Introduction
РНК-связывающие белки (ОДП) составляют около 10% от S. CEREVISIAE белки 1,2 и около 15% белков млекопитающих 3-5. Они участвуют во многих клеточных процессах, таких как мРНК пост-транскрипционной обработки и регулирования, перевод, биогенеза рибосом, тРНК аминоацилирования и модификации, хроматина и многое другое. Важной подгруппой ОДП является мРНК-связывающие белки (mRNPs) 6,7. В процессе созревания мРНК, различные ОДП связывают расшифровку и урегулируют свою ядерную переработку, экспорт из ядра, клеточной локализации, трансляции и деградации 6-8. Таким образом, определенный набор ОДП, связанных с конкретным транскрипта в любой момент времени определяет его обработки и в конечном счете его судьба.
Идентификация ОДП, связанных с мРНК может значительно улучшить наше понимание процессов, лежащих в основе их пост-транскрипционной регуляции. Различные генетические, Микроскопические, биохимические и биоинформатики методы были использованы для идентификации белков , участвующих в регуляции мРНК (обзор 9-11). Тем не менее, лишь немногие из этих методов позволяют идентифицировать белки, связанные с конкретной мРНК-мишени. Следует особо отметить Дрожжи Три Гибридная система (Y3H), которая использует мРНК представляют интерес в качестве приманки для скрининга библиотеку экспрессии в клетках дрожжей. Положительные клоны, как правило , наблюдается через выражение выбора роста или репортера 12-14. Основным преимуществом этого метода является большое количество белков, которые можно сканировать в сотовой среде и способность измерения силы взаимодействия РНК-белок. Недостатками включают относительно большое число ложных положительных результатов из-за неспецифического связывания, а также высокий потенциал ложных отрицательных результатов из-за, в частности, до неправильного сворачивания от добычи слитого белка или РНК приманки.
Альтернативой генетического подхода является сродство purifiКатион РНК с его ассоциированных белков. Поли А-содержащий мРНК, могут быть выделены посредством использования олиго дТ колонн, и их ассоциированные белки обнаруживаются с помощью масс-спектрометрии. Взаимодействие РНК-белок сохраняется в клеточном контексте путем сшивания, что делает малой дальности ковалентные связи. Использование олиго дТ колонке дает общее представление о всей протеома , который связан с любым поли - А-содержащей мРНК 3,5,15. Тем не менее, это не дает список белков, которые связаны с определенной мРНК. Очень немногие из них будут доступны для выполнения такой идентификации. Метод ПАР влечет за собой трансфекцию нуклеиновой кислоты с комплементарности мРНК - мишени 16,17. Нуклеиновая кислота также присоединен к пептиду, который позволяет сшивающего ОДП в непосредственной близости от сайта взаимодействия. После сшивания, КПБ-пептид-нуклеиновая кислота может быть выделена и подвергнута анализу протеомики. В последнее время методология аптамеры на основе былауспешно применяется для извлечения из клеточных линий млекопитающих 18. РНК аптамеров с улучшенным сродством к стрептавидином была разработана и слиты с последовательностью, представляющей интерес (АС богатых элемент (ARE), в данном случае). РНК аптамеров-ARE была присоединена к стрептавидином бус и смешивают с лизата клеток. Белки, которые связаны с последовательности были очищены и идентифицированы с помощью масс-спектрометрии (МС). Хотя этот метод обнаружены ассоциации , которые имеют место вне клеточных параметров (то есть, в пробирке), то, вероятно, будет изменен в будущем , с тем , чтобы ввести аптамеров в геном и , таким образом , позволяют выделение белков , ассоциированных с мРНК , в то время как в клеточная среда (то есть, в естественных условиях). У дрожжей, где генетические манипуляции хорошо установлена, экспрессный метод (разработан в лаборатории профессора Джеффа Джерст в) обеспечивает представление ассоциаций 19 в естественных условиях. RAPID сочетает в себе конкретное и сильное связывание белка MS2 пальто (MS2-CP) в РНК последовательности MS2, и на стрептавидин-связывающий домен (СБП) с стрептавидином гранулами, конъюгированными. Это обеспечивает эффективную очистку MS2-меченых мРНК через стрептавидином бусин. Кроме того, выражение 12 копий петель МС2 позволяет использовать до шести MS2-ХП связываться одновременно с РНК и повышение эффективности ее изоляции. Таким образом, этот протокол был предложен для того, чтобы идентифицировать новые мРНК-ассоциированных белков, как только элюированные образцы подвергали анализу протеомики с помощью масс-спектрометрии.
Недавно мы использовали RAPID для идентификации новых белков , связанных с дрожжами Pmp1 мРНК 20. Pmp1 мРНК ранее показано, что связано с ER мембрану и обнаружили , что его 3 'нетранслируемой области (UTR) , чтобы быть главным фактором , определяющим в этой ассоциации 21. Таким образом, ОДП , которые связывают Pmp1 3 'UTR, вероятно, играют важную роль в его локализации. RAPID с последующей жидкостной хроматографY-масс - спектрометрии / масс - спектрометрии (ЖХ-МС / МС) привело к идентификации многих новых белков , которые взаимодействуют с Pmp1 20. Здесь мы приводим подробный протокол методологии RAPID, важные элементы управления, которые должны быть сделаны, и технические советы, которые могут улучшить урожайность и специфичность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Вставьте последовательность, состоящую из 12 MS2-сайты связывания (МС2 петель; MS2L) в желаемый геномного локуса, как правило, между открытой рамкой считывания (ORF), и 3'-UTR. Подробный протокол для такой интеграции обеспечивается в другом месте 22. Проверьте правильность вставки и экспрессии с помощью ПЦР, северного анализа или RT-PCR 20,23. Важно, чтобы убедиться, что интеграция не вмешивались с синтезом 3'UTR. Кроме того, плазмиду , экспрессирующих МС2-СР , слитый с СБП под выражением (истощением метионин) индуцируемый промотор , также должны быть введены в клетки 24. Идентичный штамм, за исключением введенных петель MS12, следует использовать в качестве контроля для обнаружения неспецифических сигналов.
1. Очистка RAPID
- Grow 500 мл дрожжевых клеток (используют 250-1,000 мл дрожжевых клеток в зависимости от уровня экспрессии представляющего интерес гена) , выражающая МС2-меченый мРНК 20 иMS2-CP-GFP-СБП слитый белок от 24 до OD 600 0,8 - 1,0 при 30 о С в соответствующей среде роста (например, синтетический Декстроза (SD) селективной среде).
- Центрифуга клетки при 3000 мкг в течение 4 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
- Промыть клетки в 1X фосфатным буферным солевым раствором (PBS), центрифугируют , как и раньше (шаг 1.2), ресуспендируют в равном объеме (этап 1.1) УР без метионина, и инкубировать в течение 45 - 60 мин при 30 ° С , чтобы вызвать экспрессию MS2 -СР-GFP-СБП слитый белок.
Примечание: Более длительное время индукции может привести к агрегации GFP. - Отложите 10 мл клеток и экстракта РНК из этого образца с использованием простого "горячего фенола" метод 25. Внимание: Фенол является высокотоксичным и должны быть обработаны в соответствии с его инструкциями по технике безопасности.
Примечание: Эта РНК является хорошим ориентиром для качества выделенной РНК (рис 1А). - Для получения 500 мл клеток, добавляют 1,35 мл 37% формальдегида до конечной Concentration 0,1% сшивать РНК-белковых комплексов. Продолжить инкубации при 30 ° С в течение 10 мин. Внимание: Формальдегид обладает высокой токсичностью и должны быть обработаны в соответствии с его инструкциями по технике безопасности.
- Добавить 26,5 мл 2,5 М глицин до конечной концентрации 0,125 М и инкубировать в течение 3 мин, чтобы остановить сшивку. От этого шага дальше, все расставит на льду, чтобы минимизировать деградацию РНК.
- Центрифуга клеток при 3000 мкг в течение 4 мин при 4 ° С и промывали 45 мл холодного 1x PBS.
- Ресуспендируют клеток в 1 мл буфера для лизиса RAPID на 100 мл исходной клеточной культуры.
- Разделить на порции по 500 мкл в завинчивающейся крышкой микроцентрифужных пробирки и добавляют ~ 400 мг охлажденных стеклянных шариков в каждой аликвоты (примерно полная 0,2 мл ПЦР трубки).
- Лизировать клетки в бусинки с насадкой в течение 3 мин. Немедленно поставить лизата на льду.
Примечание: лизис клеток-релизы в клеточные РНКазы, которые являются основной причиной деградации РНК. RAPID буфера для лизиса содержит высокую концентрацию РНКазы inhibitors, такие как неспецифический ингибитор гепарин РНКазы и специфических ингибиторов. Работая быстро и держать все холодным также рекомендуется. - Переносят лизат в новые пробирки. Пирс небольшое отверстие в нижней части каждой трубки с микроцентрифуге горячей иглой (0,8 мм х 40 мм) и поместите микроцентрифуге трубки в верхней части 15-мл пробирки. Используйте голову 5 мл шприца в качестве переходника между микроцентрифужных труб и 15 мл пробирки. Центрифуга сборку труб при 3000 х г в течение 1 мин при 4 ° С ,
- Перенести проточного из 15 мл трубки к новой 1,5 мл пробирку и центрифугируют при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для удаления остатков клеток.
- Бассейн супернатанты от всех 1,5 мл пробирки в одну 15 мл трубку и отложите 1/50 и 1/100 объем лизата для РНК и выделения белка, соответственно.
Примечание: Они будут служить в качестве "Ввод" образцов для последующего анализа (рисунок 1). - Добавьте 300 мкг авидина на 500 мл Initial культуры дрожжей и инкубировать в течение 30 мин (это может быть уменьшено до 10 мин) при температуре 4 ° С при постоянном прокаткой (10 оборотов в минуту).
Примечание: авидин блокирует биотин и биотинилированные белки от связывания с стрептавидином бусин. - Предварительно вымыть стрептавидином шарики до инкубации с лизатом клеток.
- Помещают около 300 мкл стрептавидина бусин суспензии до 1,5 мл трубки микроцентрифужных и снимите верхнюю супернатант. Это приведет к 250 мкл шариков. Вымойте бисером дважды 1 мл буфера для лизиса RAPID. Центрифуга стрептавидином шарики при 660 мкг в течение 2 мин при 4 ° С между каждым шагом.
- Блок бусин путем инкубирования в течение 1 ч с 0,5 мл буфера для лизиса RAPID, 0,5 мл 10 мг / мл бычьего сывороточного альбумина и 10 мкл 10 мг / мл дрожжевой тРНК. Шарики могут быть оставлены O / N в блокирующем растворе при 4 ° С с вращением при необходимости.
- Промыть дважды с 1 мл RAPID буфера для лизиса.
Примечание: магнитные гранулы также могут быть использованы для уменьшения времени и backgrкруглый вырез. Они, однако, имеют меньшую емкость, чем сефарозы.
- Добавьте 250 мкл предварительно вымытых стрептавидином бисером авидин-содержащий лизата (со стадии 1.14) и инкубировать 1 час при 4 ° C с постоянным вращением (10 оборотов в минуту).
Примечание: Это время инкубации представляет собой компромисс между обеспечением достаточного времени связывания и свести к минимуму шансы деградации РНК. - Центрифуга при 660 х г в течение 2 мин при 4 ° С , чтобы очистить стрептавидином шарики и перенести супернатант в новую 15 мл трубки. Отложите 1/50 и 1/100 объема лизата для РНК и белка изоляции, соответственно.
Примечание: Это будут "несвязанные" образцы. - Вымойте бисером с 1 мл RAPID буфера для лизиса, слегка встряхните, переход на новую 1,5-мл микроцентрифужных трубки, и центрифуга, как на этапе 1.17. Повторите этот шаг три раза.
- Вымойте бисером с 1 мл буфера RAPID мыться, и на этот раз вращаться (10 оборотов в минуту) в течение 5 мин при 4 ° С. Повторите этот шаг дважды. Вымойте бисером с 1 мл 1x PBS и центрифуге, как указано выше.
- Вымойте бисером раз с 120 мкл 1x PBS. Центрифуга, как описано выше, и взять на себя всю супернатант для РНК и извлечения белка в качестве образца "Wash".
Примечание: Этот последний образец стирки будет указывать строгость промываний и должна быть того же объема, что и образец элюции. Это упростит обработку и загрузку в последующих анализах. - Для элюирования РНК и РНК-ассоциированных белков из колонки, добавляют 120 мкл 6 мМ биотина в 1X PBS и инкубировали в течение 45 мин при температуре 4 ° С при постоянном вращении (10 оборотов в минуту).
- Центрифуга гранулы, как описано выше, и передать элюированный материал на новый 1,5 мл трубки. Спин элюированный образец снова и перенести верхнюю фазу к новой 1,5 мл трубки, чтобы исключить унос бисера.
- Возьмите образцы для РНК или экстракции белка.
Примечание: Объем взят должен зависеть от следующего анализа и уровень экспрессии РНК или белка, представляющего интерес, В качестве ориентира для северного анализа 26, принять 80% выборки, для Вестерн - блоттинга 23,27 или RT-PCR 28, принять 20%, а для масс - спектрометрии 29 , чтобы обнаружить новые белки, взять весь образец.
2. Экстракция РНК
- Добавить равный объем 2x Сшивание Реверсирование буфера и инкубируют в течение 45 мин при 65 ° С. Продолжить непосредственно для экстракции РНК.
Примечание: сшивающий Реверсирование буфер содержит этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), что существенно повышает экстракции РНК 20. - Используйте стандартный фенол: хлороформ метод 26 для извлечения РНК из "входа" и "несвязанных" образцов (шаги 1.13 и 1.17).
Примечание: Эти образцы содержат большое количество ингибитора РНКазы гепарина, который может ингибировать последующее обратное Transcriptase- (RT) с использованием анализов (например, RT-PCR), поэтому, LiCl осадков 30 рекомендуется , чтобы удалить его. "ВаSH "и" элюции "образцы (шаги 1,21 и 1,24) содержат малые количества РНК и осаждают с помощью следующих шагов. - Добавить равный объем 8M гуанидин-HCl (GuHCl) и два объема 100% этанола к "промывкой" и "вымывания" образцов. Инкубируют при температуре -80 ° С в течение по меньшей мере 2 ч.
Примечание: гуанидин будет эффективно денатурации белков и, таким образом, ингибируют РНКазы и протеазы в образце. - Центрифуга при 20000 х г, 4 ° С в течение 30 мин и отбросить супернатант. Промыть гранулу с холодным 80% этанолом и снова центрифуге при 20000 х г, 4 ° С в течение 15 мин.
- Растворить осадок РНК в 400 мкл РНКазы свободной воды и выпадают в осадок снова, чтобы удалить остатки GuHCl или другие загрязняющие вещества. Добавить 40 мкл 3 М ацетата натрия, рН 5,2 и 800 мкл 100% этанола, инкубируют при -20 & deg; С в течение по меньшей мере 1 ч.
- Центрифуга и мыть, как на стадии 2.4 и удалить все этанол с наконечником 10 мкл. Ресуспендируют РНК Пелли др в 10 мкл РНКазы свободной воды. Соблюдайте особую осторожность, так как осадок РНК, как правило, не видно.
Примечание: Образцы могут быть использованы для Нозерн - анализа , как описано в 23 (фиг.1).
3. Получение белка для Вестерн-блот или масс-спектрометрического анализа
- Добавьте 1/3 объема 4x Laemmli буфера выборок (LSB) для образцов белка и инкубировать 45 мин при 65 ° С, чтобы полностью изменить сшивание РНК и белков.
Примечание: Образцы можно хранить при -20 ° С. - Запуск белки на полиакриламидном геле (SDS-PAGE) 31. Скорректировать процент геля в зависимости от размера белков, которые необходимо проанализировать.
Примечание: 10% гель акриламид дает широкий спектр разделения и хорош в качестве первого приближения. - Перенос белков на мембрану , как в стандартном анализе иммуноблот 27 для контроля эффективности изоляции (Рисунок 1С). Пятно либо кумасси голубым R250 или окрашивания серебром перед анализом масс-спектрометрии.
Примечание: Серебро пятно является предпочтительным выбором , поскольку он является более чувствительным и позволяет лучше обнаружения (рис 1B). Окрашивание можно сделать с помощью либо вручную приготовленных растворов или коммерческих наборов. Время инкубации геля в растворе окончательного красителя должно быть определено экспериментально. Длинные инкубации может выявить низкие обильные белки, но может привести к весьма выраженные белки, такие как MS2-CP-СБП-GFP, чтобы быть более окрашена и могут маскировать окружающие белки в их окрестности. Кроме того, высокий фон может произойти. Внимательно следить за реакцией, и добавить стоп-раствора в соответствующее время. - Вырежьте полосы из геля и передавать их в 1,5 мл пробирки. Образцы хранить при температуре -20 ° С, или отправить для экстракции белка и усвоением трипсина с последующим анализом ЖХ-МС / МС 32.
- В качестве альтернативного подхода протеомического исключить стадию разделения геля, переваривать элюированный материал с шага 1,24 в таклюция с помощью трипсина и с учетом анализа LC-MS / MS 33.
Примечание: Опуская разделение SDS-PAGE упрощает протокол и повышает урожайность. Тем не менее, образцы могут содержать следы моющего средства NP-40, ингибирующего масс-спектрометрический анализ. Чтобы преодолеть эту проблему, выполните следующие действия:- Запуск белка на SDS-PAGE 31 за 10 - 15 мин.
- Вырежьте всю часть переулка (то есть, где белки расположены).
Примечание: образец белка может включать значительное количество белка МС2-CP-SBP, которые могут затенить сигналов низкого белков изобилии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RAPID делает возможным выделение специфической РНК-мишени с ее ассоциированных белков. Критическое для его успеха является сохранение РНК нетронутыми как можно больше, в результате чего получают достаточное количество белков. Для определения эффективности изоляции и качества РНК, Нозерн - анализ выполняется (рисунок 1А). Северный анализ имеет преимущество непосредственно отчетности эффективности и качества стремительной. Таким образом, относительные количества полной длины и продуктов разложения может быть определена за один проход. Рибосомных РНК (рРНК), которые легко обнаружить в окрашивания бромистым этидием, а также отсутствие рРНК в образце элюирования указывает строгость очистки. Жесткость и специфичность очистки дополнительно свидетельствует отсутствие сигнала немаркированного мРНК в образцах элюции (СИГН1 нижняя панель). Кажущаяся сигнал в полосе FPR1, которая не имеет размера ACT1, является пережитком предварительнодущих гибридизацию с зондом MS2L. Северный анализ также показывает, что входной РНК является несколько более деградировали по сравнению с РНК, которые очистили горячим протоколом фенол (C / O ACT1 зонда панели). Это связано с более длительными и сложного RAPID протокола. Тем не менее, значительное количество полнометражных, помеченный РНК выделяют конкретно, как показали сильный сигнал в элюции фракции (MS2L зонд).
Образцы белка могут быть запущены на SDS-PAGE и окрашивали серебром пятна перед анализом протеомики (рис 1B). Образец изолированы от контроля, немаркированные клетки (-MS2L) полезно при различении неспецифических ассоциаций из РНК-зависимых единиц. Таким образом, только полосы, которые сильнее в меченой пробе (+ MS2L) вырезают из геля и принять за LC-MS / MS. Вестерн - анализ с общими ОДП также рекомендуется указывать эффективность белка совместного очистки (рис1С). При этом мы использовали Yef3, который , как известно, взаимодействуют с Pmp1 20 или GFP, что указывает на общую эффективность и специфичность изоляции. Интересно отметить, что эффективность Yef3 изоляции, как представляется, отличаются между Pmp1 и FPR1, и значительно ниже по сравнению с GFP.
Рисунок 1. Удельная Выделение MS2L-меченых РНК и идентификация белков , ассоциированных с . Результаты двух различных РНК , которые были подвергнуты RAPID (Pmp1 и FPR1) представлены. (А) Северный анализ образцов РНК , выделенных из быстродействующего эксперимента блот. РНК подвергали электрофорезу на агарозном геле, и окрашивали бромистым этидием (верхняя панель). Гель переносили на нейлоновую мембрану и подвергали гибридизации с указанными зондами (нижние панели). Исследуемые образцы: быстро лизис клеток (горячий фенол [шаг 1,4]), RaЛизис клеток PID (вход [шаг 1.13]) и после элюирования с биотином (элюирование [стадии 1,24]). (В) Серебро пятно белков из RAPID с MS2-меченых и немаркированные клетки. Образцы белка из элюированных фракций МС2-меченого Pmp1 (+ MS2L) или немаркированной управления (-MS2L) запускались в SDS-PAGE и окрашивали серебром. Полосы с дифференциальной интенсивности (помечены звездочками) вырезали из геля и определяли анализом масс-спектрометрии. Стрелка указывает на гибридный белок MS2-CP-GFP-SBP, который демонстрирует равную нагрузку белка. Ненужные полосы были обрезаны для ясности. (C) Западный анализ положительного контроля. был проведен Вестерн-блот с антителами, которые распознают Yef3 или GFP фрагмент гибридного белка МС2-CP. Ненужные полосы были обрезаны для ясности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Различные методы используют выделение специфических мРНК для выявления связанных с ними белков 11,34 35. Эти методы применяются в пробирке и в естественных условиях стратегий для исследования РНК-белковых взаимодействий. В пробирке методы инкубировать экзогенно транскрипции РНК с лизатом клеток , чтобы захватить ОДП и изолировать RNP комплексы 36,37. Был представлен эффективный подход такого типа в последнее время , что позволило выявить новых белков , которые связываются с регуляторной РНК мотив 18. Недостатком этих методов является связывание неспецифических ОДП , поскольку объединение происходит вне клеточной среды. В естественных условиях методы, в которых белки сшиваются в то время как в естественных условиях, может обеспечить более полное представление о РНК-белок ассоциации. Кроме того, сшивка позволяет более высокую жесткость при изоляции и, следовательно, более высокую специфичность. ПАРЫ подход 17 использует трансфекцию антисмысловойПоследовательность к РНК-мишени, с тем, чтобы направить пептидный фрагмент в непосредственной близости от ОДП. Пептид-ОДП может затем быть сшитым и изолированы с помощью бус, которые связаны с последовательностью, комплементарной антисмысловой последовательности. Методология ПАР очень выгодно из-за его простое приложение для многих типов клеток без необходимости в сложных геномных манипуляций. Это, однако, зависит от эффективности трансфекции, и случаи, когда низкий процент клеток принимают антисмысловой будет иметь низкую эффективность. Кроме того, выделение последовательности РСП-пептид-антисмысловой получают посредством магнитных стрептавидином бусин, которые связаны с биотинилированным олигонуклеотидом, комплементарным антисмысловой нуклеиновой кислоты. Множественность взаимодействий (магнитные шарики, стрептавидин-биотин и спаривания оснований) может ограничить строгость и эффективность изоляции. Стремительное метод , описанный здесь 24 обеспечивает альтернативу этим ограничениям в нескольких аспектах. Во-первых, тон интеграция MS2 петель в геномную локусы гарантирует, что все клетки экспрессируют его, тем самым увеличивая его выход. Во- вторых, она использует высокое сродство взаимодействие MS2-CP-GFP-СБП до двенадцати МС2 последовательностей петли и позволяет им связываться в естественных условиях. В-третьих, фиксация взаимодействия РНК-белок обеспечивает более строгие промывок и уменьшает идентификацию неспецифически связанных белков. И, наконец, домен СБП связывает стрептавидином бусинки с высоким сродством и легко элюирование свободного биотина.
Вставка цикла MS2 в РНК желательно между ORF и 3'-UTR, чтобы свести к минимуму перевода возмущение и обеспечить экспрессию всех петель. От шести до 24 MS2 цикл повторяется ранее использовались для визуализации локализации мРНК 38-40. Тем не менее, введение длинной последовательности MS2 петли могут вызвать изменения в обработке и структуре РНК; это может дестабилизировать транскрипт или изменить репертуар ОДП связанныйк нему. По нашему опыту, 12 петель достаточно , чтобы получить эффективное элюирование MS2-меченой РНК 20. В связи с этим, мы отмечаем, что мы обычно наблюдали дополнительные короткие транскрипты в наших северных скрещиваний. Северный анализ с различных зондов показали , что эти короткие формы включали MS2L и часть 3 'UTR 20, что свидетельствует о преждевременной терминации транскрипции. Такие случаи могут снизить эффективность выделения белков, ассоциированных с UTR 3 '. Таким образом, число вставленных петель и их расположение в пределах РНК должны быть сбалансированы между высокой эффективностью спуском и стабильности транскрипта.
РНК должна оставаться нетронутыми на протяжении протокола для обеспечения эффективной изоляции и обнаружение максимального множества связанных белков. Шансы на внешних загрязнений РНКазы может быть уменьшена в перчатках, обеспечивая чистую рабочую зону, готовя раствор с РНКазы водой, и работает сжатои эффективно сократить время протокола. Тем не менее, мы обнаружили, что наибольший вклад в деградацию РНК является высвобождение клеточных РНКазами к лизата после лизиса клеток. Было предложено криогенного измельчения дрожжевых клеток с механическими результатами мельница в улучшенной очистки РНК 41. Это можно судить в тех случаях, когда наблюдается значительное ухудшение с этим протоколом.
Общим недостатком ниспадающих анализов является выделение многочисленных белков, которые связываются неспецифически с колонкой. Таким образом, применение штамма дрожжей с немаркированной РНК является важным контроль. Этот штамм экспрессирует слитый белок MS2-CP-GFP-SBP для дальнейшего исключения белки, которые связываются с слитого белка и не РНК-мишени. Заметим , что это не исключает белки , которые могут связываться сам цикл MS2, и они нуждаются в дальнейшей проверке с выпадающим анализа белка. Фигура 1В показывает , что мы смогли идентифицировать несколько белков , которые связываютсяконкретно мРНК Pmp1, и некоторые из них были впоследствии подтверждены с помощью совместного анализа IP - 20.
Стремительное методология в настоящее время ограничивается дрожжевых систем, используя свои хорошо зарекомендовавшие конкретных участков методологии интеграции. Сайт конкретных протоколов интеграции в настоящее время разрабатываются для генов в других системах , использующих систему CRISPR-Cas 42,43. Они будут иметь большое значение в расширении использования RAPID дополнительных систем. Другим перспективным применение RAPID для выделения РНК, которые связаны с мРНК, представляющей интерес. Это может быть легко достигнуто, подвергая Выделенное вещество к РНК-последовательность SEQ вместо LC-MS / MS. С учетом важной роли малых РНК в регуляции экспрессии мРНК, это приложение может иметь большое значение. И, наконец, улучшения в масс-спектрометрии (МС) анализ и использование количественных методов, таких как MS SILAC приведет к количественной меры мРНК-связанного Proteiнс при различных условиях. RAPID могут быть использованы с использованием дрожжей , выращенных в средах , обогащенных тяжелыми изотопами , и по сравнению с клетками , выращенных в различных условиях (например, стресс) с немеченых сред 44,45. Применяя экспрессный метод вместе с количественным анализом МС будет давать точные измерения изменений в ПОР репертуара, которые связаны с конкретной мРНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора Джеффа Джерст и Борис Слободин за их полезные советы по настройке Стремительное протокола и предоставления необходимых плазмид. Мы также благодарим доктора Avigail ATIR-Ланде за помощь в создании этого протокола и д-р Тамар Зива из Smoler протеомики Центра за помощь с анализом LC-MS / MS. Мы благодарим профессора Т.Г. Kinzy (Rutgers) для YEF3 антитела. Эта работа была поддержана грантом 2011013 от научного фонда бинасиональ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Acidic Phenol (pH 4.3) | sigma | P4682 | |
| Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3) | sigma | P1944 | |
| Chloroform | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldehyde | Frutarom | 5551820 | |
| Glycine | sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pepstatin | Sigma | P5318 | |
| DNase I | Promega | M610A | |
| Ribonuclease Inhibitor | Takara | 2313A | |
| Glass Beads | Sartorius | BBI-8541701 | 0.4-0.6mm diameter |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Streptavidin Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R8508 | |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Yeast extract | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 1x Phosphate-Buffered saline (PBS) | |||
| 0.2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue. | ||
| Hot phenol lysis buffer | 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.2 | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| RNase-free water | |||
| RaPID lysis buffer | 20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl2, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 µg/ml Leupeptin, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 µg/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease Inhibitor. | ||
| 2x Cross-linking reversal buffer | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID wash buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.5% NP-40 | ||
| 0.5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | For detecting proteins in polyacrylamide gels |
| SD selective medium | 1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine | ||
| Anti-eEF3 (EF3A,YEF3) | Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5,000 | |
| Anti GFP antibody | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3,000 |
| Anti rabbit IgG-HRP conjugated | SIGMA | A9169 | 1:10,000 |
References
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255 (2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae. PloS One. 5, (2010).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, 1393-1406 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46, 674-690 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol Cell. 54, 547-558 (2014).
- Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. RNA processing and its regulation: global insights into biological networks. Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).
- Denman, R. B. mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING. BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15, 203 (2014).
- Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- SenGupta, D. J., et al. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).
- Yosefzon, Y., et al. Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p. RNA. 17, 1479-1488 (2011).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R.
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).
- Bell, T. J., Eberwine, J. Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation. Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes. RNA. 16, 2277-2290 (2010).
- Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner. BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).
- Loya, A., et al. The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein. RNA. 14, 1352-1365 (2008).
- Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast. RNA. 17, 2249-2255 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).
- Slobodin, B., Gerst, J. E. RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes. Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).
- Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).
- Eldad, N., Arava, Y. A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs. Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).
- Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain. J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).
- Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes. Diabetes. 48, 552-556 (1999).
- Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site. FEBS J. 282, 504-520 (2015).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Gundry, R. L., et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).
- Medzihradszky, K. F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).
- Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins. RNA. 5, 1509-1516 (1999).
- Oeffinger, M. Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes. Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).
- Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein. Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).
- Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum. Science. 276, 1128-1131 (1997).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2, 437-445 (1998).
- Aizer, A., et al. Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage. J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5, 14 (2004).
- Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway. Sci Rep. 5, 8572 (2015).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res. 24, 142-153 (2014).
- Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).
- de Godoy, L. M. SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification. Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).
