The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.
Den pattedyr hjerte er storforbruger af ATP og kræver en konstant tilførsel af energi substrater til sammentrækning. Ikke overraskende har ændringer af myocardial metabolisme været knyttet til udviklingen af kontraktil dysfunktion og hjertesvigt. Derfor optrevling sammenhængen mellem metabolisme og sammentrækning skal kaste lys over nogle af de mekanismer, der styrer hjerte-tilpasning eller dårlig tilpasning i sygdomstilstande. Det isolerede rotte hjerte præparat arbejder kan bruges til at følge, samtidig og i realtid, hjerte- kontraktile funktion og flux af energi leverer substrater til oxidative metaboliske veje. Den nuværende protokol til formål at give en detaljeret beskrivelse af de metoder, der anvendes til fremstilling og anvendelse af buffere til kvantitativ måling af satserne for oxidation for glucose og fedtsyrer, den vigtigste energi leverer substrater af hjertet. De til prøveanalyse og datafortolkning metoder er også diskuteret.Kort fortalt er teknikken baseret på levering af 14 C- radiomærket glucose og en 3H-radiomærket langkædet fedtsyre til en ex vivo bankende hjerte via normotermisk krystalloid perfusion. 14 CO 2 og 3 H2O, endelige biprodukter af de enzymatiske reaktioner, der er involveret i udnyttelsen af disse energi leverer substrater, derefter kvantitativt genvindes fra koronar spildevand. Med kendskab til den specifikke aktivitet af de radiomærkede anvendte substrater, er det så muligt at individuelt kvantificere fluxen af glucose og fedtsyre ved oxidationen veje. Kontraktile funktion af det isolerede hjerte kan bestemmes parallelt med den passende kontrolapparatet og direkte korreleret til metaboliske flux værdier. Teknikken er yderst nyttig til at studere metabolismen / sammentrækning forhold som reaktion på forskellige stressbetingelser såsom ændringer i før og efter belastning og iskæmi, et lægemiddel eller et omløbTing faktor, eller efter ændring i ekspressionen af et gen produkt.
Klinisk relevans
I pattedyrs hjerte, er der en stærk positiv sammenhæng mellem fluxen af substrater gennem oxidative metaboliske veje, ATP generation og hjertets arbejde 1. I de seneste to årtier, har undersøgelsen af den indviklede sammenhæng mellem hjerte-stofskifte og funktion førte til at erkende, at ændringer i hjertets stofskifte er en årsag til kontraktile dysfunktion og eventuelt patologisk strukturelle remodeling i fastsættelsen af forskellige typer af hjertesygdomme 2-4. derfor forventes det, at vores forståelse af de mekanismer, der styrer metaboliske ombygning af stressede hjerte vil føre til identifikation af terapeutiske mål for forebyggelse eller behandling af hjertesvigt 5-7. Den nylige offentliggørelse af en videnskabelig redegørelse fra American Heart Association på "Vurdering Cardiac Metabolisme" understreger den voksende interesse for det videnskabelige samfund for thans forskningsfelt 8. Men mens de teknologiske fremskridt i cardiac imaging nu mulighed for en hurtig og præcis vurdering af hjertefunktionen morfologi og funktion, in vivo-undersøgelse af hjertets stofskifte fortsat begrænset og byrdefuld: kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og Positron Emission Tomography (PET) scanning kan anvendes til at følge cardiac høj energi phosphatmetabolisme og Krebs cyklus aktivitet, men disse teknikker er plaget af høje driftsomkostninger og ved deres manglende evne til at bestemme bidraget fra forskellige substrater for oxidativ metabolisme i ligevægtsforhold 9 .For denne dato ex vivo arbejder hjerte forberedelse repræsenterer den eneste og unikke teknik til rådighed til at studere, samtidigt og i realtid, kontraktil funktion og flux af substrater til oxidative metaboliske veje 7,9. Følgende protokol til formål at give retningslinjer i forberedelsen og udnyttelsen af reagenser bruges til at bestemme rottenes af substrater udnyttelse i den isolerede arbejdsmiljø rotte hjerte.
De isolerede Working gnaver Heart Apparatur
Selvom teknikken er næsten et halvt århundrede gamle, det isolerede rottehjerte præparat arbejder stadig et foretrukne metode til kardiovaskulær forskning. Som med Langendorff hjerte forberedelse, arbejdsmiljøet gnaver hjertet tilbyder en relativt simpel, pålidelig og billig måde at måle en bred vifte af hjerteparametre uafhængigt af de forstyrrende virkninger af andre organer, neurohormonale og andre cirkulerende faktorer. Men i modsætning til Langendorff-perfunderet hjerte, arbejdsmiljøet hjertet fortsætter med at udføre næsten fysiologisk hjertets arbejde, en forudsætning for dannelsen af oxidative metaboliske flux til niveauer, der er relevante for in vivo betingelser. Dette opnås ved at levere perfusionen buffer til den venstre ventrikel (LV) via en kanyle forbundet til det venstre atrium, og som LV fylder og udbud, enbuffer udstødes gennem aorta linje mod et bestemt afterload hydrostatisk tryk. Udformningen af perfusion apparat oprindeligt beskrevet af Neely og kolleger 10 blev efterfølgende forbedret ved Taegtmeyer, Hems og Krebs 11, men har ændret sig meget lidt siden da. Som beskrevet i den oprindelige apparat, kan kontraktile funktion vurderes ved bestemmelse af minutvolumen, hjælp ikke flere end graduerede cylindre og et stopur til at måle aorta og koronar strømme 10,11. Flere leverandører nu tilbyde komplette arbejdsmiljø gnaver hjerte perfusion systemer. Disse kommercielt tilgængelige apparater kan erhverves med flowprobes, tryktransducere, et tryk-volumen kateter og alt det nødvendige udstyr til hjerte-funktionel indsamling og analyse af data. Sælgerne giver omfattende dokumentation og kurser til at sætte den nye bruger med deres udstyr. Adskillige oversigtsartikler også detaljer protokoller om arbejdsmiljøet hjerte instrumentation og om brugen af katetre til måling hjertefunktion hos gnavere 12-15. Derfor vil vi kun kort nævne det set-up af perfusion apparater og kontrolapparatet. Den nuværende protokol snarere har til formål at supplere de allerede tilgængelige oplysninger med en beskrivelse af de metoder, der kan gennemføres til samtidig satserne for glucose og langkædede fedtsyrer oxidation, de to store energi leverer substrater i normal hjerte. Vi beskriver her alle de trin, der er involveret i brugen af radioaktivt mærkede energi substrater til vurdering af myokardie oxidativ metabolisme, fra udarbejdelse af reagenser og buffere til genopretning og behandling af prøver, til dataanalyse.
Principper for metoden
Cardiomyocytter generere hovedparten af deres energi til kontraktion fra den oxidative phosphorylering af fedtsyrer (hovedsageligt langkædede fedtsyrer) og carbohydrater (glucose og lactat). Hjertet har meget begrænset energiske reserver og er afhængig af en konstant tilførsel af disse energi leverer substrater fra cirkulationen. Katabolismen af glucose gennem den glycolytiske pathway giver pyruvat, som derefter decarboxyleres ved pyruvatdehydrogenase-kompleks af den indre mitokondrielle membran. Langkædede fedtsyrer, udvundet af cirkulerende albumin eller lipoprotein triglycerider, først aktiveres til acyl-CoA-molekyler i cytosolen og derefter transporteres inde i mitochondriematricen gennem carnitin shuttle at indtaste beta-oxidation pathway. Acetyl-CoA molekyler fremstillet ved katabolismen af glucose og fedtsyrer brændstof Krebs cyklus til at generere de reducerende ækvivalenter (NADH og FADH 2), der anvendes af elektrontransportkæden at bygge proton-motorkraft tværs den indre mitokondrielle membran og generere ATP gennem aktiviteten af ATP syntase. Vand og kuldioxid er de endelige biprodukter afde enzymatiske reaktioner, der finder sted inde i Krebs cyklus. Levering af 14 C- og 3H-radioaktivt mærkede substrater (såsom 14C-radiomærket glucose og 3H-radiomærket oliesyre) til isolerede arbejder hjerte vil følgelig føre til produktion af 14 CO 2 og 3 H2O, som kan kvantitativt udvindes fra koronar spildevand. Indsamlingen af 14 CO 2 udføres ved at holde den isoleret perfunderet hjerte i en forseglet kammer og ved straks udvinding af koronar spildevand, idet den forlader hjertet. En lille anionbyttersøjle bruges til at adskille og genvinde 3 H2O fra koronar spildevand. Radioaktiviteten af de behandlede prøver måles med en væskescintillationstæller, og med kendskab til den specifikke aktivitet af radioaktivt mærkede substrater anvendes, er det så muligt at individuelt kvantificere fluxen af glucose og fedtsyre ioxidation veje 16,17.
Den foregående protokol beskriver de metoder til samtidig kvantificering fluxen af substratet gennem glucose oxidation og fedtsyreoxidation i det isolerede arbejdsdag rotte hjerte. Målingerne kan derefter oven på de optagne cardiac funktionelle parametre for at bestemme forholdet mellem substrater stofskifte og hjerte arbejde under baseline og stress betingelser (ændring i arbejdsbyrden, iskæmi-reperfusion, etc …). Det er også muligt at vurdere, hvordan stofskiftet / sammentrækning forhold påvir…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
10X Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
20 mL Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
20 mL HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |