Summary
Den etablerade modellen av transuretral kateterisering av möss kan studiet av urinblåsan patologier, inklusive urinvägsinfektion, men kan endast utföras hos kvinnor. En ny modell av manliga transuretral instillation, presenteras här, kommer att möjliggöra forskning i ett område som präglas av starka kliniska och epidemiologiska skillnader mellan könen.
Abstract
Urinvägsinfektioner (UVI) är mycket vanliga i hela världen, att ådra sig betydande sjuklighet och vårdrelaterade kostnader. Liten djurmodeller, som korrekt återspeglar sjukdom etablering och progression, tillåta dissekering av värd-patogen interaktioner och generering av immunitet mot infektion. Hos möss, intravesical instillation av uropathogenic E. coli, vilka smittämnen i mer än 85% av gemenskapens förvärvade UTI, recapitulates många av stadier av infektionen hos människor. Tills nyligen, dock kunde UTI endast modelleras i hondjur. Denna begränsning har hindrat studiet av könsrelaterade skillnader i UTI, liksom andra urinblåsan sjukdomar, exempelvis cancer. Här, beskriver vi en metod för att ingjuta hanmöss som tillåter direkt jämförelse mellan kvinnliga och manliga djur och tillhandahålla ett detaljerat protokoll för att bedöma urinblåsan vävnad av flödescytometri som ett sätt att bättre förstå värd Svaren till infektion. Tillsammans, kommer dessa metoder stödet att identifiering av värd faktorer som bidrar till sex fördomar hos UTI och andra urinblåsan-associerade sjukdomar.
Introduction
Urinvägsinfektioner (UVI) är en av de vanligaste infektionerna i utvecklade länder1. Infektionsfrekvensen är lika mellan kvinnor och män bland nyfödda och äldre2. Premenopausala vuxna kvinnor, men har en kraftigt ökad incidens av samhällsförvärvad UTI jämfört med män2,3. Med tanke på att denna sjukdom påverkar främst kvinnor, har grundforskning och klinisk forskning överväldigande fokuserat på UVI hos kvinnor. UVI hos män är dock en betydande och understudied vård challenge4. Verkligen, eftersom UVI hos män är associerade med högre sjuklighet, är dessa infektioner definieras rutinmässigt som komplicerade4,5.
Som vår förståelse av kön fördomar i fysiologi och patologi centrala roll utvecklas, krävs nya metoder att utforska denna tidigare försummade aspekt av sjukdomen. Könsskillnader har en viktig roll i immunitet och infektion. kvinnor har högre incidens av autoimmun sjukdom, medan Hanarna är mer mottagliga för vissa infektioner, såsom tuberkulos, malaria och HIV6,7. Cancer i urinblåsan, ett annat urologisk patologi, är betydligt vanligare hos män än hos kvinnor, och flera studier har visat en roll för androgener i utvecklingen av malignitet8,9,10,11 ,12. Noterbart dock utförs undersökningen av intravesical behandlingar för cancer i urinblåsan uteslutande i hondjur, på grund av oförmågan att upprepade gånger catheterize hanmöss13.
Studien av UTI patogenes är starkt beroende av gnagare modeller av infektion (t.ex., möss och råttor). Murina modeller av UTI får anställa uropathogens ursprungligen isolerats från mänskliga infektioner, såsom uropathogenic E. coli (UPEC), Klebsiella, enterokocker, stafylokockereller Proteus14. Typiskt, införs bakterier i urinblåsan via kateterisering av urinröret. Efter infektion, blåsor och njurarna kan tas bort för att bedöma specifika parametrar på infektion såsom bakteriell kolonisering, vävnadsskada eller värd immunsvar15,16. Allmänt, dock används endast hondjur för UTI forskning. Många studier har faktiskt noterat att, på grund av anatomiska skäl, kateterisering av manliga möss inte är möjligt13,17,18,19. Mer nyligen, en kirurgisk metod att manliga instillation har beskrivits, som buken öppnas, blåsan förskjuts externt genom att tillämpa lätt tryck öppningen i buken och bakterier sprutas in i urinblåsan20. Detta tillvägagångssätt gör manliga infektion, på bekostnad av kirurgiska ingrepp. En stor varning för detta synsätt omfattar således, inflammation, inflytande på resultatet av infektion såsom potential att inducera ett antiinflammatoriska sårläkning svar till snitt21. Eftersom våra intressen omfattar förstå kön bias i Svaren till sjukdom utvecklat vi en metod för bakteriell intravesical instillation hos hanmöss som bäst matchar det sedan länge etablerade icke-kirurgiska transuretral tillvägagångssätt används i kvinnliga gnagare22 .
Vår modell bygger på en etablerad metodik och ger möjlighet att direkt jämföra värd immunsvaret mot UVI hos kvinnliga och manliga djur. Denna metod kommer att tillåta dissekering av könsspecifika skillnader i infektion och eventuellt erbjuda molekylära och cellulära ledtrådar till uttalad skillnader i mottaglighet och svar på infektion mellan könen. Denna modell har dessutom värde utöver UTI studier, möjliggör inrättandet av modeller för att undersöka andra urinblåsan-associerade sjukdomar, såsom cancer i urinblåsan, prostatit, under - eller över - aktiva urinblåsan syndrom och interstitiell cystit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Musen experiment genomfördes i enlighet med godkännande av protokollnummer 2012-0024 av Comité d'éthique sv expérimentation animale Paris centrum et Sud (etikkommittén för djurförsök), med tillämpning av de europeiska direktiv 2010/63 EU.
1. beredning av katetrar
- Förbereda en pediatrisk intravenös åtkomst kanyl för varje grupp av möss infekterade. Använda inbyggda fjädermekanism, avyttra varje kanyl av dess nål, enligt anvisningar från tillverkaren. Kassera nålar, bevara endast de plast intravenös kanylen.
- Sterilisera katetrar i en LAF för en ultraviolett (UV) cykel, vanligtvis 25-30 min.
Obs: Katetrar kan användas för mer än en mus, men en ny kateter bör användas mellan experimentella grupper, könen eller bakteriestammar.
2. förberedelse av Uropathogenic E. coli för infektion
- Minst två dagar före infektion, med hjälp av en steril inympning loop, strimma UPEC från en fryst bakteriell lager på en agarplatta Luria buljong (LB), innehållande antibiotika vid behov. Inkubera vid 37 ° C över natten. Plattorna kan lagras vid 4 ° C i upp till en vecka.
- I en 100 ml steril Erlenmeyerkolv, Inokulera 10 ml LB, innehållande antibiotika om så är lämpligt, med en enda koloni från LB plattan och inkubera stående vid 37 ° C under natten (ca 16-18 hr).
Anmärkning: Stående kulturer möjliggöra uttrycket av typ 1 pili, som är nödvändiga för infektion23. Kulturer odlas skakar kommer att ha mindre effektiva pili uttryck, och därför inkonsekventa frekvensen av infektion. - Mät den optiska densitet (OD)600 övernattande kultur och beräkna antalet bakterier per ml med hjälp av en förutbestämd tillväxtkurva. Som ett exempel, för UPEC stam UTI89, OD600 = 0,35 motsvarar 2 x 108 CFU per ml, således en övernattning kultur med en OD600 = 2.4 skulle motsvara 13,7 x 108 CFU per ml. empiriskt bestämma förhållandet mellan de OD600 och livskraftiga bakterier med varje ny stam som anställd för infektion.
-
Bestämma mängden bakterier behövs genom att beakta antalet djur att vara smittad och att varje mus får cirka 107 kolonibildande enheter (CFU) i 50 μl PBS. Ta med i beräkningen den ~ 130 µl dödvolym på katetern och spruta kärnpunkt och 100 µl behövs för att avgöra inokulatet.
- Snurra bakteriesuspensionen i en bordsskiva mikrocentrifug vid 17 000 x g i 1 min och återsuspendera resulterande bakteriell pelleten på 2 x 108 CFU per ml i PBS. Seriellt Späd en alikvot av denna suspension och plattan på LB agar, med antibiotika om så är lämpligt, att avgöra det exakta inokulatet för varje infektion.
- Rita det bakteriella inokulatet i en 1 ml injektionsspruta och fäst katetern till slutet av sprutan. Tryck på sprutan för att ta bort eventuell luft och tryck in kolven för att fylla det döda luftautrymmet i katetern innan du börjar instillationen.
3. beredning av möss
- Söva möss via intraperitoneal injektion av 100 mg/kg ketamin och 5 mg/kg xylazin. Extra värme kan tillhandahållas.
- Se till att varje mus är helt drogad genom att klämma footpad med medelhögt tryckfall. Möss är helt drogad när de inte reagera och kräver 3-5 min att nå detta tillstånd.
- Placera möss liggande och applicera medlet pressar i nedre delen av buken att tömma blåsan urin. Hela blåsor känns som en ärta under huden mellan ileac kammar.
Obs: Inhalerade isofluran har använts till catheterize honmöss15,22, det har dock inte testats om manliga möss är tillräckligt sövd av inhalerade isofluran för detta förfarande.
4. transuretral Instillation av honmöss
- Använder den icke-dominanta handen, placera tummen på svansen och ett finger av samma hand på magen av musen och mild tryck i motsatta riktningar att hålla musen ordentligt på plats.
-
Placera spetsen på katetern vinkelrätt mot musen på den urinrörets mynning. Med lätt tryck, Skjut in katetern i urinröret, tills navet möter den urinrörets mynning, och samtidigt sänka sprutan så att den är parallell med arbetsytor. Katetern kräver ingen smörjning. Inte pressa eller tvinga in katetern i urinröret. Katetern bör glida smidigt och enkelt in i urinröret, med liten eller inget motstånd.
- Innan ingjuta inokulatet (steg 4,3), en gång är katetern på plats, mycket försiktigt dra magen huden mot huvudet av musen med fingret från det icke-dominant hand som är redan på buken av musen (steg 4.1). Om katetern i urinröret, vävnaden komponera urinröret öppningen kommer inte att flytta, medan om katetern placeras felaktigt i slidan, vävnaden kommer att flytta uppåt och bort från katetern. Det här snabba testet bör utföras på varje mus.
- När navet i katetern möter den urinrörets mynning, långsamt dispensera 50 µl av den bakteriella inokulatet. En långsam instillation hastighet minimerar vesikoureteral reflux i njuren. Ta långsamt bort katetern för att förhindra läckage, över räkna till 5. Placera möss i sina burar i ryggläge.
5. transuretral Instillation hos hanmöss
- Placera två tummen pincett cranially och caudally till musens genitalier. Dra tillbaka förhuden för att helt avslöja ollonet. När penis är externt placerad, släppa tummen tången.
- Flytta tången för att stabilisera utskjutande penis vinkelrätt mot djuret, hålla orgeln försiktigt men tautly. Visualisera de urinrörets meatus och försiktigt införa katetern i den lilla öppningen på spetsen av orgeln. Försiktigt vägleda katetern in penis, mot kroppen av musen, upprätthålla mild spänning med tången. Katetern kräver ingen smörjning. Tvinga inte katetern i penis; katetern bör glida smidigt in i urinröret, som anger korrekt placering.
- När navet i katetern möter spetsen på penis, mycket långsamt fördela 50 µl av inokulatet, bibehållen ställning av penis. Kvaliteten på instillationen kan noteras vid denna tid enligt en förutbestämd instillation kvalitetspoäng, såsom visas i figur 2.
- Dra in katetern långsamt, över räkna till 5 för att förhindra läckage av inokulatet. Placera möss i sina burar i ryggläge. Djur bör börja återvinna 30-45 min efter administrering av bedövningsmedlet.
6. bestämning av CFU i infekterade organ
- Vid förutbestämda tidpunkter godkände offer möss använder standardrutiner (t.ex., cervikal dislokation eller koldioxid överdosering). Fukta buken noggrant med 70% etanol att minimera kontaminering av pälsen.
- Gör ett snitt över den nedre tredjedelen av musens buken på minst 2 cm med sax och aseptiskt bort urinblåsan och någon annan önskad organ, inklusive men inte begränsat till, njurar, testiklarna, sädesblåsor eller preputiala körtlar, i 5 ml polypropylen snap cap rör som innehåller 1 ml steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Hålla alla prover på is.
- Homogenisera organ med en handhållen Homogenisatorer tills nästan ingen solid vävnad förblir, cirka 15-60 SEK beroende på orgeln. Fett homogenisera inte väl och är lätt igenkännlig som skinande beige-vit vävnad. Kassera fett före eller efter homogenisering. Tvätta homogenisatorn i etanol följt av PBS mellan varje experimentella eller orgel grupp.
Obs: Vanligtvis använd handhållen Homogenisatorer eller pärla kvarn Homogenisatorer. Medan alla dessa system har gett liknande resultat, som bestäms av direkt jämförelse av bakteriell CFU på 24 hr efter infektion, bör optimala förutsättningar att homogenisera värd vävnad samtidigt som bakteriell lönsamhet bestämmas empiriskt före utför detta protokoll rutinmässigt. - Utföra seriespädningar av homogeniserad orgel suspensioner. Tavla spädningar på LB agarplattor, som innehåller antibiotika när det är lämpligt och inkubera över natten (~ 15 hr) vid 37 ° C. UPEC stammar har mycket snabb fördubbling gånger och som sådan, försiktighet bör iakttas att inte ruva de agar plattorna för länge eftersom detta kommer att hindra möjligheten att räkna enskilda kolonier.
7. flöde flödescytometrisk analys av urinblåsan vävnad
- Förbereda matsmältningen buffert som innehåller kollagenas på 34 enheter/mL och DNAS på 100 µg/mL i PBS. Hålla på is. Förbered ett 15 ml koniska rör per djur ska analyseras och delmängd 1 ml matsmältningen buffert per rör.
- Vid förutbestämda tidpunkter godkända offer möss använder standardrutiner (t.ex. cervikal dislokation eller koldioxid överdosering). Fukta buken noggrant med 70% etanol att minimera kontaminering av pälsen.
-
Gör ett snitt över den nedre tredjedelen av musens buken på minst 2 cm med sax och ta bort hela blåsan. Färsen väl med sax, skära blåsan i 2-3 mm2 medelstora bitar, vanligtvis ca 8 bitar.
- Lägga till en malet urinblåsan per rör innehållande matsmältningen buffert. Skaka för att tvätta malet urinblåsan vävnaden in i matsmältningen bufferten. Håll på is tills alla blåsor är dissekeras och malet.
- Inkubera malet blåsor för 60-75 minuter vid 37 ° C, med kraftig skakning för hand för 5 s varje 15 min. När vävnaden har en glasartad transparent utseende, som liknar vått mjukpapper, är matsmältningen komplett. Långvarig matsmältningen tar bort ytproteiner från de celler som behövs för identifiering och bör undvikas.
- Inaktivera de matsmältning enzymerna genom att lägga till 2-3 mL iskallt flöde flödescytometri buffert (PBS som innehåller 2% fetalt bovint serum (FBS) och 0,2 mM EDTA) och blanda försiktigt. Placera rören på is.
- Att säkerställa en enda cellsuspension och ta bort eventuella bindväv, innehållet i tuben passera 100 µm filter placeras i en 15 mL koniska rör. Tryck försiktigt eventuella kvarvarande vävnad genom filtret med avsluta av en sprutkolven. Tvätta filtret med en ytterligare 2 mL flöde flödescytometri buffert. Hålla prover på is.
- Tvätta prover genom centrifugering för 7 min vid 200 x g, 4 ° C. Återsuspendera pellets i 100 µL flöde flödescytometri buffert innehållande Fc block, utspädd till 5 µg/mL och överför till en 96-väl rund bottenplatta. Efter 10-15 min, tillsätt 100 µL önskas antikroppar cocktail till varje prov. Inkubera prover för 30-45 min, på is, skyddas från ljus.
Obs: Fc block är ett reagens som används för att förhindra bindning av Fc-delen av antikroppar mot celler som uttrycker Fc-receptorer. Dess syfte är att minimera ospecifik antikropp bindande. Bestämning av antikroppar att använda kommer att vara beroende av hypotesen testas i experimentet och bör väljas med ingång från litteraturen. I figur 3, för att mäta övergripande immunceller infiltration, var en anti-CD45 antikropp anställd, vilket är en pan-immun cell protein. - Tvätta prover genom centrifugering för 7 min vid 200 x g, 4 ° C. Återsuspendera cell pellets i 200 µL flöde flödescytometri buffert och passera en 40 µm cell SIL prover på en 5 ml polystyren tub strax före förvärv på en flödescytometer.
- Samla hela provet på flödescytometer. En bra matsmältning ger 200 000-400 000 celler, med 8.000-10.000 CD45+ immunceller från naiva mus blåsor, medan infekterade organ kommer att innehålla mer celler16 (figur 3).
Obs: Prover förberedd för flöde flödescytometrisk analys kan inte användas för att utvärdera CFU. Det rekommenderas inte att dela blåsan i två delar som det finns inga bevis för att demonstrera att UPEC koloniseringen eller immunceller infiltration är enhetliga i hela vävnaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I utvecklingen av detta protokoll, kohorter av kvinnliga och manliga C57Bl/6 möss i åldern 6 till 8 veckor var ingjuten och bakteriell börda utvärderas i blåsor vid tidpunkter som sträcker sig från 1 tim till 30 dagar. Resultaten från dessa studier är detaljerade någon annanstans (Zychlinsky Scharff et al., väntande). Här presenterar vi representativa uppgifter från 24 hr infektioner. Noterbart var bakteriell belastning motsvarande mellan manliga och kvinnliga möss vid 24 hr efter infektion (figur 1). Liten variation i bakteriell börda observerades inom varje grupp 24 hr efter infektion, liknar vad har rapporterats hos honmöss15,16.
Om man är försiktig att tillräckligt tom blåsor av urin före infektion, observeras betydande läckage av inokulatet sällan hos honmöss. Instillation i hanmöss resulterade dock i betydande mängder bakteriell inokulum läcker från urinröret, särskilt under utvecklingsarbetet av detta protokoll. För att avgöra om förlust av inokulatet vid tidpunkten för infektion påverkade kolonisationen eller inrättandet av infektion, anställt vi ett klassificeringssystem för varje instillation. Varje instillation var gjorde på en skala från 1-5, där 1 är den mest optimala och bakteriella kolonisationen var beslutsamma 24 hr efter infektion (figur 2, box). Även detta system var utredare beroende, och därför potentiellt subjektiva, primära författaren till denna studie fast besluten alla poäng omedelbart efter instillation, före utvärdering av bakteriell börda i infekterade blåsor. Inga statistiskt signifikanta skillnader fanns bland de CFU som härrör från djur med olika instillation scores, enligt bedömning av en icke-parametriska Kruskal-Wallis test jämför medelvärdet rang av varje kolumn med genomsnittlig rang av varje andra kolumn (p = 0,17) och korrigera för multipla jämförelser med en Dunn's test. Från denna analys kan slutsatsen dras att suboptimala instillations (poäng > 3), vilket resulterar i betydande läckage av bakteriell inokulatet under infektion, påverkar inte signifikant bakteriell kolonisering på 24 hr (figur 2, graf). Noterbart med erfarenhet, frekvensen av läckande hos hanmöss minskade betydligt.
Slutligen, målet utvecklar denna modell var att direkt jämföra immunsvaret mot UPEC i kvinnliga och manliga djur. Att testa om cellulär infiltration ändras mellan könen i respons till UVI, antalet CD45+ immunceller i naiva och infekterade kohorter av kvinnliga och manliga möss bedömdes av flödescytometri. Medan antalet immunceller som är närvarande i naiva djur inte skiljde sig mellan kvinnliga och manliga möss (p = 0,95), det fanns en statistiskt signifikant ökning av infiltration i blåsorna av infekterade honmöss (p = 0,0015) (Figur 3A-B).
Figur 1: UPEC Colonizes kvinnliga och manliga blåsor med lika effektivitet. Sex till 8 veckor gamla kvinnliga och manliga C57Bl/6 möss var ingjutit med 107 CFU av UPEC. 24 hr efter infektion, blåsor var aseptiskt bort för att räkna upp bakteriell börda. Plot skildrar CFU/blåsan. Varje punkt är en mus, representativa experiment av 5 visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: The kvalitet av Instillation inte korrelerar med bakteriell börda på 24 hr efter att datorn smittats. Sex till 8 veckor gamla kvinnliga och manliga C57Bl/6 möss var ingjutit med 107 CFU av UPEC. Omedelbart efter varje instillation tilldelats en enda forskare ett kvalitetsresultat på instillation, som definieras av särskilda villkor (inramad text). 24 hr efter infektion, blåsor var aseptiskt bort för att räkna upp bakteriell börda. Plot skildrar den tilldelade kvalitet Poäng kontra CFU/blåsan. Varje punkt är en mus, 5 poolade experiment visas. p = 0,17, Kruskal-Wallis test jämför medelvärdet rang av varje kolumn med genomsnittlig rang av varje andra kolumn med post hoc-Dunn's test för multipla jämförelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immun Cell Infiltration är förhöjd hos honmöss som svar på UTI. Sex till 8 veckors gamla kvinnliga och manliga C57Bl/6 möss var ingjutit eller inte med 107 CFU av UPEC. Representativa dot tomter skildra totala urinblåsan celler med CD45+ immunceller gated i rosa från naiva eller infekterade möss. Diagrammet visar det absoluta antalet CD45+ immunceller i urinblåsor från naiva eller 24 hr infekterade möss. Varje punkt är en mus, 2 poolade experiment visas. p-värden som bestäms av Mann-Whitney test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transuretral instillation hos hanmöss erbjuder många nya forskningsmöjligheter till påverkan av kön på urinblåsan slemhinnor sjukdom, men presenterar också flera utmaningar. Främst, en begränsning är att instillationen initialt kan visa sig vara tekniskt svårt, vilket leder till överdriven inflammation under katetrar. Förbättring av teknik kan uppnås genom instillationen av döda möss med en färgad lösning, såsom Evans blå färg. Att bekräfta att instillationen är framgångsrik, blåsor ska inspekteras visuellt och ingjuten vätskevolym kan utvärderas genom extraktion med tuberkulin spruta. Kan inte nog betonas vikten av långsamma, mjuka rörelser: det bör finnas något motstånd och ingen kraft används för att infoga katetern, eftersom detta kommer att resultera i överskott inflammation och vävnadsskada. När de utförs korrekt, kommer att katetern glida smidigt i urinröret. Om motstånd eller obstruktion är känt, är det bäst att ta bort katetern och reattempt införande.
Genom att sammanföra kvaliteten på instillationen till bakteriell belastning 24 hr efter infektion, vi visat att en bristfällig teknik, där en liten mängd av det bakteriella inokulatet förloras vid tidpunkten för infektion, fortfarande resulterar i robust koloniseringen av de urinblåsan. I att utnyttja detta protokoll, bör en utredare försöka uppnå läckfria instillations. Robustheten av förfarandet säkerställer dock att ofullkomliga instillations kommer fortfarande att ge användbara data och tolkningsbara resultat.
Den stora fördelen med vår teknik över den enda publicera alternativa metoden för manlig urinvägsinfektion är dess icke-invasiva, icke-kirurgisk metod. Vår metod med transuretral instillation följer fysiologiska rutten genom urinröret till urinblåsan, utan att störa den strukturella integriteten av buken. Invasiva tekniken, som beskrivs av Olson och kollegor20, inkluderar faktorer inneboende till kirurgiska ingrepp, inklusive inflammation, fördröjd läkning, och resulterande ärrvävnad. Särskilt relevanta när det gäller studier av immunsvar för infektion är organismens svar på kirurgiskt trauma. Detta inkluderar bildandet av en pro-inflammatoriska miljö och potentiella vävnad granulering, samt en antiinflammatorisk såret helande programmet som en del av läkningsprocessen. Dessa faktorer utgör främmande influenser inom experimentell inställning.
Slutligen, syftet med denna studie var att utveckla en metod som möjliggör direkt jämförelse av manliga och kvinnliga immunsvar under loppet av UVI, som kan tillämpas på framtida studier adressering av kön påverkar urinblåsan slemhinnor sjukdom, till exempel infektion och cancerbiologi. Som en andra klar fördel beskrivs metoden som här speglar som används i honmöss för årtionden19. Experiment som utförs hos hanmöss med denna teknik är alltså jämförbara med en bred mängd befintlig forskning. Våra experiment har visat att det finns skillnader i svaren och att dessa skillnader kan ge ledtrådar till förståelsen könsspecifika skillnader i Svaren till slemhinne infektioner samt andra sjukdomar i urinblåsan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Matthieu Rousseau för kritisk läsning av manuskript och i laboratorium av dendritiska Immunobiology för deras användbara insikter under utvecklingen av detta protokoll och projekt. Detta arbete stöds delvis av finansiering från Europeiska unionens sjunde ram Marie Curie handlingsprogrammet (PCIG11-GA-2012-3221170 och immunonkologiska LabEx (MAI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0.7 mm external diameter, 14 mM long | BD Medical | 381811 or 381411* | * catalog number is country-dependent |
| inoculating loop | Greiner Bio-One | 731171 | |
| LB Miller broth | Difco | 244620 | |
| LB Miller agar | Difco | 244520 | |
| Cuvettes | Bio-rad | 223-9955 | |
| syringes | B Braun | 9166017V | |
| Thumb (Adson) forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 5 ml tubes, polypropylene | Falcon | 352063 | |
| Tissue Ruptor disposable probes | Qiagen | 990890 | |
| 15 ml flip cap tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| DNAse | Invitrogen | 18047019 | |
| Liberase TM | Sigma-Aldrich | 5401119001 | should be aliquotted and stored at -20 °C to avoid repeated freeze-thaw |
| 100 µM MACS SmartStrainers | Miltenyi | 130-098-463 | compatible with 15 ml tubes, preferred |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352360 | compatible with 50 ml tubes, if MACS Smart Strainers are not available |
| 96 well plate | Falcon | 353077 | |
| Fc block | BD Pharmingen | 553142 | anti-CD16/CD32 |
| anti-mouse CD45 antibody | BD Biosciences | 561487 | many different fluorescent conjugation options are available |
| 5 ml tubes polystyrene with filter cap | Falcon | 352235 | |
| insulin syringe | Terumo | BS05M2913 | |
| hand held homogenizer | Qiagen | 9001272 | TissueRuptor |
| flow cytometer | BD Biosciences | N/A | Fortessa SORP |
| Flow cytometry software | BD Biosciences | N/A | Diva |
References
- Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11 (3), 551-581 (1997).
- Harper, M., Fowlis, G. Management of urinary tract infections in men. Trends in Urology, Gynaecology & Sexual Health. 12 (1), 30-35 (2007).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat Rev Urol. 7 (12), 653-660 (2010).
- Lipsky, B. A. Urinary tract infections in men. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis, and treatment. Ann Intern Med. 110 (2), 138-150 (1989).
- Conway, L. J., Carter, E. J., Larson, E. L. Risk Factors for Nosocomial Bacteremia Secondary to Urinary Catheter-Associated Bacteriuria: A Systematic Review. Urol Nurs. 35 (4), 191-203 (2015).
- Markle, J. G., Fish, E. N. SeXX matters in immunity. Trends Immunol. 35 (3), 97-104 (2014).
- Yu, C. Y., Whitacre, C. C. Sex, MHC and complement C4 in autoimmune diseases. Trends Immunol. 25 (12), 694-699 (2004).
- Castelao, J. E., et al. Gender- and smoking-related bladder cancer risk. J Natl Cancer Inst. 93 (7), 538-545 (2001).
- Donsky, H., Coyle, S., Scosyrev, E., Messing, E. M. Sex differences in incidence and mortality of bladder and kidney cancers: national estimates from 49 countries. Urol Oncol. 32 (1), 40-e31 (2014).
- Garg, T., et al. Gender Disparities in Hematuria Evaluation and Bladder Cancer Diagnosis: A Population-Based Analysis. J Urol. , (2014).
- Dobruch, J., et al. Gender and Bladder Cancer: A Collaborative Review of Etiology, Biology, and Outcomes. Eur Urol. , (2015).
- Hsu, J. W., et al. Decreased tumorigenesis and mortality from bladder cancer in mice lacking urothelial androgen receptor. Am J Pathol. 182 (5), 1811-1820 (2013).
- El Behi, M., et al. An essential role for decorin in bladder cancer invasiveness. EMBO Mol Med. 5 (12), 1835-1851 (2013).
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Am J Med. 113, Suppl 1A. 05S-13S (2002).
- Ingersoll, M. A., Kline, K. A., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. G-CSF induction early in uropathogenic Escherichia coli infection of the urinary tract modulates host immunity. Cell Microbiol. 10 (12), 2568-2578 (2008).
- Mora-Bau, G., et al. Macrophages Subvert Adaptive Immunity to Urinary Tract Infection. PLoS Pathog. 11 (7), e1005044 (2015).
- Oliveira, P. A., et al. Technical Report: Technique of Bladder Catheterization in Female Mice and Rats for Intravesical Instillation in Models of Bladder Cancer. (Conference Title)39th Scand-LAS and ICLAS Joint Meeting. 36, 5-9 (2009).
- Seager, C. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2 (12), 1008-1014 (2009).
- Hagberg, L., et al. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin). Infect Immun. 40 (1), 273-283 (1983).
- Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. J Am Soc Nephrol. , (2015).
- Knipper, J. A., et al. Interleukin-4 Receptor alpha Signaling in Myeloid Cells Controls Collagen Fibril Assembly in Skin Repair. Immunity. 43 (4), 803-816 (2015).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Development of intracellular bacterial communities of uropathogenic Escherichia coli depends on type 1 pili. Cell Microbiol. 9 (9), 2230-2241 (2007).
