Abstract
Fri-oppløsning kapillær elektroforese (CE) skiller analytter, vanligvis ladede forbindelser i oppløsning ved anvendelse av et elektrisk felt. Sammenlignet med andre analytiske separasjonsteknikker, så som kromatografi, er CE billig, robust og effektivt krever ingen prøvepreparering (for en rekke komplekse naturlige matrikser eller polymere prøver). CE er rask og kan brukes til å følge utviklingen av blandinger i sanntid (f.eks kjemisk reaksjonskinetikk), som signalene observert for de separerte forbindelsene er direkte proporsjonal med deres mengde i oppløsning.
Her blir effektiviteten av CE vist for overvåking av kovalent poding av peptider på kitosan filmer for etterfølgende biomedisinske anvendelser. Chitosan er antimikrobielle og biokompatible egenskaper gjør det til et attraktivt materiale for biomedisinske applikasjoner som cellevekst underlag. Kovalent pode peptid RGDS (arginin - glysin -asparaginsyre - serin) på overflaten av kitosan filmer tar sikte på å forbedre cellefesting. Historisk, kromatografi og aminosyreanalyse har vært brukt til å gi en direkte måling av mengden av podet peptid. Men den raske separasjon og fravær av prøveopparbeidelse levert av CE gjør like nøyaktig, men sanntids overvåking av peptidet pode prosessen. CE er i stand til å separere og kvantifisere de forskjellige komponenter i reaksjonsblandingen: den (ikke podet) peptid, og de kjemiske koblingsmidler. På denne måte kan bruk av CE resulterer i forbedrede filmer for nedstrømsapplikasjoner.
Chitosan Filmene ble karakterisert ved fast tilstand NMR (kjernemagnetisk resonans) spektroskopi. Denne teknikken er mer tidkrevende og kan ikke brukes i sann tid, men gir en direkte måling av peptidet og således validerer CE teknikk.
Introduction
Gratis løsning kapillær elektroforese (CE) er en teknikk som skiller forbindelser i løsninger basert på deres kostnad-til-friksjon ratio 1,2. Charge-til-size-forholdet er ofte nevnt i litteraturen, men denne forenklingen gjelder ikke polyelektrolytter, herunder polypeptider i dette arbeidet, og ble også vist å være passende for små organiske molekyler 3. CE skiller seg fra andre separasjonsteknikker ved at den ikke har en stasjonær fase, bare en bakgrunnselektrolytt (vanligvis en buffer). Dette gjør at teknikken for å være robust i sin evne til å analysere et stort utvalg av prøver med komplekse matriser 4 som plantefibre 5, gjæring trakter 6 poding på syntetiske polymerer 7, matvareprøver 8, og knapt oppløselige peptider 9 uten tidkrevende prøvepreparering og rensing. Dette er spesielt viktig for komplekse polyelektrolytter som har oppløsningsproblemer (rUCH som kitosan 10 og gellangummi 11) og eksisterer derfor som aggregert og utfelt i oppløsning og har blitt analysert uten prøve filtrering. Videre analyse av sukker i frokostblandinger involvert injisere prøver med partikler av frokostblanding prøver utfelt i vann 8. Dette strekker seg også til analysen av forgrenede polyelektrolytter eller kopolymerer 12,13. Omfattende arbeid har også blitt gjennomført i utviklingen av CE teknikker spesielt for analyse av proteiner for proteomikk 14, kiralt separasjon av naturlige eller syntetiske peptider 15 og microchip separasjoner av proteiner og peptider 16. Etter separasjon og analyse finner sted i et kapillar, er bare små volumer av prøve og oppløsningsmidler brukes som muliggjør CE for å ha en lavere driftskostnader enn andre separasjonsteknikker, inkludert kromatografi 5,6,17. Siden separasjon ved CE er rask, gjør det industriering av reaksjonskinetikk. Dette ble demonstrert i tilfelle av podingen av peptider på kitosan filmer for forbedret celleadhesjon 18.
Chitosan er et polysakkarid som stammer fra den N -deacetylation av kitin. Chitosan filmer kan anvendes for forskjellige biomedisinske anvendelser slik som bioadhesiver 19 og celledyrkingsunderlag 18,20, på grunn av kitosan er biokompatibilitet 21. Cellebinding til spesifikke ekstracellulære matriseproteiner, så som fibronektin, kollagen og laminin, er direkte knyttet til overlevelse av cellene 22. Spesielt, ulike celletyper krever ofte tilknytning til forskjellige ekstracellulære matrix proteiner for å overleve og riktig funksjon. Cellebinding til kitosan filmer viste seg å bli forbedret ved poding av fibronektin 23; men er forberedelse, rensing og poding av slike store proteiner ikke økonomisk forsvarlig. Alternativt en rekke små peptider have vist seg å være i stand til å etterligne egenskapene til store ekstracellulære matriksproteiner. For eksempel, peptider så som fibronektin-mimetika RGD (arginin - glycin - asparaginsyre) og RGDS (arginin - glycin - asparaginsyre - serin) har blitt brukt for å lette og øke cellefesting 24. Kovalent poding av RGDS ut mot kitosan filmer resultert i forbedret cellebinding for celler som er kjent for å feste til fibronektin in vivo 18. Erstatte større proteiner liker fibronektin med mindre peptider som har samme funksjonalitet gir en betydelig kostnadsreduksjon.
Her, peptid poding til kitosan ble utført som tidligere utgitt 18. Som tidligere vist, gir denne fremgangsmåten enkel og effektiv poding ved hjelp av koblingsmidler EDC-HCl (1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid) og NHS (N-hydroksysuccinimid) for å funksjonalisere karboksylsyren av RGDS å være podet påkitosan film. To fordeler ved denne podefremgangsmåten er at den ikke krever noen modifikasjon av chitosan eller av peptidet, og det er foretatt i vandig medium for å maksimere kompatibilitet med fremtidige cellekultur anvendelser 18,20. Som koblingsmidler og peptidet kan lades, er CE en egnet metode for analyse av reaksjonskinetikken. Viktigere, analyse av reaksjonskinetikken via CE muliggjør sanntidsovervåking av pode reaksjon, og dermed gjør det mulig både å optimalisere og kvantifisere graden av pode.
Selv om det ikke er rutinemessig er nødvendig, kan resultatene av CE-analyse valideres off-line ved en direkte måling av peptidet poding på kitosan filmene ved hjelp av faststoff NMR (kjernemagnetisk resonans) spektroskopi 25,26 for å demonstrere den kovalente pode av peptidet på filmen 18. Men sammenlignet med faststoff-tilstand NMR-spektroskopi, analyse av sanntids levert avCE muliggjør kvantifisering av peptidet forbruk i sanntid, og dermed evnen til å vurdere reaksjonskinetikken.
Den ovennevnte metode er enkel og gjør det mulig for sanntids analyse av peptid poding på kitosan filmer med indirekte kvantifisering av graden av poding. Den viste metode kan utvides til den virkelige tid kvantitativ vurdering av forskjellige kjemiske reaksjoner så lenge reaktantene eller produktene som skal analyseres kan belastes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Chitosan Films
- Vei ut 2 g iseddik, fullstendig til 100 ml med ultrarent vann.
- Vei opp 1,7 g av kitosan pulver, tilsett 100 ml av 2% m / m vandig eddiksyreoppløsning. Omrør i 5 dager med rørestav og magnetrører ved romtemperatur enten dekket med aluminiumsfolie eller i mørket.
- Sentrifuger chitosandispersjonen ved 1076 xg ved 23 ° C i 1 time. Samle opp supernatanten med en sprøyte og kast bunnfallet.
- For hver film, alikvoter 10 ml av kitosan suspensjonen inn i en 9 cm petriskål av plast ved romtemperatur. La filmene dekket tørke i minst 7 dager.
- Bruke saks kutte tørre filmer i 1 x 1 cm kvadrater. Merk: Eksperimentet kan bli stanset på dette stadiet.
2. Fremstilling av fosfatbufret saltløsning (PBS)
- Vei ut 8 g natriumklorid, 0,2 g kaliumklorid, 1,44 g dinatrium hydrogen Phossulfat og 0,24 g kaliumdihydrogenfosfat.
- Oppløse disse veide ut kjemikaliene i 800 ml ultrarent vann og titrere oppløsningen med konsentrert saltsyre til pH 7,4.
Merk: Eksperimentet kan bli stanset på dette stadiet.
3. Fremstilling av 75 mM natriumboratbuffer ved pH 9,2
- Vei ut 3,0915 g borsyre. Oppløse den i 75 ml ultrarent vann.
- Titrer borsyre oppløsningen til en pH-verdi på 9,2 med en natriumhydroksydoppløsning med en konsentrasjon på 10 M eller høyere.
Forsiktig: konsentrert natriumhydroksyd løsninger er etsende og må håndteres med hansker. - Komplett med ultrarent vann for å oppnå 100 ml løsning. Dette gir en 500 mM natriumboratbuffer ved pH 9,2.
- Fortynne 500 mM natriumborat buffer med ultrarent vann til 75 mM natriumborat buffer. Merk: Eksperimentet kan bli stanset på dette stadiet.
4. Utarbeidelse av Chitosan Films for podningsreaksjonen
- Skyll 10 firkant kitosan filmer (1 x 1 cm) i 5 ml PBS i 2 timer i en petriskål ved romtemperatur.
- I løpet av denne tiden, forberede og validere kapillær elektroforese instrument (trinn 5).
5. Utarbeidelse og validering av Capillary elektroforese Instrument
- Fremstille en 43,5 cm bart smeltet silisiumdioksyd kapillar med en indre diameter på 50 um (43,5 cm er den totale lengde, er den effektive lengde til deteksjonsvinduet er vanligvis 35 cm) ved å svekke polymer ytre belegg av kapillaren ved den innstilte lengde med en sløv redskap da knipser kapillær.
- Lag et vindu for kapillær ved hjelp av en lighter å brenne polymerbelegget på 8,5 cm fra innløpet og etter den kjøler tørk den ren med etanol. Brenne belegget av kapillaren i hver ende for noen millimeter med en lettere, og etter at den er avkjølt tørk med etanol.
- Place kapillær inside deteksjonsvindu og installere den i kapillær kassetten ved å plassere den på like lengder i innløp og utløp og svingete det rundt spindler av kassetten. Deretter installerer kassetten i kapillær elektroforese instrument.
- Definerer parametrene for fremgangsmåten for hver separasjon. I programvaren menyen velger du "metode" og deretter "redigere hele metoden". Still temperatur, tid, spenning og ampuller som brukes til separasjon (for eksempel 25 ° C, 10 min, 30 kV).
- I pre-kondisjonering, angi de etterfølgende spylinger: 10 min med 1 M natriumhydroksid (i vann), 5 min med 0,1 M natriumhydroksyd (i vann), 5 min med ultrarent vann og 5 minutter med 75 mM natriumboratbuffer ved pH 9,2 for den første metoden i en serie av analyser.
- For de etterfølgende fremgangsmåter, angir den innstilte de etterfølgende spylinger i den pre-kondisjonering seksjon: 1 min med 1 M natriumhydroksid (i vann), 5 min med 75 mM natriumboratbuffer ved pH 9.2.
- I injeksjon, angi parametere for en hydrodynamisk injeksjon med 30 mbar trykk i 10 sekunder for alle metoder. I separasjonsseksjonen, sett separasjonsbetingelser til 30 kV ved 25 ° C i 9 min for alle metoder.
MERK: Se brukerhåndboken for spesifikk CE instrument som prosedyre for drift av CE instrument kan variere mellom produsenter. Klargjør 1 M natriumhydroksidløsning på dagen.
- Injisere og separere en nøytral intern standard (10 ul av 10% volum / volum dimetylsulfoksid (DMSO), i vann, fortynnet i 450 pl av 75 mM natriumboratbuffer). Deretter injisere og skille på samme måte en oligoacrylate standard (oppløst i ultrarent vann ved 10 g ∙ L -1, se liste over materialer) for å sjekke gyldigheten av kapillær. Pause sekvensen her til pode reaksjon er klar til å begynne.
6. Negl RGDS ut mot Chitosan Film
- Vei ut peptidet (1 mg RGDS)og koblingsmidler (3 mg EDC-HCl og 2 mg NHS).
- 2 timer etter start av kitosan film soaking i PBS, oppløse peptidet og koblingsmidlene i 5 ml PBS.
- Ta en 50 pl alikvot av denne løsningen. Tilsett 2 ul av 10% volum / volum DMSO i vann som en intern standard for å nøytral alikvoten. Analyser delmengde med CE (se trinn 7).
- Fjern de 5 ml PBS som brukes til å skylle kitosan filmene fra Petri-skålen. Tilsett 5 ml oppløsning av peptid og koblingsmidler til petriskålen inneholdende kitosan filmene.
- Dekk petriskål med parafin film og legg den på en orbital shaker ved romtemperatur. Ta 50 ul porsjoner av reaksjon media til faste tider.
NB: Den totale analysetid med CE er 15 min, og dermed en delmengde kan tas hvert 15. min (eller hvert 30 min hvis to reaksjoner overvåkes i parallell, etc.).- Tilsett 2 ul av 10% volum / volum DMSO i vann som en intern standard nøytral til hver aliquot.
MERK: Prøver skal analyseres med CE så snart de er tatt (se trinn 7).
- Tilsett 2 ul av 10% volum / volum DMSO i vann som en intern standard nøytral til hver aliquot.
- Etter 4 timer med risting og delmengde fjerning, fjerne petriskål fra shaker. Fjern reaksjonsblandingen fra Petri-skålen. Tilsett 5 ml PBS for å skylle kitosan filmene.
- Fjern PBS fra petriskål, skyll kitosan film med ultrarent vann og la dem tørke over natten. Fjern det ultrarent vann og lagre film ved -20 ° C i en petriskål av plast.
7. Oppfølging av Negl Reaction Bruke CE
- Injisere og separate alikvoter av reaksjons media umiddelbart etter fjerning fra Petri-skålen ved hjelp av de analysebetingelser som i avsnitt 5.2.
- Ved fullføring av separasjonene skylle kapillaren med ultrarent vann i 10 minutter. Tørk det gjennom en i flukt med en tom flaske (luft) i 10 minutter.
MERK: Eksperimentet kan bli stanset på dette stadiet.
8. data Trea tment for CE
- Sjekke gyldigheten av hver separasjon, ved å kontrollere at både strømmen under separasjonen og migrering tidspunktet for electroosmotic mobilitet markør (DMSO i dette tilfellet) er lik de som ble observert for den oligoacrylate standard separasjon.
MERK: Opp til 10-15% variasjon er akseptabelt fra den forventede strømverdi på omkring 50 uA og migrering tidsverdi på 1,3 min (elektroforetiske mobilitetsverdier bør brukes i stedet for migrasjonstider hvis en høyere repeterbarhet er nødvendig). - For hver vellykket separasjon, eksportere rådata fra kapillær elektroforese programvaren ved å velge et bestemt datasett, høyreklikke på eksport og velge et passende signal.
- Konverter rådata registrert av CE (presentert som UV-absorbans som en funksjon av migrasjon tid). Omdanne X-aksen (tid t migrering m) inn i en elektroforetisk mobilitet μ følgende ligning 1:
n 1 "src =" / files / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
hvor L d er lengden til detektoren, L t er den totale lengden av kapillaren, V er spenningen, og t eo er den flyttingen av en nøytral art (DMSO indre standard i dette tilfelle) 27.
Konverter Y-aksen rådata (absorbans i au) til en fordeling av elektro mobilities W (μ) følgende ligning 2: 28
(2)
(2) 9. Ytterligere karakterisering av Peptide-podet Films 18
- Sett peptid-podet kitosan filmer, rullet rundt seg selv, i en 4 mm solid-state NMR rotor. Fylle rotoren med fosfat-bufret saltvann for å svelle filmene, og lukker rotoren. Vent noen timer.
- Analyser film med 13 </ sup> C NMR-spektroskopi 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CE er godt egnet til overvåking av poding av peptider (f.eks RGDS) på kitosan filmer. Egnede koblingsmidler omfatter EDC-HCl og NHS som aktiverer peptidet som skal podes på chitosan (figur 1). CE er i stand til å skille de forskjellige molekyler av interesse fra reaksjonsmediet. For å tildele toppene på elektroferogrammet, rene RGDS, EDC-HCl og NHS ble oppløst, injisert og separert separat. Etter at topp oppdraget, ble reaksjonsmediet injisert og de forskjellige reaktantene ble identifisert (figur 2). EDC-HCI reageres inn i et biprodukt EDH-HCl (3 - (((etylamino) (hydroksy) metylen) amino) - N, N -dimethylpropan-1-amin). Dimetylsulfoksyd (DMSO) blir brukt som en intern standard for CE-separasjoner. Chitosan er til stede i pode eksperiment i form av uoppløselige filmer, og er derfor ikke injiseres eller observeres i CE. Merk at for alle rådata, than registreres migrering tidsaksen blir omformet til en elektroforetisk mobilitet akse (ligning 1) og UV-absorbans-aksen i en fordeling av elektroforetiske mobiliteter W (μ) (ligning 2).
Som alikvoter blir tatt fra reaksjonsmediet de er plassert i CE-instrument og injisert. Utstrekningen av reaksjonen overvåkes ved reduksjon av toppen forbundet med RGDS (figur 3). Det kan også sees at EDC-HCl topp reduseres mens EDH-HCl peak øker over tid. Det er viktig å merke seg at det ikke er noe signal som kan tilordnes et produkt fra en sidereaksjon av peptidet, og dermed er det forutsatt at RGDS blir fjernet fra reaksjonsmediet blir podet på kitosan film. Kledde electropherograms (figur 3A) tillater kvantifisering av peptidet forbruk fra begynnelsen til slutten av reaksjonen. Det skal bemerkes atSelv om kinetikken ble først målt i 18 timer (figur 3B), ble 4 timer anses å være tilstrekkelig for at reaksjonen skal fortsette til sin maksimale utstrekning. For å tillate kvantifisering en optimal injeksjonsvolum er nødvendig for å sikre at signal-til-støyforholdet er høyt nok mens den forhindrer overbelastning (figur 4A), og i tilfelle av RGDS, ble injeksjoner som kreves for å bli fullført i sanntid for å forhindre polykondensering (figur 4B ).
CE-baserte teknikken beskrevet her for å analysere peptid pode til kitosan filmer er rask og enkel; Men, betyr det ikke kvantifisere pode prosessen direkte. NMR-spektroskopi blir brukt for å demonstrere pode; denne målingen kan ikke gjøres i sanntid (det tar vanligvis flere timer) og må være ferdig etterreaksjon. Den kvalitative sammenligning av kitosan filmene før og etter poding viser vellykket poding av peptidene throhuff utseendet av et signal ved 70 ppm i den podede film svarende til amidbindingen mellom kitosan og peptidet (figur 5).
Figur 1. Scheme av pode reaksjon. Kjemisk reaksjonsskjema som viser aktivering av EDC-HCl og NHS av karboksylsyre funksjonell gruppe RGDS etterfulgt av sin pode på kitosan film overflaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Figur 2. Peak tilordning av de arter som er tilstede i reaksjonsmediet. A. Separasjon og topp oppdrag for løsninger av delvis hydrolysert EDC HCI (rosa), RGDS (rød), NHS (blå), så vel som for PBS (purpur), og reaksjonsmediet (svart). B. Electropherograms av reaksjonsmediene (sort) presentert som en funksjon av tid migrasjon (elektroforetisk mobilitet bør brukes til å overvinne dårlig repeterbarhet i migrasjons ganger). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. CE overvåking av RGDS forbruk. (A) som er lagt over peptid-topper ved reaksjonstiden 30 min (lilla fast linje), 60 min (magenta stiplet linje), 90 min (blå heltrukket linje), 120 min (grønn stiplet linje), 150 min (rød heltrukken linje) og (B) kinetikk pode gjennomført over 18 timer i replikater (kvadrat og sirkel).pload / 54549 / 54549fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. kledde peptid toppene i reaksjon media viser suboptimale resultater (A) Varierende (hydrodynamisk) injeksjon ganger:. 5 sek (blå linje), 10 sek (sort linje), 20 sek (rød linje) og 30 sek (rød linje) . (B) Reaksjons media igjen i et CE hetteglass i en lengre periode før injeksjon:. 30 min (rød linje) og 90 min (blå linje) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. 13C svellet tilstand-NMR-spektra av kitosan filmer. Sammenlikning av filmene før (sort linje) og etter (blå linje) peptid poding. Signaler som finnes bare i spekteret registreres etter pode er angitt med stjerner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkelheten av protokollen beskrevet her gjør den ideell til omfattende søknad. Men trenger spesiell oppmerksomhet rettes mot følgende viktige skritt.
Riktig CE instrument forberedelse
Det er viktig å skille en kjent standard umiddelbart før separeringen av ukjente prøver (så vel som ved enden av en serie separasjoner) for å kontrollere gyldigheten av kapillaren og instrumentet på dagen. Denne standarden kan være en oligoacrylate 27 eller en hvilken som helst prøve er kjent for å gi multiple topper over et bredt område av migrasjonstider. Overvåking av strømmen under alle separasjoner og analysering av migreringen av en nøytral markør i hvert skille er hovedfremgangsmåten for å identifisere problemer. En ustabil nåværende eller store variasjoner (mer enn 10-15%) i platåverdien av strømmen kan skyldes inkonsistens i buffer (pH eller konsentrasjon). Dersom det er etterfulgt av en forsinket migration tid av den nøytrale maker det kan også være på grunn av den kapillære ikke er tilstrekkelig rent. Rutinemessige kontroller av pH i buffer og en ekstra spyle av kapillaren i 10 minutter med 1M natriumhydroksyd (nyfremstilt) kan brukes for å hindre / endre dette problem. Under eksperimentet, kan ekstra rengjøringstrinn anvendes for å sikre en optimal adskillelse, typisk inklusive eller forlenge en i flukt med konsentrert vandig natriumhydroksyd for å regenerere sikringen silika kapillær overflate.
Riktig data behandling
Ved avslutningen av forsøket, er egnet behandling av rå data viktig når man sammenligner resultater. Dette innebærer omdannelsen av X- og Y-aksen oppnådd fra CE-instrument (trinn 8.3). Migrasjon tider bestemmes i CE har en relativt dårlig repeterbarhet og vi anbefaler å bruke elektro mobilitet i stedet, noe som fører til en mye bedre repeterbarhet. Betydningen av riktig t reating data har blitt vist tidligere med separasjon og karakterisering av kitosan 10, poly (akrylsyre) 29, blokk-kopolymerer 13 og påvisning av sukkere i frokostblandinger 8 gjennom mindre standardavvik (RSD) observert mellom forsøkene for mobiliteter enn for migrasjonstider . Videre, CE har vist seg å være mer robust enn HPLC ved separasjon av monosakkarider i komplekse matriser 5. Andre trinn i Optimaliseringen kan inkludere å justere injeksjonsvolum (tidspunktet for injeksjon) for å tillate separering med god følsomhet uten å forårsake overbelastning som ville forhindre kvantifisering. En injeksjon tid på 10 sek anses optimal ved 30 mbar (figur 4B): en kortere tid injeksjon fører til en redusert sensitivitet mens lengre injeksjonstider fører til en topp form forvrengning indikativ for kapillær overbelastning.
Viktigheten av sanntids overvåking
ove_content "> En kritisk styrke av denne CE-baserte metoden er muligheten til å overvåke reaksjonene i sanntid. Dette krever optimale CE forhold for påvisning og separering av det aktuelle reaksjonskomponenten (e) og / eller produkt (er). Videre, for det analyse av kjemiske reaksjoner en passende tid null må tas som en målestokk for reaksjonen, og dette består vanligvis i separering av de målte ut reaktantene like før reaksjonen starter dette kan gjøres for eksempel før en spesiell reaktant er innført, før. temperaturen økes, eller før UV-bestrålingen startes for å utløse reaksjonen.I tilfelle av podingen av peptidet RGDS (bort kitosan eller på et annet substrat), er peptidet i stand til å reagere med seg selv for å fremstille lineære oligomerer eller forgrenete strukturer gjennom polykondensasjon 18. Dette er fordi RGDS inneholder både amin og karboksylsyre-funksjonelle grupper. Disse peptid oligomerene har ikke den samme electrophoretic mobilitet som de første peptid RGDS og derfor kan gi et misvisende kvantifisering, gjennom for eksempel co-migrering med andre arter. Det er derfor viktig å sikre at alikvoter av reaksjonsmediet blir injisert, og separeres i løpet av få minutter for å bli tatt fra reaksjonsmediet (figur 4B).
Riktig forberedelse av kitosan filmer
Når spesifikt arbeider med kitosan filmer er det en rekke tiltak for å følge. Under fremstillingen av kitosan filmene, filmene må overlates å tørke i minst 7 dager (fortrinnsvis mer). Dersom dette ikke er fullført, når filmene anbringes i PBS-buffer for å skylle de vil løse seg opp i stedet for å danne en svellet film som deretter hindrer de neste trinnene. I tillegg er det viktig å nøytralisere filmen før podningsreaksjonen for å fjerne gjenværende eddiksyre, som kan lekke ut av filmen og konkurrere medpeptidet for podningsreaksjonen 18. Dette kan gjøres ved bløtlegging i fortynnet vandig natriumhydroksyd eller i PBS. PH av bufferen anvendt som oppløsningsmiddel for podningsreaksjonen er også kritisk: hvis det er for surt filmene vil helt eller delvis oppløses. Under podningsreaksjonen er det viktig at filmen er i stand til å ha maksimal kontakt med reaksjonsløsningen. Derfor er det petriskål inneholdende film og reaksjonsblandingen ble plassert på en ristemaskin. Det er også viktig for å hindre fordampning av reaksjonsblandingen for å forhindre ukontrollerte konsentrasjonsvariasjoner som resulterer i unøyaktige quantifications; bruken av parafin film for å dekke petriskål var effektiv til å forhindre den.
Den største begrensningen av CE-teknikken er at individuelt det er ikke i stand til å bekrefte pode prosessen. I sammenheng med den kjemiske podeprosessen er nevnt ovenfor, kvantifisering av peptidet poding er indirekte. Dettekan overvinnes ved bruk av en komplementær teknikk, for eksempel fast tilstand NMR-spektroskopi som tidligere nevnt. Andre begrensninger av CE teknikk inkluderer at det krever forbindelsen av interesse å bli belastet. Derfor nøytrale arter vil migrere samtidig. I visse tilfeller kan dette overvinnes dersom forbindelsen av interesse komplekser med borat. Til slutt dersom forbindelsen av interesse ikke inneholder kromoforer deteksjon annet enn UV slik som ledningsevne kan trenge å bli brukt. Dette krever ekstra kjøp av en konduktivitetsdetektor som krever optimalisering.
Fordeler med å analysere peptid pode via CE kontra andre analysemetoder
CE metode har flere fordeler fremfor alternative indirekte metoder inkludert væskekromatografi med høy yteevne (HPLC), aminosyreanalyse (AAA) og den direkte metode for NMR-spektroskopi. Sammenlignet AAA er det en high-throughput, robust metode hh gjør det mulig å analysere komplekse prøver effektivt uten tidkrevende prøveopparbeidelse. Dette er fordelaktig spesielt i analyse av kjemiske reaksjoner i sanntid. HPLC har vært brukt tidligere for peptid pode analyse 30, men det ble ansett å være bare semi-kvantitativt. CE har en lavere driftskostnader enn HPLC og krever ikke prøven filtrering forut for analyse, noe som minsker risikoen for prøven tap 5. Selv om 13C NMR-spektroskopi er i stand til direkte å måle produktet av interesse, er det en kostbar teknikk, og er i stand til å måle den i sanntid.
Protokollen descripted her tilveiebringer en hurtig, effektiv, billig og pålitelig metode for å optimalisere peptid innpoding til kitosan film. Denne nye tilnærmingen gir således betydelige fordeler for å lage cellefeste egenskapene til kitosan-filmer i forhold til tradisjonelt anvendte metoder slik som kromatografi og AAA. Dette CE-metoden kan brukes til å overvåke en rekkeav andre kjemiske reaksjoner i sann tid, typisk reaksjoner som forekommer på den tidsramme på flere timer, for hvilken / produkter av interesse kan lades reaktantene. I dette tilfelle er det imidlertid viktig å merke seg at CE-metoden bør være optimalisert forut for analyse av en annen kjemisk reaksjon for å tillate en vellykket analyse. Dette omfatter analysen av de rene reaktanter og produkter før reaksjonen for å tillate dem å bli identifisert og sørge for at de kan påvises og skilles, samt for å sikre at ingen forurensninger kan forhindre kvantifisering. Separasjonen kan forbedres, og den totale analysetiden endres ved å variere kapillær lengde, buffersammensetning og spenning, og eventuelt ved hjelp av et kapillar med belagte vegger. Påvisningen kan forbedres ved å endre betingelsene i hvilken prøven blir injisert for å favorisere de ladede reaktantene eller ved å sprøyte inn en større mengde av prøven inn i kapillaren. Videre kan andre detektorer bortsett fra UV-deteksjon be anvendes, inklusive fluorescens, kontaktløse ledningsevnedetektorer eller CE kan koples til et massespektrometer. Muligheten for å overvåke reaksjonene i sanntid muliggjør podningsreaksjonen som kan utføres direkte i et CE-ampulle hvis underlaget er i oppløsning og er i stand til å bli analysert av CE. Dette kan skje direkte på innsiden av CE-instrument, som vi nylig utførte det for poding av aminoantipyrin på poly (akrylsyre) 7 I tillegg blir tilnærmingen ikke begrenset til innpoding reaksjoner, men kan utvides til å overvåke forskjellige andre kjemiske reaksjoner. Videre overvåkning av reaksjonene tillater optimalisering av reaksjonen, og kan også brukes til å validere produktet av reaksjonen. Så lenge som forbindelsen av interesse kan bli oppløst og siktet, gjør det mulig for CE-metoden rask, billig og robust separasjon, deteksjon og kvantifisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid - Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride - Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate - Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate - Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid - Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
- Muthukumar, M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. Electrophoresis. 17, 1167-1172 (1996).
- Barrat, J. L., Joanny, J. F. in Advances in Chemical Physics, Vol Xciv Vol. 94 Advances in Chemical Physics. , John Wiley & Sons Inc. 1-66 (1996).
- Fu, S. L., Lucy, C. A. Prediction of electrophoretic mobilities. 1. Monoamines. Anal. Chem. 70, 173-181 (1998).
- Harvey, D. Modern Analytical Chemistry. , McGraw Hill. (2000).
- Oliver, J. D., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust determination of monosaccharides in plant fibers in complex mixtures by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1291, 179-186 (2013).
- Oliver, J. D., Sutton, A. T., Karu, N., Phillips, M., Markham, J., Peiris, P., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust monitoring of ethanol fermentations by capillary electrophoresis. Biotechnology and Applied Biochemistry. 62, 329-342 (2015).
- Thevarajah, J. J., Sutton, A. T., Maniego, A. R., Whitty, E. G., Harrisson, S., Cottet, H., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantifying the Heterogeneity of Chemical Structures in Complex Charged Polymers through the Dispersity of Their Distributions of Electrophoretic Mobilities or of Compositions. Anal. Chem. 88, 1674-1681 (2016).
- Toutounji, M. R., Van Leeuwen, M. P., Oliver, J. D., Shrestha, A. K., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantification of sugars in breakfast cereals using capillary electrophoresis. Carbohydr. Res. 408, 134-141 (2015).
- Miramon, H., Cavelier, F., Martinez, J., Cottet, H. Highly Resolutive Separations of Hardly Soluble Synthetic Polypeptides by Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 82, 394-399 (2010).
- Mnatsakanyan, M., Thevarajah, J. J., Roi, R. S., Lauto, A., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6873-6877 (2013).
- Taylor, D. L., Ferris, C. J., Maniego, A. R., Castignolles, P., in het Panhuis, M., Gaborieau, M. Characterization of Gellan Gum by Capillary Electrophoresis. Australian Journal of Chemistry. 65, 1156-1164 (2012).
- Thevarajah, J. J., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation and characterization of synthetic polyelectrolytes and polysaccharides with capillary electrophoresis. Adv. Chem. 2014, 798503 (2014).
- Sutton, A. T., Read, E., Maniego, A. R., Thevarajah, J., Marty, J. -D., Destarac, M., Gaborieau, M., Castignolles, P. Purity of double hydrophilic block copolymers revealed by capillary electrophoresis in the critical conditions. J. Chromatogr. A. 1372, 187-195 (2014).
- Righetti, P. G., Sebastiano, R., Citterio, A. Capillary electrophoresis and isoelectric focusing in peptide and protein analysis. Proteomics. 13, 325-340 (2013).
- Ali, I., Al-Othman, Z. A., Al-Warthan, A., Asnin, L., Chudinov, A. Advances in chiral separations of small peptides by capillary electrophoresis and chromatography. J. Sep. Sci. 37, 2447-2466 (2014).
- Kasicka, V. Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013). Electrophoresis. 35, 69-95 (2014).
- JoVE Science Education Database. Capillary Electrophoresis (CE). Essentials of Analytical Chemistry. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/10226/capillary-electrophoresis-ce (2016).
- Taylor, D. L., Thevarajah, J. J., Narayan, D. K., Murphy, P., Mangala, M. M., Lim, S., Wuhrer, R., Lefay, C., O'Connor, M. D., Gaborieau, M., Castignolles, P. Real-time monitoring of peptide grafting onto chitosan films using capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 407, 2543-2555 (2015).
- Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603-632 (2006).
- Li, Z., Leung, M., Hopper, R., Ellenbogen, R., Zhang, M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31, 404-412 (2010).
- Domard, A. A perspective on 30 years research on chitin and chitosan. Carbohydr. Polym. 84, 696-703 (2011).
- Shekaran, A., Garcia, A. J. Nanoscale engineering of extracellular matrix-mimetic bioadhesive surfaces and implants for tissue engineering. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1810, 350-360 (2011).
- Custodio, C. A., Alves, C. M., Reis, R. L., Mano, J. F. Immobilization of fibronectin in chitosan substrates improves cell adhesion and proliferation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 316-323 (2010).
- Boateng, S. Y., Lateef, S. S., Mosley, W., Hartman, T. J., Hanley, L., Russell, B. RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C30-C38 (2005).
- Lefay, C., Guillaneuf, Y., Moreira, G., Thevarajah, J. J., Castignolles, P., Ziarelli, F., Bloch, E., Major, M., Charles, L., Gaborieau, M., Bertin, D., Gigmes, D. Heterogeneous modification of chitosan via nitroxide-mediated polymerization. Polym. Chem. 4, 322-328 (2013).
- Gartner, C., Lopez, B. L., Sierra, L., Graf, R., Spiess, H. W., Gaborieau, M. Interplay between Structure and Dynamics in Chitosan Films Investigated with Solid-State NMR, Dynamic Mechanical Analysis, and X-ray Diffraction. Biomacromolecules. 12, 1380-1386 (2011).
- Castignolles, P., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Sprong, E., Ferguson, C. J., Gilbert, R. G. High resolution separation of oligo(acrylic acid) by capillary zone electrophoresis. Macromol. Rapid Commun. 27, 42-46 (2006).
- Chamieh, J., Martin, M., Cottet, H. Quantitative Analysis in Capillary Electrophoresis: Transformation of Raw Electropherograms into Continuous Distributions. Anal. Chem. 87, 1050-1057 (2015).
- Maniego, A. R., Ang, D., Guillaneuf, Y., Lefay, C., Gigmes, D., Aldrich-Wright, J. R., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of poly(acrylic acid) salts according to topology using capillary electrophoresis in the critical conditions. Anal. Bioanal. Chem. 405, 9009-9020 (2013).
- Chung, T. W., Lu, Y. F., Wang, S. S., Lin, Y. S., Chu, S. H. Growth of human endothelial cells on photochemically grafted Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) chitosans. Biomaterials. 23, 4803-4809 (2002).
