RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.
RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.
RNA-bindende proteiner (RBP'er) udgør omkring 10% af S. cerevisiae-proteiner 1,2 og ca. 15% af pattedyrproteiner 3-5. De er impliceret i mange cellulære processer såsom mRNA post-transkriptionel bearbejdning og regulering, oversættelse, ribosom biogenese, tRNA aminoacylering og modifikation, kromatin remodeling, og mere. En vigtig undergruppe af RBP'er er mRNA-bindende proteiner (mRNPs) 6,7. I løbet af mRNA modning, forskellige RBP'er binder udskrift og mægle sit nukleare forarbejdning, eksport ud af kernen, cellulære lokalisering, oversættelse og nedbrydning 6-8. Således distinkt sæt af RBP'er bundet til en bestemt transkript på noget tidspunkt bestemmer dets forarbejdning og i sidste ende dens skæbne.
Identifikationen af RBP'er forbundet med en mRNA i væsentlig grad kan forbedre vores forståelse af processer bag deres post-transkriptionel regulering. forskellige genetiske, Mikroskopiske, biokemiske og bioinformatik metoder er blevet anvendt til at identificere proteiner involveret i mRNA regulering (gennemgået i 9-11). Men kun nogle få af disse metoder muliggør identifikation af proteiner associeret med en bestemt mål-mRNA. At bemærke er den Gær Tre hybridsystem (Y3H), som anvender mRNA'et af interesse som lokkemad til screening et ekspressionsbibliotek i gærceller. Positive kloner sædvanligvis iagttages gennem en vækst markering eller reporterekspression 12-14. Den vigtigste fordel ved denne fremgangsmåde er det store antal proteiner, der kan scannes i et cellulært miljø og evnen til at måle styrken af RNA-protein-interaktion. Ulemper omfatter det forholdsvis store antal af falsk positive resultater som følge af ikke-specifik binding, og det store potentiale for falske negative resultater, fordi, delvis kommer misfoldning af fusionsproteinet bytte eller lokkemaden RNA.
Et alternativ til den genetiske fremgangsmåde er affinitet purifierkation af RNA med associerede proteiner. Poly A-holdig mRNA'er kan isoleres ved anvendelse af oligo-dT søjler, og deres associerede proteiner detekteres ved massespektrometri. RNA-protein-interaktion er konserveret i dets cellulære kontekst ved tværbinding, hvilket gør kortrækkende kovalente bindinger. Anvendelsen af oligo dT-søjle giver et samlet overblik over hele proteom som er forbundet med nogen poly A-holdige mRNA 3,5,15. Det betyder dog ikke give en liste over proteiner, som er associeret med en særlig mRNA. Meget få metoder til rådighed til at udføre en sådan identifikation. Den PAIR metode indebærer transfektion af nukleinsyre med komplementaritet til mål-mRNA 16,17. Nukleinsyren er ligeledes forbundet med et peptid, der tillader tværbinding til RBP'er i tæt nærhed til samspillet site. Efter tværbinding kan RBP-peptid-nukleinsyre isoleres og underkastes proteomics analyse. For nylig, en aptamer-metode varudmærket anvendes på ekstrakter fra pattedyr cellelinier 18. Et RNA aptamer med forbedret affinitet til streptavidin blev udviklet og fusioneret til en sekvens af interesse (AU-rige elementer (ARE) i dette tilfælde). Den aptamer-ARE RNA blev bundet til streptavidin-perler og blandet med cellelysat. Proteiner, der er forbundet med ARE-sekvensen blev oprenset og identificeret ved massespektrometri (MS). Selv om denne metode har registreret associationer, der opstår uden for de cellulære indstillinger (dvs. in vitro), er det sandsynligt at blive ændret i fremtiden for at introducere de aptamerer i genomet og således muliggøre isoleringen af proteiner associeret med mRNA'et, mens i cellulære milieu (dvs. in vivo). I gær hvor genetiske manipulationer er veletablerede, den hurtige metode (udviklet i Prof. Jeff Gerst laboratorium) giver et billede af in vivo foreninger 19. Rapid kombinerer den specifikke og stærke binding af MS2-kappeprotein (MS2-CP) til MS2-RNA-sekvensen, og streptavidin-bindende domæne (SBP) til streptavidin konjugerede perler. Dette muliggør effektiv oprensning af MS2-mærkede mRNA'er gennem streptavidinkugler. Desuden udtryk for 12 eksemplarer af MS2 sløjfer tillader op til seks MS2-CP'er at binde samtidigt til RNA og øge effektiviteten af sin isolation. Protokollen blev derfor foreslået at muliggøre identifikation af hidtil ukendte mRNA-associerede proteiner, når de eluerede prøverne underkastes proteomics analyse ved massespektrometri.
Vi har for nylig udnyttet RAPID at identificere hidtil ukendte proteiner der er forbundet med gær PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA blev tidligere vist at være associeret med ER-membranen og dens 3'-utranslaterede område (UTR) viste sig at være en afgørende determinant i denne forening 21. Således RBP'er der binder PMP1 3'UTR sandsynligvis spille en vigtig rolle i dens lokalisering. Rapid efterfulgt af væskekromatografy-massespektrometri / massespektrometri (LC-MS / MS) resulterede i identifikationen af mange nye proteiner, der interagerer med PMP1 20. Heri, vi giver en detaljeret protokol af de hurtige metode til vigtige kontroller, der har brug gøres, og tekniske tips, der kan forbedre udbyttet og specificitet.
Forskellige metoder bruger isolering af specifikke mRNA for at identificere deres associerede proteiner 11,34 35. Disse metoder anvendes in vitro og in vivo strategier til at probe RNA-protein interaktioner. In vitro metoder inkuber eksogent transkriberet RNA med cellelysat at indfange RBP'er og isolere RNP komplekser 36,37. En effektiv tilgang af denne type blev præsenteret for nylig, som gjorde det muligt at identificere nye proteiner, der binder en regu…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker professor Jeff Gerst og Boris Slobodin for deres nyttige råd i opsætning af den hurtige protokol og tilvejebringe de nødvendige plasmider. Vi takker også Dr. Avigail Atir-Lande for hendes hjælp med at etablere denne protokol og Dr. Tamar Ziv fra Smoler Proteomics Center for hendes hjælp med LC-MS / MS-analyse. Vi takker Prof. TG Kinzy (Rutgers) for YEF3 antistof. Dette arbejde blev støttet af bevilling 2011013 fra Binational Science Foundation.
Tris | sigma | T1503 | |
SDS | bio-lab | 1981232300 | |
DTT | sigma | D9779 | |
Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
Glycine | sigma | G7126 | |
NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
Heparin | Sigma | H3393 | |
Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
Leupeptin | Sigma | L2884 | |
Aprotinin | Sigma | A1153 | |
Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
Pepstatin | Sigma | P5318 | |
DNase I | Promega | M610A | |
Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
Guanidinium | Sigma | G4505 | |
Avidin | Sigma | A9275 | |
Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
Biotin | Sigma | B4501 | |
Yeast extract | Bacto | 288620 | |
peptone | Bacto | 211677 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
1 x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
0.2 M NaOH | |||
4 x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
RNase-free water | |||
RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
0.5 M EDTA pH 8 | |||
Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |