Verfahren für Adaptive Labor Entwicklung von Mikroorganismen Mit einem Chemostat

Summary

mit Chemostatkultur Hier präsentieren wir ein Protokoll adaptive gerichtete Evolution von Mikroorganismen unter Bedingungen zu erhalten. Auch genomische Analyse des entwickelten Stamm wird diskutiert.

Introduction

Mikroorganismen können auf unterschiedliche Umgebungen überleben und sich anzupassen. Unter starkem Stress, Anpassung kann ^1-3 über Erwerb von positiven Phänotypen durch statistische genomische Mutationen und anschließende positive Selektion auftreten. Daher kann mikrobiellen Zellen anzupassen durch metabolische oder regulatorische Netzwerke für ein optimales Wachstum zu ändern, die "adaptive Evolution" bezeichnet wird. Vor kurzem sind wichtige mikrobielle Tendenzen, wie Ausbrüche von Superbugs und dem Auftreten von robusten mikrobielle Stämme, sind sehr eng miteinander verbunden Evolution unter Stressbedingungen zu adaptiv. Unter definierten Laborbedingungen, sind wir die Mechanismen der molekularen Evolution zu studieren können und sogar die Richtung der mikrobiellen Evolution für verschiedene Anwendungen zu steuern. Im Gegensatz zu mehrzelligen Organismen sind einzellige Organismen gut geeignet, um adaptive Labor Entwicklung (ALE) aus den folgenden Gründen: sie regenerieren schnell, sie pflegen große Populationen, und es ist leicht hom zu erstellen und zu pflegenogeneous Umgebungen. In Kombination mit den jüngsten Fortschritten in der DNA-Sequenzierungstechniken und Hochdurchsatz-Technologien, ermöglicht ALE für die direkte Beobachtung von genomischen Veränderungen, die zu einer systemischen regulatorischen Veränderungen führen. Mutations Dynamik und Vielfalt der Bevölkerung sind auch zu beobachten. Die Gentechnik - Strategien können aus der Analyse der ALE - Stämme ^4,5 bestimmt werden.

Chemostatkultur ist eine Methode verwendet Steady-State - Zellen zu erhalten und die Produktivität bei Fermentationsprozessen ⁶ erhöhen. Frisches Medium wird zugesetzt und Kulturbrühe wird während des Verfahrens geerntet (letzteres enthält Medium und Biomasse). Langzeit Chemostat - Kultur, ändert jedoch den steady-state Produktivität der Kultur und bewirkt die Anhäufung von spontanen Mutationen und Selektion während der Kultivierung (Abbildung 1a). Unter verschiedenen Selektionsdruck (Stressoren), wird die Akkumulation von Mutationen verbessert. Eine allmähliche Zunahme der Spannung in einem langfristigen Chemostat sorgt für eine kontinuierliche Auswahl von Mutationen , die gegen den gegebenen Stressoren arbeiten, wie beispielsweise Temperatur, pH, osmotischer Druck, Nährstoffmangel, Oxidation, toxische Endprodukte usw. Colony Übertragung von einem festen Medium und serielle Übertragung aus einem flüssigen Medium (wiederholte Batch - Kultur) erlauben auch Forscher entwickelten Mikroorganismen (Abbildung 1b und 1c) zu erhalten. Obwohl Chemostatkultur komplizierte Methoden erfordert, ist der Pool der Vielfalt (Anzahl der Replikationen und Populationsgröße) höher als die durch Kolonie-Transfer und serielle Übertragungstechniken erhalten. Die stabile Stressbelastung auf einzelne Zellen und verringerte Veränderung der zellulären Zustand während Chemostatkultur (Steady State) sind weitere Vorteile von ALE im Vergleich zu Batch-Kultur-basierte Techniken. Stress-induzierten ALE von Escherichia coli zu hoher Succinat Bedingungen unterworfen wird in diesem Artikel eingeführt.

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Abbildung 1: Methoden der adaptiven Labor Evolution (A) Chemostat;. (B) eine serielle Übertragung; (C) Kolonie übertragen. Die Top - Zahlen das Konzept der Methoden für das ALE illustrieren, und die unteren Zahlen die Anzahl der Zellen darstellen , die während ALE wuchs. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

1. Vorbereitung der Ausrüstung

1. Besorgen Sie sich ein Chemostat Glas (150-250 ml) oder einem Erlenmeyerkolben (250 ml) mit einer Einlassöffnung und eine Austrittsöffnung enthält. Verbinden Sie die Anschlüsse mit Silikonschlauch so dass für Flussraten von 10 bis 100 ml / h. Optional kann ein Entlüftungsventil, eine Luftaustrittsöffnung, und temperiertes Wasser Einlass- und Auslasskanäle verwenden.
2. Besorgen Sie sich eine Vorrichtung, die geeignet für die chemostat Glas, die für das Rühren und Temperaturkontrolle bietet (oder einen Dreh Schüttelinkubator verwenden).
3. Erhalten zwei peristaltische Pumpen, um frisches Medium zu liefern und die Kultur zu sammeln.
4. Besorgen Sie sich ein Reservoir Glas (10-20 L) eine mittlere Austrittsöffnung und eine Lufteinlassöffnung enthält.
5. Erhalten Silikonschlauch geeignet für die Verdünnungsrate (dh ID 0,8 mm, Durchflussbereich von 0,06 bis 36 ml / min; L / S 13 Schläuche).

2. Medium Vorbereitung und Sterilisation

1. Initial Medium
   1. Man löst 0,3 g Glucose, 0,08 g NH ₄Cl, 0,05 g NaCl, 0,75 g Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O und 0,3 g KH ₂ PO ₄ in 90 ml destilliertem Wasser (DW) in einem Chemostat jar.
   2. Seal die chemostat Glas zusammen mit dem Schlauch mit Schellen. Sie nicht die Lüftungsöffnung abzudichten.
   3. Sterilisieren Sie die chemostat Glas in einem Autoklaven bei 121 ° C für 15 min. Nach der Sterilisation, speichern Sie die chemostat Glas bei Raumtemperatur.
   4. Man löst 0,02 g MgSO ₄ · 7H ₂ O, 0,01 g CaCl ₂ und 0,1 mg Thiamin in 10 ml DW (Lösung A).
   5. Filterlösung A eine Spritze und eine vorge sterilisierten Spritzenfilter unter Verwendung von (a 0,45 um Porenfilter).
   6. Fügen Sie die Lösung A Filtrate zum Chemostat Glas.
2. Stress-Medium
   1. Man löst 30 g Glucose, 8 g NH ₄ Cl, 5 g NaCl, 75 g Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 30 g KH ₂ PO ₄ und 300 g Dinatriumsuccinat Hexahydrat (Na ₂ · Succinat · 6H <sub> 2 O; der Stressor in diesem Experiment verwendet) in 9,9 L DW in einem Reservoir jar.
   2. Verschließen Sie den Behälter Glas zusammen mit dem Schlauch mit Schellen. Sie nicht die Lüftungsöffnung abzudichten.
   3. Sterilisieren des Behälters jar in einem Autoklaven bei 121 ° C für 15 min. Nach der Sterilisation, speichern Sie das Gefäß bei Raumtemperatur.
   4. Man löst 2 g MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1 g CaCl ₂ und 10 mg Thiamin in 100 ml DW (Lösung A).
   5. Filter Lösung A mit einer Spritze und einem vorher sterilisierten Spritzenfilter (0,45 & mgr; m ein Porenfilter).
   6. Fügen Sie die Lösung A Filtrate zum Reservoir Glas.
   7. Aseptisch schließen Sie das sterilisierte Silikonschlauch mit dem Reservoir Glas und die peristaltische Pumpen befestigen.
3. High-Stress-Mittel
   1. Bereiten Sie das Medium , wie in Abschnitt 2.2, aber mit einer größeren Konzentration von Stressor (dh 3-5 g / l höher in der Succinat - Anpassung).
      Hinweis: Dieses Protokoll zur Anpassung an eine Stress than kann über das Medium geliefert werden. Im Falle von physikalischen Stressoren, wie Temperatur, Rühren oder Beleuchtung, die Kultivierung sollte entsprechend ausgelegt werden.

3. Erste Anbau

1. Impfen eine einzige Kolonie von Wildtyp E. coli in einem 15 ml Teströhrchen mit 4 ml des anfänglichen Mediums.
2. Inkubieren des Teströhrchens in einem Schüttelinkubator 12 Stunden bei 37 ° C und 220 Umdrehungen pro Minute.
3. Aseptisch 1 ml der Vorkultur in Chemostat Glas.
4. Inkubieren Sie die chemostat Glas und bietet für die Belüftung (Luft 50 ml / min) und Rühren (200 Umdrehungen pro Minute), bei 37 ° C für 6 Stunden.

4. Stress-Anpassung

1. Aseptisch schließen Sie das Ende des Silikonschläuche von den Pumpen zum Chemostat Glas.
2. Starten Sie den Ausgang Pumpe (10 ml / h oder höher) und sammeln Kultur.
   Hinweis: Die Kultur in der exponentiellen Phase sein sollte, in der Regel 4-8 Stunden nach der anfänglichen Kultivierung.
3. CHeck der optischen Dichte (600 nm) der Kultur aus dem Auslassschlauch.
4. Starten Sie den Zulaufpumpe (10 ml / h, auf eine Rate von Verdünnung von 0,1 h ^-1 entspricht).
5. Überprüfen Sie die optische Dichte der Kultur bei 600 nm von dem Auslass alle 24 h Schläuche.
6. Betreiben Sie den chemostat für 96 Stunden (9,6-fache Umsatz) oder mehr. Wenn die optische Dichte stabil ist, tauschen Sie das Reservoir, das den hochbelasteten Medium enthält. Wenn die optische Dichte von weniger als 0,2 ist, stoppen Sie die Fütterung Zulaufpumpe für 6 Stunden. Starten Sie den Zulaufpumpe und prüfen, ob die optische Dichte über 0,2 ist.
7. Nach und nach die Konzentration des Stressor erhöhen, indem sie zu einem Reservoir Ändern einer höheren Stressor Konzentration enthält.
8. Nehmen Sie Proben der angepassten Kultur , wenn es einen Meilenstein erreicht (zB ein Stamm angepasst bis 100 g / L Succinat Stress) und Speicher für weitere Genomanalyse.
9. Für die Probenlagerung, mischen Sie die Kulturprobe (0,5 ml) mit einer sterilisierten 80% Glycerin solutiauf (0,5 ml) und lagern Sie es bei -80 ° C.
   Hinweis: Wenn der Mikroorganismus die Fähigkeit erwirbt die Stressoren während der ALE-Verfahren abzubauen, die Stressor Konzentration in der Fermentations Glas wie in der frischen Reservoir ist nicht das Gleiche.

5. Einzelkolonie Isolierung des Stress angepasst Dehnungs

1. Bereiten Agarplattenmedium (1,6% Agar), enthaltend die gleichen Stressor und bei der gleichen Konzentration des Mediums.
2. Platte die Austritts Kultur (0,1 ml) aus dem Chemostat und inkubieren bei 37 ° C für 16 Stunden.
3. Pick einzelne Kolonien von der Platte einen sterilen Zahnstocher und inokulieren sie in 15 ml Teströhrchen das gleiche Stressor enthält, und bei der gleichen mittleren Konzentration wie im Chemostat, und Inkubation für 6 Stunden.
4. 1 ml der Kulturbrühe in einen 250 ml Erlenmeyerkolben mit 50 ml Medium enthält. Ernte 0,5 ml der Kulturbrühe alle 1 h und Messung der OD bei 600 nm. Vergleichen Sie die Wachstumsrate des angepassten strain derjenigen des Wildtyp-Stamm der Stressor gegeben.

Representative Results

Für High-Succinat Stress Anpassung, die Wildtyp - E coli - W3110 - Stamm war in einem Chemostat bei D kultiviert = 0,1 h ^-1 für 270 Tage (Abbildung 2).

Abbildung 2: High-Succinat Stress Anpassung von E. coli W3110 unter Verwendung Chemostat - Kultur. Dünne Pfeile zeigen die Zeiten , bei denen die Konzentration der Stressor erhöht wurde, und die dicken Pfeile zeigen die Zeiten , zu denen Kulturen erhalten wurden. Zahlen mit Pfeile zeigen die Konzentrationen des Stressor, Dinatriumsukzinat Hexahydrat. Die Änderung in der Biomasse während ALE und die Konzentrationen von Stressor dargestellt. Die Figur wurde von J. geändert Biosci. Bioeng ^7. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Eine anfängliche Stressor Konzentration von 30 g / L (Dinatriumsuccinat Hexahydrat) wurde nach und nach erhöht, wenn der Chemostat-Kultur einen stationären Zustand erreicht hat, bis die Konzentration des Stressor 160 g / L. Die adaptierte E. coli DST160 Stamm (tolerant bis 160 g / l Dinatriumsukzinat Stress) wurde nach 270 Tage erworben. Die DST160 Stamm ungehemmtes Wachstum unter Hoch Succinat Stress (160 g / l Stressor) zeigte, während der Vorfahr - Stamm (W3110) fast kein Wachstum zeigten (Abbildung 3).

Abbildung 3: Wachstumskurven der Wildtyp (W3110, weißer Kreis) und angepasst Stamm (DST160, schwarzer Kreis) unter Hoch Succinat Stress Die Abbildung zeigt , dass die angepasste Stamm wuchs ohne Verzögerung unter Hoch Succinat Stressbedingungen während der Wildnis. Typ nicht. Der FehlerBalken zeigen die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Die Figur wurde von J. geändert Biosci. Bioeng ^7. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Mikroorganismen sind in der Lage aufgrund ihrer schnellen Wachstumsrate und der genetischen Vielfalt zu fast allen Umgebungen anzupassen. Adaptive Laborentwicklung ermöglicht Mikroorganismen unter Bedingungen entwickelt, zu entwickeln, die eine Möglichkeit der Auswahl der einzelnen Organismen beherbergt spontane Mutationen bereit, die unter den gegebenen Bedingungen von Vorteil sind.

Die chemostat Technik ist robuster für den folgenden Gründen künstlich angetrieben Evolution als Übertragungstechniken zu erreichen: (a) eine stetige Umgebung - weil Transfertechniken auf Batch-Kulturen basieren entweder auf festen oder in einem flüssigen Medium, die Umgebung der Zellen verändert sich während Batch Kultur, während die Umweltbelastung des chemostat ist stabil; (B) eine größere Bevölkerung und eine kontinuierliche Auswahl - die größere Population der chemostat bietet mehr genetische Vielfalt als die kleinere Population von Transfertechniken. Kontinuierliche Auswahl des chemostat Technik ist ein schneller Weg, die Evolution als intermittierende Auswahl von Transfertechniken zu erreichen. Es ist entscheidend, dass die Chemostat-Kultur nicht von anderen Mikroorganismen während der ALE-Verfahrens kontaminiert werden und aseptischen Bedingungen werden während Chemostat-Kultur erforderlich. Das ALE-Verfahren kann durch Änderungen an Stressoren, wie oxidativer Stress, osmotischen Stress und toxische Produkt Stress verändert werden. Es gibt ein paar technische Einschränkungen ALE durch Chemostatkultur. Entwicklung erfolgt durch Zufall; daher verschiedene Forscher nicht in der Lage sein, das gleiche Ergebnis zu erhalten Evolutions, obwohl die Folgen von Mutationen in Beziehung gesetzt werden können. Eine weitere Einschränkung ist die Auswaschung von Chemostat-Kultur, wenn die Konzentration der Stressor zu schnell erhöht wird. Wenn die Biomasse zu einem bestimmten Betrag (dh OD = 0,2 in diesem Verfahren) , nachdem die Konzentration der Stressor erhöht wird verringert, Verabreichung der Stressor sollte mindestens einige Generationen angehalten werden , umgeben die Belastung der Zeit anzupassen.

Die jüngsten Entwicklungen in der Genomsequenzierungstechnologie haben das Verständnis von Mutationen dazu beigetragen, dass in Reaktion auf bestimmte Stressbedingungen zu entwickeln. Zum Beispiel ändert eine DNA - Mutation eine bestimmte systemische Wirkung, die der gegebenen Umwelt von Vorteil ist (dh Toleranz gegenüber einer toxischen Stressoren). So kann ALE verwendet werden Genfunktion oder Netzregulierung oder als Rohstoff für die "beschleunigte Evolution" zu studieren. ALE Studien sind auch nützlich in der Entwicklung von Antibiotika-resistenten Bakterien zu simulieren, was auf die Mechanismen, mit denen gefährliche arzneimittelresistenten Bakterienstämmen auftreten. Da die Flugbahn der Evolution des Genoms eingraviert ist, die genetischen Veränderungen aufzudecken, die zu den gewünschten Phänotypen (wie Stresstoleranz) führen , ist das nächste Hindernis einmal entwickelte Stämme ⁸ erhalten werden. Zu den aktuell nächsten Generation Sequenzierungstechnologien zur Verfügung, die Illumina und Ion Torrent platFormen sind für den Nachweis von Nukleotidsubstitutionen oder kleine indels geeignet, die in den entwickelten Stämme auftreten, und beide sind erschwinglich. Da in der Regel Variantenerkennung Kurz lesen Abbildung der Referenzsequenzen beinhaltet, ist die Verfügbarkeit der Genomsequenz des Ursprungsstamm von entscheidender Bedeutung. Selbst wenn die Genomsequenz des Gründerstammes aus öffentlichen Datenbanken verfügbar ist, ist es oft wünschenswert, es zu sequenzieren gleichzeitig mit dem entwickelten ein, denn es könnte einige zusätzliche Unterschiede in der tatsächlichen Ausgangsstamm sein. Protokolle für die Mutation Identifizierung sind über das Web oder einer Literaturrecherche ^9,10 leicht zugänglich sind . Zum Beispiel ist BRESEQ eine speziell entwickelte Pipeline für die genomische Analyse von Labor-entwickelten Mikroben nächsten Generation Sequenzierungsdaten ¹¹ verwendet wird . Vergleiche der entwickelten Stämme bei bestimmten Meilensteinen (zum Beispiel in dieser repräsentativen Daten, Wildtyp, DST50, DST100 und DST160) kann die Sequenz des entwickeltem Stamm lieferns und geben einen Einblick in die Folgen eines bestimmten Stressor. Daher Wissen und Anwendungen von ALE Experimente, gekoppelt mit der Systembiologie und die Identifizierung der systemischen Störungsvariablen werden in naher Zukunft zu erwarten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini-chemostat fermentor	Biotron Inc.	-	manufactured by special order
silicon tubing	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.
reservoir jar	Bellco	Media storage bottle	20 L
chemicals	Sigma-Aldrich	-	reagent grade
glucose	Sigma-Aldrich	G5767	ACS reagent
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS reagent, ≥99%
Na2HPO4·2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	ACS reagent, ≥99%
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	230391	ACS reagent, ≥98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	ACS reagent, ≥96%
thiamine·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	reagent grade, ≥99%
Na2·succinate·6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99%