초파리와 포유류의 조혈 시스템은 조혈을 연구하기 위해 초파리에게 매력적인 유전 적 모델을 만들고, 많은 일반적인 기능을 공유 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 면역 조직 화학의 주요 애벌레 조혈 기관의 해부 및 장착을 보여줍니다. 우리는 또한 순환 혈구 세포와 고착 결정 세포 등 다양한 애벌레 조혈 구획을 분석하는 방법을 설명합니다.
많은 유사점. 초파리 포유류 적응 면역 특성화 림프 혈통 부족에도 초파리 및 포유류 조혈 시스템 간에는 초파리 및 포유류 조혈 여러 혈액 세포 계통을 생성 시공간적 가지 단계에서 발생한다. 두 시스템 확장하거나 성숙한 계통을 대체 할 수있는 혈액 세포 전구 세포의 저수지를 유지한다. 조혈 시스템은 초파리와 포유류에 대응하는 면역 도전에 적응 할 수 있습니다. 중요한 것은, 생성, 유지 보수 및 조혈 시스템의 기능을 조절하는 전사 규제 및 신호 전달 경로는 포유류에 파리에서 보존된다. 이러한 유사성은 초파리 유전자 모델 개발 및 조혈 질환에 사용될 수 있도록.
여기에 우리 세부 분석은 초파리 애벌레의 조혈 시스템을 검사합니다. 에서특히, 우리는 혈액 세포 수와 농도를 측정하는 생체 내에서 특정 성숙한 혈통 시각화 및 순환과 조혈 기관의 혈액 세포에서 면역 조직 화학 법을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 유전자 발현의 변화 및 신호, 생존, 증식 및 분화를 포함하는 세포 과정을 공개하고 조혈에 대한 질문의 다양성을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 초파리 가능한 유전 도구와 결합 된 분석 방법은 정의 된 유전자 변형시의 조혈 시스템을 평가할 수있다. 특히 여기에 설명되지는 않았지만, 이러한 분석법은 조혈 시스템의 감염이나식이 요법 등의 환경 변화의 영향을 조사하는데 사용될 수있다.
혈액 학적 질환의 조혈 시스템의 개발 및 그 고장 좌표 전사 인자 및 신호 전달 경로를 조절 복잡한 메커니즘이 제대로 이해 남아. 이러한 전사 인자 및 신호 경로뿐만 아니라, 그 조절은 매우 초파리 및 포유류 조혈 1-5 사이에 보존된다. 따라서 초파리 조혈 시스템은 조혈 및 기저 혈액 질환을 제어하는 분자 메커니즘을 정의하는 우수한 유전 모델을 나타낸다.
포유 동물과 유사하게, 초파리는 조혈의 공간적 및 시간적으로 별개의 단계에서 혈구 불리는 혈액 세포를 생성. 전통적으로, 초파리의 조혈는 배아 중배엽과 애벌레 림프 글 랜드에서 단계로 제한 될 것으로 생각되었다. 조혈 또한 애벌레 정착 클러에서 발생하는 최근의 연구는 증거를 제공sters과 6-8 복부 성인이다. plasmatocytes 및 액정 셀 모든 조혈 상 성숙 혈구 세포의 두 가지 유형을 생성한다. Plasmatocytes은 식균 작용, 선천성 면역, 및 상처 치유에 관여하는 대 식세포와 같은 세포이다. 크리스탈 세포는 melanization, 곤충 면역 반응 및 상처 치유에 사용되는 반응에 필요한 프로 phenoloxidases가 포함되어 있습니다. 제 성숙한 혈구 유형을 생성 할 수 있습니다 애벌레 조혈는 같은 포식 기생자 말벌 감염 9,10와 같은 특정 면역 도전에 대응하는 lamellocyte을했다. Lamellocytes는 캡슐화와 초파리 유충에 누워 말벌 알을 중화, plasmatocytes 및 결정 세포와 함께, 작동 큰, 부착 세포이다. 기생가 없을 lamellocytes는 야생형 유충에서 발견되지 않는다. Melanotic 대중 흑화, 캡슐 말벌 달걀을 닮은; 많은 초파리 돌연변이 균주 기생의 부재 melanotic 질량을 개발한다. lamello의 존재cytes 및 / 또는 melanotic 대중은 조혈 이상을 표시 할 수 있습니다. 사실, melanotic 질량 표현형 조혈 11-14에 관여하는 유전자 및 경로를 식별하는데 사용되었다.
애벌레 조혈 시스템은 가장 광범위하게 최신 연구이다. 그것은 체액의 순환 혈구 세포로 구성되어, 고착 혈구의 표피 아래 패턴 클러스터 및 혈구 세포는 림프 글 랜드에 거주. 림프 글 랜드는 등의 용기에 부착 된 양자 로브 시리즈입니다. 림프 글 랜드의 각 주 로브는 세 가지 주요 영역으로 구분된다. 가장 바깥 쪽 영역은 대뇌 피질의 영역으로 알려져 있으며, 혈구 세포를 성숙 포함되어 있습니다. 가장 안쪽 영역은 골수 영역이라고하며 대기 혈구 전구 물질로 구성된다. 제 3 구역, 후방 센터 시그널링은 줄기 세포와 같은 틈새로 작용 임파선 기지에서 세포의 작은 그룹이다. 초기 작품은 노치 15-18위한 중요한 기능을 설립 </suP>, 고슴도치 19, 20, JAK-STAT (18), 및 날개없는 21 활동은 애벌레 림프 글 랜드 개발을 조절합니다. 최근의 연구는 BMP (22), FGF-라스 (23), 그리고 마 24, 25 신호는 애벌레 림프 글 랜드 내에서 작동하는지 증명하고있다.
여기에 설명 된 네 유생 조혈 분석 1) 단위 부피 당 세포 수를 의미 순환 혈구 농도를 측정, 2) 분리 및 정착 3) 생체 내에서 액정 셀을 시각화 면역 대한 혈구 세포를 순환하고, 4), 고정 해부 및 장착 설명 림프는 면역 조직 화학에 대한 글 랜드. 이러한 분석은 함수 및 애벌레 조혈 시스템에서 신호 전달 경로의 규제를 평가하는 조혈 판독로서 사용될 수있다. 이러한 방법은 필드에서 이전에 사용되었지만, 이러한 분석법 시각 문서 최근 8,26-30 시작했다. 여기에 인용 된 여러 출판물에 도움된다유사한 방법 및 조혈 마커 26,31-33을 설명 FUL 자원. 또한, 트롤과 바이킹은 림프 글 랜드 기저막의 유용한 지표이다.
유전 적 또는 환경 변화에 따라, 여기에 설명 된 네 가지 방법은 신호, 생존, 증식 및 분화와 같은 조혈 동안 별개 프로세스를 분석하기 위해 개별적으로 또는 함께 사용할 수 초파리 조혈 동적 프로세스이다.; 동물 당 혈구 세포의 수가 증가하고 35 임파선의 구조 및 유전자 발현이 발달 동안에 32를 변경한다. 이러한 분석을 수행하기 이전에, 따라서, 고정 된 시간에 대한 산?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O’Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.
PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
Triton | Fisher | BP151-500 | |
Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
glycerol | VWR | EM-4750 | |
DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
6-well plate | Corning | 351146 | |
12-well plate | Corning | 351143 | |
microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
microscope cover glass, 18mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
24-well plate | Corning | 351147 | |
disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |