We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.
Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons.
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.
In accordance with the World Health Organization, 360 million people worldwide suffer from hearing loss with profound consequences on professional and private life. Hearing aids can restore sensory function in moderate forms of hearing loss; however, for the most severe cases, the most effective treatment option is a prosthetic device called a cochlear implant (CI). CIs contain a linear electrode array of up to 24 electrodes, which is surgically inserted into the scala tympani of the cochlea. The electrodes directly stimulate the spiral ganglion neurons, forming the auditory nerve 1.
With more than 300,000 devices implanted worldwide, CIs are very successful medical implants and rank among the most cost-effective procedure ever reported. Despite its success the cochlear implant still has limitations such as reduced frequency resolution compared to physiological hearing. This can lead to deficits in effective communication in groups or noisy environments, and the ability to decipher very complex sounds such as music. This reduced frequency resolution is likely due to the gap between the CI electrodes and the spiral ganglion neurons, leading to stimulation of large groups of neurons. This gap is in the range of hundreds of micrometers 2,3. Elimination of this gap would facilitate the stimulation of smaller groups of neurons per electrode, thereby increasing frequency resolution and overall performance of the device 4.
To study the influence of the gap between the electrode and the neuron and the effect of various optimized stimulation protocols, we have developed an in vitro bioassay based on a non-invasive electrophysiological characterization of SGNs on multi electrode arrays (MEAs) 5. Additionally, MEAs can be easily modified to vary electrode shape, size, material and surface roughness, to optimize the neuron-electrode interface. The following is a step-by-step protocol to reproducibly obtain recordings from murine spiral ganglion neuron cultures and assess the dependency on the above-mentioned parameters.
प्रोटोकॉल यहाँ बताया कि कैसे विदेश मंत्रालय पर संस्कृति एसजीएन explants करने और बाह्य गैर इनवेसिव रिकॉर्डिंग द्वारा एसजीएन गतिविधि का आकलन से पता चलता है। इस मंच और प्रोटोकॉल हम हाल ही में विकसित किया है 5 एसजीएन सक्रिय करने के लिए, कर्णावत प्रत्यारोपण और अन्य न्यूरो कृत्रिम अंग के आगे कार्यान्वयन के लिए संभावित दिलचस्पी के साथ उपन्यास उत्तेजना प्रोटोकॉल और इलेक्ट्रोड सामग्री कम ऊर्जा आवश्यकताओं में जिसके परिणामस्वरूप की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। प्रस्तुत की प्रक्रिया में कई सावधानियों सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगों की सिद्धि के लिए मौलिक हैं।
सर्पिल नाड़ीग्रन्थि और प्राथमिक ऊतक के आगे से निपटने की सावधानी से विच्छेदन विशेष सावधानी की आवश्यकता है। इन प्रयोगों वर्ष 5 और 7 दिनों के बीच C57 / BL6 चूहों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है। इसी तरह के परिणाम एक ही उम्र सीमा में Wistar चूहों का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे, (डेटा) नहीं दिखाया। हम मानते हैं कि यह ठीक विच्छेदन के लिए सबसे अच्छा उम्र के रूप में है कर्णावत हड्डी अभी भी en नरम हैough संदंश द्वारा आसानी से हटाने, और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि और Corti के अंग के लिए आसानी से डेन्ड्राइट प्रक्रियाओं या एसजीएन somas rupturing बिना अलग किया जा सकता है। पहले उम्र में ऊतक भी नरम है और संभावना है कि एसजीएन चीर करने के लिए एक साथ somas Corti के अंग के साथ अधिक है, जबकि बाद के चरणों में, कोक्लीअ की बोनी कैप्सूल का सख्त ऊतकों को नुकसान पहुँचाए, जबकि विदारक का खतरा बढ़ जाता है। एसजी के समुचित अलगाव के रूप में अच्छी तरह से explants से सावधान काटने के लिए महत्वपूर्ण है। ये रेंज में के आकार में 200-500 माइक्रोन विदेश मंत्रालय की सतह के लिए लगाव को अधिकतम करने और explants, जिसमें से neurites regrow होगा एसजी somas की पर्याप्त संख्या के लिए किया जाना चाहिए। संस्कृति के प्रारंभिक दिनों में neurotrophic समर्थन बढ़ाने के लिए, ताजा BDNF दैनिक जोड़ा जाता है और Corti के अंग सह संस्कृति में रखा गया है।
विच्छेदन की गति भी महत्वपूर्ण है। सभी चरणों का आदेश ऊतक गिरावट को कम करने के लिए तेजी से और बर्फ के ठंडे समाधान का उपयोग किया जाना चाहिए।इच्छामृत्यु और विदेश मंत्रालय पर explant रखने के बीच समय 10-15 मिनट के बीच होना चाहिए और सफल संस्कृतियों के लिए महत्वपूर्ण है। संस्कृति चढ़ाना में देरी से बचने के लिए सभी उपकरण तैयार है।
ठीक विच्छेदन, संस्कृति के रखरखाव और मध्यम और उपकरणों की तैयारी सहित सभी कदम, बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है। जब ईसीएम समाधान के साथ विदेश मंत्रालय कोटिंग यह बर्फ पर पिघलना करने के लिए और उच्च तापमान पर ठंडा पिपेट सुझावों और ईसीएम मिश्रण जैल के रूप में ठंडा माध्यम का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। जब Meas पर explants रखने, पहले, इलेक्ट्रोड क्षेत्रों के लिए मध्यम जोड़ने बाद में explants जगह है। मध्यम चरण में एक दूसरे से जोड़ा जाता है, तो explants विदेश मंत्रालय से की वजह से तनाव कर्तन को अलग करने के लिए करते हैं। मध्यम की छोटी मात्रा में पहले 5 दिनों में संस्कृति के लिए लागू कर रहे हैं क्योंकि, संस्कृति के माध्यम से वाष्पीकरण कम से कम हो गया है। इसलिए यह अत्यधिक एक humidified कक्ष छोटे पेट्री बंद Proxim में पीबीएस युक्त व्यंजन का उपयोग कर बनाने के लिए सिफारिश की हैMeas को अल्पसंख्यक।
यहाँ वर्णित प्रयोगों विशिष्ट इलेक्ट्रोड आयाम, कोटिंग सामग्री और इंट्रा इलेक्ट्रोड दूरी (2 में वर्णित के रूप में, नोट) के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विदेश मंत्रालय इलेक्ट्रोड का उपयोग प्रदर्शन किया गया। संस्कृति शर्तों के क्रम में विशिष्ट इलेक्ट्रोड ग्रिड डिजाइन के neuronal कवरेज को अधिकतम करने के लिए यहाँ अनुकूलित किया गया है। ऐसा नहीं है कि इलेक्ट्रोड रिक्ति, geometries और सतहों की अन्य विन्यास विभिन्न कोटिंग्स या सेल घनत्व की आवश्यकता हो सकती संभव है। ये कदम प्रारंभिक समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती आदेश में उच्च घनत्व संस्कृतियों को प्राप्त करने में।
electrophysiological रिकॉर्डिंग के संबंध में, रिकॉर्डिंग संस्कृति आरटी पर कोशिकी समाधान करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के माध्यम से स्थानांतरित कर रहा है शुरू करने से पहले। आदेश अस्थिर रिकॉर्डिंग से बचने के लिए, लगभग 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा संस्कृति को स्थिर करने की अनुमति है। जब संस्कृति उत्तेजक, विशेष रूप से सावधानी प्रोत्साहन के चयन में इस्तेमाल किया जाना चाहिएके रूप में बड़े आयाम (> 3 वी) और durations संस्कृति को नुकसान हो सकता है। उत्तेजना पल्स आकार और अवधि के विषय में एक संदर्भ के लिए संदर्भ 5 देखते हैं।
डाटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण घर का बना हार्डवेयर (रिकॉर्डिंग कक्ष, एम्पलीफायरों और एम्पलीफायरों के लिए कनेक्शन) के लिए इस्तेमाल कर रहे थे और विशिष्ट विश्लेषण कार्यक्रमों का चयन किया गया है (देखें सामग्री तालिका, बिंदु 7)। हालांकि, अन्य वाणिज्यिक विदेश मंत्रालय setups और अन्य सॉफ्टवेयर संकुल इन कार्यों के लिए भी अनुकूल हैं। हम पहले 3 अलग अलग समय बिंदुओं पर हमारी संस्कृति की प्रतिक्रियाओं का आकलन किया और लंबे समय तक संस्कृति समय 5 के साथ एक वृद्धि की गतिविधि से पता चला है। यहाँ हम रिकॉर्डिंग के लिए इन विट्रो में 18 दिनों के सुझाव देते हैं। विदेश मंत्रालय बाँझ, humidified कक्षों में सतत रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति प्रणाली, प्रत्येक संस्कृति प्रकार के लिए इष्टतम समय बिंदुओं की पहचान की सुविधा सकता है।
इस bioassay की एक बड़ी खामी टी में उच्च भिन्नता हैवह संस्कृति के अनुसार इलेक्ट्रोड है कि उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं को दिखाने की संख्या। उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं की यह दर मुख्य रूप से चार कारकों पर निर्भर करता है: संस्कृति में neurites का घनत्व, neurites और इलेक्ट्रोड, neurites या neurites बंडलों के व्यास, और इलेक्ट्रोड के प्रतिबाधा के बीच संपर्कों। neurite घनत्व के बारे में, केवल neurites कि कम से कम दो इलेक्ट्रोड के साथ बढ़ती उत्तेजना प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। neurites और इलेक्ट्रोड के बीच संपर्क के आसपास के ऊतक है कि एक हाथ पर, संपर्क खराब हो, या दूसरे हाथ पर, इलेक्ट्रोड से neurites अलग कर सकते हैं, और इस तरह neurites और आसपास के स्नान से इलेक्ट्रोड को अलग-थलग करने और इस प्रकार में सुधार पर निर्भर करता है संपर्क। ऊतक घनत्व, साथ ही neurite आकार, explant का इस्तेमाल किया और संस्कृति की स्थिति से परिभाषित कर रहे हैं। अलग neuronal संस्कृतियों भी सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है, लेकिन इन संस्कृतियों में neuronal घनत्व काफी कम है, सिफारिश की संख्या कम है, जिसके परिणामस्वरूपrding इलेक्ट्रोड। इसलिए सेल संस्कृति विशिष्ट वैज्ञानिक सवाल को संबोधित किया जा करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
अंत में, इलेक्ट्रोड का मुक़ाबला मुख्य रूप से आकार और इलेक्ट्रोड की सतह द्वारा दिया जाता है। सामग्री, इस तरह के काले प्लैटिनम के रूप में एक बड़े सतह बनाने के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है, इलेक्ट्रोड के प्रतिबाधा कम हो भी इलेक्ट्रोड और neurites 7-9 के बीच युग्मन सुधार हो सकता है।
उत्तेजना की सफलता की दर में सुधार करने के लिए रणनीतियाँ इसलिए संस्कृति की स्थिति के अनुकूलन, कुल इलेक्ट्रोड या इलेक्ट्रोड घनत्व की संख्या में वृद्धि और इलेक्ट्रोड सतह 10 के मॉडुलन शामिल हैं।
अब, एसजी न्यूरॉन्स की electrophysiological लक्षण वर्णन पैच दबाना तकनीक का उपयोग किया गया था। इस कार्रवाई की क्षमता के intracellular रिकॉर्डिंग और से intracellular आयनिक धाराओं के विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता हैएकल न्यूरॉन्स। यहाँ हम इन विट्रो bioassay है कि एक साथ कई न्यूरॉन्स की बाह्य उत्तेजना के लिए सहज गतिविधि या प्रतिक्रिया का विश्लेषण करके सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की गतिविधियों प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उपस्थित थे। इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोड और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स के बीच बातचीत का अध्ययन किया और संशोधित या नई सामग्री के आवेदन के द्वारा अनुकूलित किया जा सकता। अंत में, भले ही यहां नहीं दिखाया गया है, इस मंच संयोजन में एक बाहरी इलेक्ट्रोड के साथ प्रयोग किया जा सकता है, एक micromanipulator पर घुड़सवार के रूप में हाल ही में हमारे समूह 5 से दिखाया गया है, उत्तेजक इलेक्ट्रोड और संस्कृति गतिविधि की दूरी के बीच संबंध का अध्ययन करने के क्रम में। इन सभी पहलुओं के लिए उपन्यास कर्णावत प्रत्यारोपण इलेक्ट्रोड की प्रमुख विशेषताओं में से नकल उतार उपन्यास कृत्रिम उपकरणों के डिजाइन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं अनुमति देते हैं।
हमारे मॉडल एक बहुत ही श्रवण न्यूरॉन्स और आगे सेशन की उत्तेजना की प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए रणनीति की जांच करने के लिए इन विट्रो उपकरण में उपयोगी हैtimize सीआई प्रौद्योगिकी। एक बार जब तकनीक में महारत हासिल है, एक चर के एक नंबर के संशोधन के लिए स्क्रीनिंग की कल्पना कर सकता है: एक) विभिन्न neuronal आबादी, ख) अलग इलेक्ट्रोड सामग्री / आकार / impedances ग) पुरानी प्रयोगों प्रदर्शन सामग्री विषाक्तता या इलेक्ट्रोड उत्तेजना प्रेरित विषाक्तता परीक्षण करने के लिए है, जो इन विवो इलेक्ट्रोड सरणियों द्वारा सुरक्षित और अधिक प्रभावी उत्तेजना प्रोटोकॉल पर प्रकाश डाला सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों प्रयोगों के साथ मूल्यवान तकनीकी मदद के लिए बर्न, स्विट्जरलैंड के विश्वविद्यालय के फिजियोलॉजी विभाग में रुथ Rubli धन्यवाद। इस काम के लिए यूरोपीय संघ-FP7-एन एम पी कार्यक्रम (।; – Www.nanoci.org परियोजना NANOCI अनुदान समझौते के कोई 281,056) द्वारा समर्थित किया गया था।
culture medium | |||
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
extracellular solution (pH 7.4) | |||
NaCl | 145mM | ||
KCl | 4mM | ||
MgCl2 | 1mM | ||
CaCl2 | 2mM | ||
HEPES | 5mM | ||
Na-pyruvate | 2mM | ||
Glucose | 5mM | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
blocking solution | |||
PBS | Invitrogen | 10010023 | |
BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunostaining solutions | |||
TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
DAPI | Sigma | D9542 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
plastic/tools | |||
petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Labview | National Instruments | Switzerland | |
IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |