Drosophila og pattedyr blodkreft systemer har mange fellestrekk, noe som gjør Drosophila en attraktiv genetisk modell for å studere hematopoiesis. Her viser vi disseksjon og montering av de store larve blodkreft organ for immunhistokjemi. Vi beskriver også metoder for å analysere ulike larve blodkreft avdelinger inkludert sirkulasjons hemocytes og fastsittende krystall celler.
Mange paralleller eksisterer mellom Drosophila og pattedyr blodkreft systemer, selv om Drosophila mangler lymfoidlinjen som kjennetegner pattedyr adaptiv immunitet. Drosophila og pattedyr hematopoiesis oppstå i romlig og tidsmessig forskjellige faser for å produsere flere blodceller linjene. Begge systemene opprettholde reservoarer av blodceller stamfedre med å utvide eller erstatte eldre linjene. Den blodkreft systemet tillater Drosophila og pattedyr for å svare på og å tilpasse seg immun utfordringer. Viktigere er de transkripsjons regulatorer og signalveier som styrer generasjon, vedlikehold og funksjon av hematopoetiske system bevart fra fluer til pattedyr. Disse likhetene tillate Drosophila som skal brukes for å genetisk modell hematopoietisk utvikling og sykdom.
Her har vi detaljanalyser for å undersøke hematopoetiske system av Drosophila larver. ISpesielt skissere vi metoder for å måle blodcelletall og konsentrasjon, visualisere en bestemt moden avstamning in vivo, og utføre immunhistokjemi på blodceller i omløp og i blodkreft organ. Disse analyser kan avdekke endringer i genekspresjon og cellulære prosesser, inkludert signalering, overlevelse, proliferasjon og differensiering, og kan brukes til å undersøke en rekke spørsmål om hematopoiesis. Kombinert med de genetiske verktøy tilgjengelig i Drosophila, kan disse analysene brukes til å evaluere den hematopoetiske system på definerte genetiske endringer. Selv om det ikke spesifikt er beskrevet her, kan disse analysene også bli brukt til å undersøke effekten av miljømessige forandringer, for eksempel infeksjon eller diett, på det hematopoetiske system.
De komplekse mekanismer som regulerer transkripsjonsfaktorer og signalveier som koordinerer utviklingen av det hematopoetiske system og at feil i det hematologiske sykdommer forblir dårlig forstått. Disse transkripsjonsfaktorer og signalveier, samt deres regulering, er høyt konservert mellom Drosophila og pattedyr hematopoiesis 1-5. Således Drosophila hematopoetiske system representerer en utmerket genetisk modell for å definere de molekylære mekanismene som kontrollerer hematopoese og underliggende hematologiske sykdommer.
I likhet med pattedyr, Drosophila generere blodceller, kalt hemocytes, i romlig og tidsmessig forskjellige faser av hematopoiesis. Tradisjonelt ble Drosophila hematopoiesen tenkt å være begrenset til fasene i embryonale mesoderm og i larve lymfekjertel. Nyere studier gir holdepunkter for at hematopoiesis også forekommer i larvefastsittende cluhyller og i voksen magen 6-8. Alle blodkreft faser produserer to typer modne hemocytes: plasmatocytes og krystall celler. Plasmatocytes er makrofaglignende celler involvert i fagocytose, medfødt immunitet, og sårheling. Crystal celler inneholder pro-phenoloxidases kreves for melanization, en reaksjon som brukes i insektsimmunresponser og sårheling. Larve hematopoiese kan generere en tredje moden hemocyte type, kalt en lamellocyte, som reaksjon på visse immunutfordringer som parasittvepser infeksjon 9,10. Lamellocytes er store, tilhenger celler som fungerer, i forbindelse med plasmatocytes og krystallceller, for å kapsle og nøytralisere vepse egg legges i Drosophila larver. I fravær av parasitization, blir lamellocytes ikke funnet i villtype-larver. Melanotiske massene ligne melanized, innkapslet vepse egg; mange mutant Drosophila stammer utvikle melanotiske massene i fravær av parasitization. Tilstedeværelsen av Lamellocytes og / eller melanotiske masser kan være en indikasjon på blodkreft unormalt. Faktisk har den melanotisk massen fenotype blitt brukt til å identifisere gener og veier som er involvert i hematopoiesis 11-14.
Larve hematopoetiske system er den mest omfattende studert til dags dato. Den består av hemocytes sirkulerer i hemolymph, fastsittende hemocyte klynger mønstret under skjellaget, og hemocytes bosatt i lymfe kjertel. Den lymfekjertel er en serie av bilaterale fliker som er festet til ryggbeholderen. Hver primære flik av lymph kjertel er delt inn i tre hovedsoner. Den ytterste sone er kjent som kortikal sonen og inneholder modning hemocytes. Den innerste sone kalles medullær sonen og består av hvilende hemocyte forløpere. Den tredje sone, den bakre signaleringssenter, er en liten gruppe av celler i bunnen av den lymfekjertel som fungerer som en stamcelle-lignende nisje. Tidlig arbeid etablert kritiske funksjoner for Notch 15-18 </sup>, Hedgehog 19,20, JAK-STAT 18, og Vingeløse 21 aktivitet for å regulere larve lymph kjertel utvikling. Nyere studier har vist at BMP 22, FGF-Ras 23, og Hippo 24,25 signale også fungere innenfor larve lymph kjertel.
Fire larve hematopoetiske assays som er beskrevet her beskriver 1) måling av sirkulerende hemocyte konsentrasjon, som er definert som antall celler pr volumenhet, 2) isolering og feste sirkulerende hemocytes for immunhistokjemi, 3) visualisering krystall-celler in vivo, og 4) dissekere, festing, og monterings lymfekjertler for immunhistokjemi. Disse analysene kan brukes som blodkreft avlesninger for å vurdere funksjoner og reguleringer av signalveier i larve hematopoetiske system. Selv om disse metodene har blitt brukt tidligere i felten, har visuell dokumentasjon av disse analysene begynt nylig 8,26-30. Flere publikasjoner sitert her er hjelpful ressurser som beskriver lignende metoder og blodkreft markører 26,31-33. I tillegg Trol og Viking er nyttige markører for lymfe kjertel basalmembran.
Ved genetisk eller miljømessig endring, kan de fire fremgangsmåter som er beskrevet her brukes enkeltvis eller i kombinasjon for å analysere forskjellige prosesser i løpet av hematopoiesis slik som signalering, overlevelse, proliferasjon, differensiering og Drosophila hematopoiesis er en dynamisk prosess.; antall hemocytes per dyr øker 35 og strukturen og genekspresjon av lymfekjertel endres 32 under utvikling. Før du utfører disse analysene, derfor er det viktig å begrense egg sam…
The authors have nothing to disclose.
We thank Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O’Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.
PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
Triton | Fisher | BP151-500 | |
Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
glycerol | VWR | EM-4750 | |
DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
6-well plate | Corning | 351146 | |
12-well plate | Corning | 351143 | |
microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
microscope cover glass, 18mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
24-well plate | Corning | 351147 | |
disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |