Aqui, apresentamos um protocolo para obter a evolução adaptativa laboratório de microrganismos em condições usando cultura quemostato. Além disso, é discutida análise genômica da estirpe evoluiu.
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Artigo de método
Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A evolução natural envolve diversidade genética, como mudanças ambientais e uma seleção entre pequenas populações. A evolução laboratorial adaptativa (ALE) refere-se à situação experimental em que a evolução é observada usando organismos vivos sob condições e estressores controlados; Os organismos são, portanto, artificialmente forçados a fazer mudanças evolutivas. Os microrganismos estão sujeitos a uma variedade de estressores no ambiente e são capazes de regular certas proteínas induzíveis por estresse para aumentar suas chances de sobrevivência. Mutações espontâneas que ocorrem naturalmente provocam mudanças no genoma de um microrganismo que afetam suas chances de sobrevivência. A exposição prolongada à cultura de quimiotato provoca um acúmulo de mutações espontâneas e torna dominante a cepa mais adaptável. Em comparação com os métodos de transferência de colônias e transferência serial, a cultura de quimiostato envolve o maior número de divisões celulares e, portanto, o maior número de populações diversas. Embora a cultura de quimiostato para ALE exija dispositivos de cultura mais complicados, ela é menos trabalhosa quando a operação começa. Análises genômicas e transcriptômicas comparativas da cepa adaptada fornecem pistas evolutivas sobre como os estressores contribuem para mutações que superam o estresse. O objetivo do presente artigo é trazer a evolução acelerada de microrganismos sob condições controladas de laboratório.
Introdução
Os microrganismos podem sobreviver e se adaptar a diversos ambientes. Sob forte estresse, a adaptação pode ocorrer por meio de aquisição de fenótipos benéficos por mutações genómicas aleatórias e posterior selecção positiva 1-3. Portanto, as células microbianas podem se adaptar mudando metabólica ou redes de regulação para o crescimento ideal, que é chamado de "evolução adaptativa". tendências microbianas importantes recentes, como surtos de superbactérias e a ocorrência de cepas microbianas robustos, estão intimamente relacionadas com adaptativa evolução sob condições estressantes. Em condições de laboratório definidos, somos capazes de estudar os mecanis....
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Protocolo
1. Preparação Equipamento
- Obter um frasco quimiostato (150-250 ml) ou num balão de Erlenmeyer (250 ml) contendo uma abertura de entrada e uma porta de saída. Ligue as portas com tubo de silicone que permite taxas de fluxo de 10-100 ml / hr. Opcionalmente, usar um respiradouro de ar, uma porta de saída de ar, e portas de entrada e saída de água de temperatura controlada.
- Obter um dispositivo adequado para o frasco quimiostato que fornece para agitação e controlo da temperatura (ou usar um incubador com agitação rotativa).
- Obter duas bombas peristálticas de modo a fornecer meio fresco e recolher a cultura.
- Obter um frasco....
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Resultados
Para adaptação ao estresse de alta succinato, o tipo selvagem E. coli W3110 estirpe foi cultivada num quimiostato em D = 0,1 h -1 durante 270 dias (Figura 2).
Figura 2: adaptação ao estresse de alta succinato de E. coli W3110 usando cultura quemostato. setas finas indicam os tempos em que a concentração de estressor foi aument.......
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Discussão
Os microrganismos são capazes de se adaptar a quase todos os ambientes, devido à sua rápida taxa de crescimento e diversidade genética. evolução laboratório adaptável permite microorganismos a evoluir em condições destinadas, que fornece uma maneira de selecionar organismos individuais que abrigam mutações espontâneas que são benéficos nas condições dadas.
A técnica quimiostato é mais robusto para a realização evolução de forma artificial do que as técnicas de transferência, pelas seguintes .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado financeiramente pelo Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro da Coreia (programa do Centro de Biologia Sintética Inteligente 2012M3A6A8054887). P. Kim foi apoiado por uma bolsa da Universidade Católica da Coreia (2015).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fermentador de mini-quimiostato | Biotron Inc. | - | fabricado por encomenda especial |
| tubo de silício | Cole-Parmer | Masterflex L / S 13 | tamanho da tubulação pode ser variado dependendo da taxa de diluição e do tamanho do frasco do fermentador. |
| frasco reservatório | Bellco | Garrafa de armazenamento de mídia | 20 L |
| produtos químicos | Sigma-Aldrich-grau | ||
| reagente glicose | Sigma-Aldrich | G5767 | Reagente ACS |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | para biologia molecular, adequado para cultura de células, ≥ 99,5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | reagente ACS, ≥ 99% |
| Na2HPO4· 2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98,5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | reagente ACS, etc; 99% |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | reagente ACS, ≥ 98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | reagente ACS, ≥ 96% |
| tiamina· HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | grau de reagente, ≥ 99% |
| Na2· succinato· 6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥ 99% de sucesso |
Referências
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia ....
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Reimpressões e permissões
