaires, qui peuvent être appliqués à futures études portant sur l’influence du sexe sur la maladie muqueuse vésicale, tels que l’infection et la biologie du cancer. Comme un deuxième avantage, la méthode décrite ici miroirs utilisés chez les souris femelles pour des décennies,19. Ainsi, les expériences réalisées chez des souris mâles avec cette technique sont comparables à un ensemble étendu de recherches existantes. Nos expériences ont révélé qu’il existe des différences dans la réponse et que ces différences peuvent fournir des indices pour comprendre les disparités basées sur le sexe en réponse aux infections muqueuses, mais aussi d’autres maladies de la vessie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Matthieu Rousseau pour une lecture critique du manuscrit et le laboratoire d’immunobiologie dendritiques pour leurs points de vue utiles lors de l’élaboration du présent protocole et le projet. Ce travail a été soutenu en partie par le financement de l’Union européenne septième Programme Marie Curie Action-cadre (PCIG11-GA-2012-3221170 et l’Immuno-oncologie LabEx (ami).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0.7 mm external diameter, 14 mM long | BD Medical | 381811 or 381411* | * catalog number is country-dependent |
| inoculating loop | Greiner Bio-One | 731171 | |
| LB Miller broth | Difco | 244620 | |
| LB Miller agar | Difco | 244520 | |
| Cuvettes | Bio-rad | 223-9955 | |
| syringes | B Braun | 9166017V | |
| Thumb (Adson) forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 5 ml tubes, polypropylene | Falcon | 352063 | |
| Tissue Ruptor disposable probes | Qiagen | 990890 | |
| 15 ml flip cap tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| DNAse | Invitrogen | 18047019 | |
| Liberase TM | Sigma-Aldrich | 5401119001 | should be aliquotted and stored at -20 °C to avoid repeated freeze-thaw |
| 100 µM MACS SmartStrainers | Miltenyi | 130-098-463 | compatible with 15 ml tubes, preferred |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352360 | compatible with 50 ml tubes, if MACS Smart Strainers are not available |
| 96 well plate | Falcon | 353077 | |
| Fc block | BD Pharmingen | 553142 | anti-CD16/CD32 |
| anti-mouse CD45 antibody | BD Biosciences | 561487 | many different fluorescent conjugation options are available |
| 5 ml tubes polystyrene with filter cap | Falcon | 352235 | |
| insulin syringe | Terumo | BS05M2913 | |
| hand held homogenizer | Qiagen | 9001272 | TissueRuptor |
| flow cytometer | BD Biosciences | N/A | Fortessa SORP |
| Flow cytometry software | BD Biosciences | N/A | Diva |
References
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