We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.
Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons.
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.
In accordance with the World Health Organization, 360 million people worldwide suffer from hearing loss with profound consequences on professional and private life. Hearing aids can restore sensory function in moderate forms of hearing loss; however, for the most severe cases, the most effective treatment option is a prosthetic device called a cochlear implant (CI). CIs contain a linear electrode array of up to 24 electrodes, which is surgically inserted into the scala tympani of the cochlea. The electrodes directly stimulate the spiral ganglion neurons, forming the auditory nerve 1.
With more than 300,000 devices implanted worldwide, CIs are very successful medical implants and rank among the most cost-effective procedure ever reported. Despite its success the cochlear implant still has limitations such as reduced frequency resolution compared to physiological hearing. This can lead to deficits in effective communication in groups or noisy environments, and the ability to decipher very complex sounds such as music. This reduced frequency resolution is likely due to the gap between the CI electrodes and the spiral ganglion neurons, leading to stimulation of large groups of neurons. This gap is in the range of hundreds of micrometers 2,3. Elimination of this gap would facilitate the stimulation of smaller groups of neurons per electrode, thereby increasing frequency resolution and overall performance of the device 4.
To study the influence of the gap between the electrode and the neuron and the effect of various optimized stimulation protocols, we have developed an in vitro bioassay based on a non-invasive electrophysiological characterization of SGNs on multi electrode arrays (MEAs) 5. Additionally, MEAs can be easily modified to vary electrode shape, size, material and surface roughness, to optimize the neuron-electrode interface. The following is a step-by-step protocol to reproducibly obtain recordings from murine spiral ganglion neuron cultures and assess the dependency on the above-mentioned parameters.
Protokollen beskrevet her viser, hvordan man kultur SGN eksplantater på MEA og vurdere SGN aktivitet ved ekstracellulære non-invasive optagelser. Denne platform og protokollen, vi har for nylig udviklet 5 lette identifikation af nye stimulation protokoller og elektrode materialer resulterer i reducerede energibehov for at aktivere SGN, med potentiel interesse for den videre gennemførelse af cochlear implantater og andre neuro-proteser. Flere forholdsregler i den præsenterede procedure er grundlæggende for udførelsen af nøjagtige og reproducerbare eksperimenter.
Omhyggelig dissektion af spiralen ganglion og videre håndtering af den primære væv kræver særlig forsigtighed. er blevet udført disse eksperimenter under anvendelse C57 / BL6-mus mellem 5 og 7 dage gammel. Lignende resultater blev opnået under anvendelse af Wistar-rotter i samme aldersgruppe, (data ikke vist). Vi mener, at dette er den bedste alder for fine dissektion som cochlear knogle er stadig blød dadybdegående for nem fjernelse af pincet, og den spiral ganglion og organ Corti let kan adskilles uden brud dendritceller processer eller SGN SOMA. I en tidligere alder vævet er for blød og chancerne for at rippe SGN SOMA sammen med cortiske organ er højere, mens på senere trin, hærdning af den benede kapsel af cochlea øger risikoen for at beskadige vævet, mens dissekere. Korrekt isolering af SG samt omhyggelig afskæring af eksplantaterne er kritisk. Disse bør være i området fra 200-500 um i størrelse til at maksimere binding til MEA overflade og til at have tilstrækkeligt antal SG SOMA i eksplantaterne, hvorfra neuritter vil regrow. At øge neurotrofisk støtte i de første dage af kultur, er frisk BDNF tilføjet dagligt og orglet af Corti er placeret i co-kultur.
Hastigheden af dissektion er også vigtig. bør alle trin udføres hurtigt og under anvendelse iskolde opløsninger for at minimere forringelse væv. Dettid mellem eutanasi og placere eksplantatet på MEA bør være mellem 10-15 min og er afgørende for vellykket kulturer. Har alle værktøjer klar, for at undgå forsinkelser i kultur plating.
Alle foranstaltninger, herunder fine dissektion, vedligeholdelse af kulturen og forberedelse af mellemstore og udstyr udføres under sterile forhold. Når coating af MEA med ECM løsning er det vigtigt at tø det på is og bruge iskold pipettespidser og iskoldt medium som ECM mix geler ved højere temperaturer. Ved placering eksplantaterne på multilaterale miljøaftaler, først tilføje mellemlang til elektrodestoffet efterfølgende placere eksplantaterne. Hvis der tilsættes mediet i et andet trin, eksplantater tendens til at løsne sig fra MEA grund forskydningsspænding. Fordi små volumener af medium anvendes til kulturen i første 5 dage, fordampning af dyrkningsmediet skal minimeres. Derfor er det stærkt anbefales at skabe et fugtigt kammer ved hjælp af små petriskåle indeholdende PBS i tæt Proximity til MEA'er.
De her beskrevne eksperimenter blev udført ved hjælp af kommercielt tilgængelige MEA elektroder med specifikke elektrode dimensioner, belægningsmaterialer og intra afstand elektrode (som beskrevet i punkt 2, Note). Dyrkningsbetingelserne er optimeret her for at maksimere neuronal dækning af den specifikke elektrode gitter design. Det er muligt, at andre konfigurationer af elektrodeafstanden, geometrier og overflader kan kræve forskellige belægninger eller celledensiteter. Disse trin kan kræve indledende fejlmelding for at opnå kulturer med høj densitet.
Hvad angår de elektrofysiologiske optagelser, før start optagelserne kulturen overføres fra dyrkningsmedium ved 37 ° C til ekstracellulær opløsning ved stuetemperatur. For at undgå ustabile optagelser, vente i ca. 10 minutter for at tillade kulturen at stabilisere sig. Når stimulere kulturen, bør særlig forsigtighed anvendes i valg af stimulussom store amplituder (> 3 V) og varigheder kan forårsage skade på kulturen. For en reference om stimulation puls former og varighed se reference 5.
For dataindsamlings- og behandlingsudstyr hjemmelavet hardware (indspilning kammer, forbindelser til forstærkerne og forstærkere) blev anvendt og specifikke analyse programmer blev valgt (se Material tabel, punkt 7). andre kommercielle MEA opsætninger og andre software pakker er imidlertid velegnet som godt for disse operationer. Vi har tidligere vurderet svarene fra vores kulturer på 3 forskellige tidspunkter og viste en øget aktivitet med langvarig kultur tid 5. Her foreslår vi 18 dage in vitro til optagelser. MEA systemer muliggør kontinuerlige optagelser i sterile, fugtige kamre, kunne lette identifikationen af de optimale tidspunkter for hver kultur type.
En væsentlig ulempe ved denne bioassay er den høje variation i than antal elektroder pr kultur, der viser respons på stimulering. Denne hastighed af reaktionerne på stimulering afhænger hovedsagelig af fire faktorer: densiteten af neuritter i kulturen, kontakterne mellem neuritter og elektroderne, diameteren af neuritter eller bundter neuritter, og impedansen af elektroderne. Med hensyn til neurit densitet, kan kun neuritter, der vokser over mindst to elektroder anvendes til stimulering eksperimenter. Kontakten mellem neuritter og elektroder afhænger af det omgivende væv, der kan på den ene side isolere neuritter fra elektroden, og dermed forværre kontakt, eller, på den anden side, isolere neuritter og elektroden fra det omgivende bad og således forbedre kontakten. Vævstæthed, samt neurit størrelse, er defineret af den anvendte eksplantatet og dyrkningsbetingelserne. Dissocierede neuronale kulturer er også blevet testet med succes, men neuronal tæthed i disse kulturer er meget lavere, hvilket resulterer i et reduceret antal recording elektroder. cellekulturen bør derfor tilpasses til den specifikke videnskabelige spørgsmål, der skal løses.
Endelig er impedansen af elektroderne hovedsagelig givet ved størrelsen og overfladen af elektroderne. Materialer og skaber en stor overflade, såsom sort platin, som vist i figur 3, begrænse den impedans af elektroderne kan også forbedre koblingen mellem elektroder og neuritter 7-9.
Strategier til forbedring af succesraten for stimulation omfatter derfor optimering af dyrkningsbetingelserne, stigningen i det samlede antal elektroder eller elektroder tæthed og modulationen af elektrodeoverfladen 10.
Hidtil havde elektrofysiologisk karakterisering af SG neuroner blevet udført under anvendelse af patch clamp-teknikker. Dette giver mulighed for intracellulære optagelser af aktionspotentialer og detaljeret analyse af intracellulære ionstrømme frasingle neuroner. Her præsenterer vi et in vitro bioassay, der kan bruges til at studere aktivitetsprofiler af spiralganglieneuroner neuroner ved at analysere spontan aktivitet eller reaktioner på ekstracellulær stimulering af mange neuroner samtidigt. Derudover kan vekselvirkningen mellem elektroden og spiralganglieneuroner neuroner undersøges og optimeres ved anvendelse af modificerede eller nye materialer. Endelig, hvis der ikke er vist her, denne platform kan anvendes i kombination med en ekstern elektrode, der er monteret på en mikromanipulator som for nylig vist ved vores gruppe 5, for at undersøge forholdet mellem afstanden af den stimulerende elektrode og kultur aktivitet. Alle disse hidtil ukendte aspekter tillade efterligning af de vigtigste funktioner af cochlear implant elektroder kan føre til udformning af hidtil ukendte proteseindretninger.
Vores model er et meget nyttigt in vitro værktøj til at undersøge strategier til forbedring af effektiviteten af stimuleringen af auditive neuroner og yderligere optimize CI-teknologi. Når teknikken er mestret, kunne man forestille screening for ændring af en række variabler: a) forskellige neuronale populationer, b) forskellige elektrode materialer / størrelse / impedanser c) udføre kroniske eksperimenter for at teste materiale toksicitet eller elektrode-stimulation induceret toksicitet, som kunne kaste lys over mere sikre og mere effektive stimulation protokoller ved in vivo elektrode arrays.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Ruth Rubli ved Fysiologi Institut ved universitetet i Bern, Schweiz til værdifuld teknisk hjælp til forsøgene. Dette arbejde blev støttet delvist af EU-FP7-NMP-programmet (tilskudsaftale nr 281.056; -projektet NANOCI – www.nanoci.org.).
culture medium | |||
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
extracellular solution (pH 7.4) | |||
NaCl | 145mM | ||
KCl | 4mM | ||
MgCl2 | 1mM | ||
CaCl2 | 2mM | ||
HEPES | 5mM | ||
Na-pyruvate | 2mM | ||
Glucose | 5mM | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
blocking solution | |||
PBS | Invitrogen | 10010023 | |
BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunostaining solutions | |||
TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
DAPI | Sigma | D9542 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
plastic/tools | |||
petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Labview | National Instruments | Switzerland | |
IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |