Методика адаптивной лабораторной эволюции микроорганизмов с использованием хемостатическую

Summary

Здесь мы приводим протокол для получения адаптивной лабораторной эволюции микроорганизмов в условиях с использованием хемостате культуры. Кроме того, геномный анализ выделившегося штамма обсуждается.

Introduction

Микроорганизмы могут выжить и адаптироваться к различных средах. Под сильным стрессом, адаптация может происходить путем приобретения полезных фенотипов случайными геномных мутаций и последующего положительного отбора ^1-3. Таким образом, микробные клетки могут адаптироваться путем изменения метаболических или регуляторных сетей для оптимального роста, которая называется "адаптивная эволюция". Последние важные микробные тенденции, такие как вспышки суперошибок и появления устойчивых штаммов микроорганизмов, которые очень тесно связаны с адаптивной эволюции в стрессовых условиях. В соответствии с определенными в лабораторных условиях, мы можем изучить механизмы молекулярной эволюции и даже контролировать направление эволюции микробов для различных областей применения. В отличие от многоклеточных организмов, одноклеточные организмы хорошо подходят для адаптивной лабораторной эволюции (ALE) по следующим причинам: они быстро регенерируют, они поддерживают большие группы населения, а также легко создавать и поддерживать Homogeneous среды. В сочетании с последними достижениями в области методов секвенирования ДНК и высокопроизводительных технологий, ALE позволяет непосредственное наблюдение за геномных изменений, которые приводят к системным регуляторных изменений. Мутационные динамика и разнообразие населения также наблюдается. Генная инженерия стратегии могут быть определены из анализа ALE штаммов ^4,5.

Хемостатическую культура представляет собой метод , используемый для получения устойчивого состояния клеток и увеличение производительности в бродильных процессов ^6. добавляют свежую среду и культуральный бульон собирают во время процесса (последняя включает в себя среду и биомассы). Долгосрочный хемостатическую культура, однако, изменяет стационарную продуктивности культуры и приводит к накоплению спонтанных мутаций и отбора в процессе культивирования (рис 1а). При различных давлениях отбора (стрессоров), накопление мутаций усиливается. Постепенное увеличение стресса в долгосрочной перспективе хемостатическую предусматривает непрерывный отбор мутаций , которые работают против заданных факторов стресса, таких как температура, рН, осмотическое давление, питательного голодания, окисления, токсичных конечных продуктов и т.д. передачи колонии от твердой среды и последовательной передачи из жидкой среды ( с повтором партия культуры) также позволяют исследователям получить эволюционировали микроорганизмы (рис 1б и 1в). Хотя хемостатическую культура требует сложных методов, пул разнообразия (количество репликаций и численности населения) выше, чем полученная путем переноса колоний и последовательные методы переноса. Стабильная воздействие стресса на отдельные клетки и снижение изменения в клеточном состоянии во время хемостатной культуры (устойчивое состояние) и другие преимущества эля по сравнению с методами культивирования на основе партий. Стресс-индуцированной ALE кишечной палочки , подвергнутой воздействию высоких янтарной условий вводится в этой статье.

Iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Методы лабораторной эволюции адаптивной (А) хемостатическую;. (B) последовательный перевод; (C) перенос колонии. Верхние цифры иллюстрируют концепцию методов ALE, а нижние рисунки иллюстрируют количество клеток, выросших во время ALE. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Protocol

1. Подготовка оборудования

1. Получить хемостате банку (150-250 мл) или колбы Эрленмейера (250 мл), содержащей входное отверстие и выходное отверстие. Соедините порты с кремнием трубки позволяет скорости потока 10-100 мл / ч. Необязательно использовать вентиляционное отверстие, выпускное отверстие воздуха и регулируемой температурой воды на входе и выходе портов.
2. Получить устройство, подходящее для хемостатной банку, который обеспечивает перемешивания и температуры управления (или использовать ротационным качанием инкубатор).
3. Получают два перистальтических насосов для того, чтобы доставить свежую среду и собирать культуру.
4. Получить резервуар банку (10-20 л), содержащий средний выходной порт и порт для впуска воздуха.
5. Получение силиконовых труб , подходящий для скорости разбавления (т.е., ID 0,8 мм, диапазон расхода 0.06-36 мл / мин; L / S 13 насосно - компрессорных труб).

2. Средняя Подготовка и Стерилизация

1. Начальный средний
   1. Растворить 0,3 г глюкозы, 0,08 г NH ₄Cl, 0,05 г NaCl, 0,75 г Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O и 0,3 г KH ₂ PO ₄ в 90 мл дистиллированной воды (DW) в хемостатной банке.
   2. Уплотнение хемостате банку вместе с трубкой при помощи зажимов. Не запечатать вентиляционное отверстие.
   3. Стерилизация Хемостат банку в автоклаве при температуре 121 ° С в течение 15 мин. После стерилизации хранить Хемостат банку при комнатной температуре.
   4. Растворить 0,02 г MgSO ₄ · 7H ₂ O, 0,01 г CaCl _2, и 0,1 мг тиамина в 10 мл DW (раствор А).
   5. Решение Фильтр A с помощью шприца и предварительно стерилизованного шприца фильтр (0,45 мкм поры фильтра а).
   6. Добавьте -ный раствор фильтратов в хемостатной банку.
2. Стресс Средняя
   1. Растворить 30 г глюкозы, 8 г NH ₄ Cl, 5 г NaCl, 75 г Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 30 г KH ₂ PO ₄ и 300 г динатрий сукцинат гексагидрат (Na ₂ · сукцинат · 6H <к югу> 2 O; стрессор, используемый в этом эксперименте) в 9,9 л DW в резервуаре баночке.
   2. Уплотнение резервуара банку вместе с трубкой при помощи зажимов. Не запечатать вентиляционное отверстие.
   3. Стерилизацию резервуар банку в автоклаве при температуре 121 ° С в течение 15 мин. После стерилизации хранить банку при комнатной температуре.
   4. Растворить 2 г MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1 г CaCl _2, и 10 мг тиамина в 100 мл DW (раствор А).
   5. Фильтр раствор А с помощью шприца и предварительно стерилизованные шприцевой фильтр (0,45 мкм пор фильтра а).
   6. Добавьте -ный раствор фильтратов в резервуар банку.
   7. Консерванта подключить стерилизованного кремния трубки к резервуару банку и прикрепите перистальтических насосов.
3. Высокого напряжения среднего
   1. Подготовка среды, описанной в разделе 2.2, но с более высокой концентрацией стрессора (то есть, 3-5 г / л выше , в приспособлении сукцинат).
      Примечание: Этот протокол предназначен для адаптации к стрессу йпри могут быть доставлены через среду. В случае физических факторов стресса, таких как температура, перемешивание, или освещения, культивирование следует проектировать соответствующим образом.

3. Начальное Культивирование

1. Инокулируйте одну колонию дикого типа E. палочки в пробирку объемом 15 мл , содержащую 4 мл исходной среды.
2. Инкубируйте пробирку в качалке инкубаторе в течение 12 ч при температуре 37 ° С и 220 оборотов в минуту.
3. Консерванта передача 1 мл предкультурой к хемостатной банку.
4. Выдержите Хемостат банку, обеспечивая для аэрации (воздуха 50 мл / мин) и перемешивании (200 оборотов в минуту), при 37 ° С в течение 6 часов.

4. Стресс Адаптация

1. Консерванта соединить конец трубки кремния от насосов до Хемостат банку.
2. Запуск выходе из насоса (10 мл / ч или выше) и собирать культуру.
   Примечание: Культура должна быть в экспоненциальной фазе, как правило, 4-8 ч после первоначального культивирования.
3. ChEck оптической плотности (600 нм) культуры из выпускного отверстия трубки.
4. Запуск на входе в насос (10 мл / ч, что соответствует скорости разбавления 0,1 ч - ^1).
5. Проверьте оптическую плотность культуры при 600 нм из выпускного отверстия НКТ каждые 24 ч.
6. Эксплуатация хемостата в течение 96 ч (оборот 9,6 раза) или более. Если оптическая плотность стабильна, обменивать резервуар, содержащий высокого напряжения среды. Если оптическая плотность ниже, чем 0,2, остановка подачи пищи на входе насоса в течение 6 ч. Перезапуск на входе в насос и проверьте, что оптическая плотность составляет более 0,2.
7. Постепенно увеличивают концентрацию стрессора путем изменения в резервуар, содержащий более высокую концентрацию стрессора.
8. Отбирают образцы адаптированной культуры всякий раз , когда он достигает рубежа (например, штамм , адаптированный к 100 г / л сукцината стресса), и сохранять для дальнейшего геномного анализа.
9. Для хранения проб, смешайте образец культуры (0,5 мл) с стерилизованный 80% глицерина Solutiна (0,5 мл) и хранить его при температуре -80 ° С.
   Примечание: Если микроорганизм приобретает способность ухудшать стрессора в процессе ALE, концентрация стрессора в ферментационной банку не то же самое, что и в свежем резервуаре.

5. Single-колония Выделение стресс-адаптированный штамм

1. Приготовьте чашки с агаром среду (1,6% агар), содержащий ту же стрессора и при той же концентрации среды.
2. Пластина культуры выпускное отверстие (0,1 мл) с хемостате, и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 16 часов.
3. Выбор отдельных колоний от пластины с помощью стерильной зубочисткой и прививают их в 15 мл пробирки, содержащие один и тот же стрессора и в то же средней концентрации, что и в хемостате, и инкубируют в течение 6 часов.
4. Передача 1 мл культурального бульона в колбу 250 мл Эрленмейера, содержащую 50 мл среды. Урожай 0,5 мл культуральной жидкости каждые 1 ч, и измеряют оптическую плотность при 600 нм. Сравните темпы роста адаптированного ес'ип тому из штамма дикого типа данного стрессор.

Representative Results

Для адаптации напряжения высокой сукцинат, дикого типа E. палочка W3110 штамм культивировали в хемостате при D = 0,1 ч ^-1 в течение 270 дней (Рисунок 2).

Рисунок 2: High-сукцинат адаптация напряжения Е. палочки W3110 с использованием хемостате культуры. Тонкие стрелки показывают время , в котором была увеличена концентрация стрессора, и смелые стрелки указывают времена , на которых сохранились культуры. Числа со стрелками указывают на концентрацию стрессора, динатрия сукцинат гексагидрату. Изменение биомассы в процессе ALE и концентрации стрессора представлены. Цифра была изменена из J. Biosci. Bioeng ^7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Начальная концентрация стрессора из 30 г / л (динатрия сукцинат гексагидрат) постепенно увеличивалась всякий раз, когда хемостатическую культура достигла стационарного состояния, пока концентрация стрессора не было 160 г / л. Адаптированный Е. DST160 палочка штамм (толерантными к 160 г / л динатрия сукцинат стресса) был приобретен после 270 дней. Штамм DST160 выставлялись раскованный рост под высоким напряжением сукцината (160 г / л стрессора), в то время как штамм предок (W3110) показали почти никакого роста (рисунок 3).

Рисунок 3: Кривые роста дикого типа (W3110, белый круг) и адаптированный штамм (DST160, черный круг) под высоким сукцината стресса На рисунке показано , что адаптированный штамм рос без задержек при высоких сукцината затруднительных условиях во время дикой природе. типа не сделал. Ошибкаполоски указывают на стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Цифра была изменена из J. Biosci. Bioeng ^7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Микроорганизмы способны адаптироваться к практически во всех средах из-за их быстрого темпа роста и генетического разнообразия. Эволюция Адаптивная лаборатория позволяет микроорганизмы развиваться при условиях, разработанных, что обеспечивает способ выбора отдельных организмов, укрывательство спонтанными мутациями, которые полезны при заданных условиях.

Техника хемостатическую является более надежной для достижения искусственно приводимый эволюции, чем методы переноса по следующим причинам: (а) устойчивую среду - ведь методы передачи основаны на периодических культурах либо на твердой или в жидкой среде, среда клеток изменяется во время партии культура в то время как экологический стресс хемостате устойчив; (Б) большей части населения и непрерывный отбор - чем больше население хемостате обеспечивает больше генетического разнообразия чем меньшего числа методов передачи. Непрерывный отбор чemostat метод является более быстрым способом для достижения эволюции, чем прерывистое выбора методов передачи. Очень важно, что хемостатическую культура не быть загрязнены другими микроорганизмами во время процедуры ALE и асептические условия необходимы в течение хемостатной культуры. Процедура ALE может быть изменена путем изменения в стрессовых факторов, таких как окислительный стресс, осмотический стресс, а также токсического стресса продукта. Есть несколько технических ограничений эля хемостатной культуры. Эволюция происходит случайно; Таким образом, различные исследователи не могут быть в состоянии получить тот же эволюционный результат, хотя последствия мутации могут быть связаны между собой. Другим ограничением является размыв хемостатной культуры, когда концентрация стрессора повышается слишком быстро. Если биомасса снижается до определенного количества (т.е. OD = 0.2 в этой процедуре) после того, как концентрация стрессора повышается, введение стрессора должно быть остановлено в течение по крайней мере нескольких поколений вдать время для адаптации штамма.

Последние разработки в области технологии секвенирования генома помогли пониманию мутаций, которые развиваются в ответ на определенные стрессовых условиях. Например, мутации ДНК изменяет определенный системный эффект , что благоприятно сказывается на данной среде (то есть, толерантность к токсичным стрессора). Таким образом, ALE может быть использован для изучения функции генов или регуляции сети, или в качестве сырья для «ускоренной эволюции». ALE исследования также полезны при моделировании развития устойчивых к антибиотикам бактерий, что указывает на механизмы, с помощью которых возникают опасные бактериальные штаммы, устойчивые к лекарствам. Поскольку траектория эволюции выгравирован на геноме, раскрывая генетические изменения , которые приводят к желаемым фенотипов (например, устойчивость к стрессу) является следующим препятствием , как только эволюционировали штаммы получены ^8. Среди имеющихся в настоящее время технологий секвенирования следующего поколения, наличник Illumina и Ion Torrentформы пригодны для обнаружения нуклеотидных замен или небольших вставкам, которые происходят в эволюционировали штаммов, и оба являются доступными. Поскольку обнаружение вариант обычно включает в себя короткий читаемый отображение эталонных последовательностей, наличие последовательности генома наследственного штамма имеет решающее значение. Даже если последовательность генома штамма учредителю из общедоступных баз данных, часто желательно, чтобы последовательность его одновременно с проэволюционировавшего один, так как там могут быть некоторые дополнительные различия в фактической начальной деформации. Протоколы для идентификации мутаций легко доступны через Интернет или поиска литературы ^9,10. Например, BRESEQ представляет собой специально разработанный трубопровод для геномного анализа лабораторных эволюционировали микробов с помощью секвенирования данных следующего поколения ^11. Сравнения выделяющихся штаммов при определенных этапов (например, в этом представительном данных, дикого типа, DST50, DST100 и DST160) может обеспечить последовательность выделившегося штаммаs и дать представление о последствиях данного стрессора. Таким образом, знание и применение ALE экспериментов, в сочетании с системной биологии и идентификации системных переменных возмущений, как ожидается, в ближайшем будущем.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini-chemostat fermentor	Biotron Inc.	-	manufactured by special order
silicon tubing	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.
reservoir jar	Bellco	Media storage bottle	20 L
chemicals	Sigma-Aldrich	-	reagent grade
glucose	Sigma-Aldrich	G5767	ACS reagent
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS reagent, ≥99%
Na2HPO4·2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	ACS reagent, ≥99%
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	230391	ACS reagent, ≥98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	ACS reagent, ≥96%
thiamine·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	reagent grade, ≥99%
Na2·succinate·6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99%