Abstract
Free-opløsning kapillarelektroforese (CE) adskiller analytter, generelt ladede forbindelser i opløsning ved anvendelse af et elektrisk felt. Sammenlignet med andre analytiske separationsteknikker, såsom kromatografi, CE er billig, robust og effektivt kræver ingen prøveforberedelse (for en række komplekse naturlige matricer eller polymere prøver). CE er hurtig og kan anvendes til at følge udviklingen i blandinger i realtid (fx kemisk reaktionskinetik), som de observerede de adskilte forbindelser signaler er direkte proportional med deres mængde i opløsning.
Her er effektiviteten af CE demonstreret til overvågning af kovalent podning af peptider på chitosan film for efterfølgende biomedicinske anvendelser. Chitosan er antimikrobielle og biokompatible egenskaber gør det til et attraktivt materiale til biomedicinske applikationer såsom cellevækst substrater. Covalent podning peptid RGDS (arginin - glycin -asparaginsyre - serin) på overfladen af chitosan film til formål at forbedre cellevedhæftning. Historisk set har kromatografi og aminosyreanalyse blevet anvendt til at tilvejebringe en direkte måling af mængden af podet peptid. Men den hurtige adskillelse og fravær af prøvefremstilling tilvejebragt af CE muliggør lige så nøjagtige, men samtidig realtidsovervågning af peptidet podning processen. CE er i stand til at adskille og kvantificere de forskellige komponenter i reaktionsblandingen: den (ikke-podet) peptid og de kemiske koblingsmidler. På denne måde anvendelsen af CE resulterer i forbedrede film til efterfølgende anvendelser.
Chitosan film blev karakteriseret gennem faststof NMR (kernemagnetisk resonans) spektroskopi. Denne teknik er mere tidskrævende og kan ikke anvendes i realtid, men giver en direkte måling af peptidet og dermed validerer CE teknik.
Introduction
Gratis løsning kapillarelektroforese (CE) er en teknik, der adskiller forbindelser i løsninger baseret på deres ladning-til-friktion-forholdet 1,2. Charge-til-størrelsesforhold nævnes ofte i litteraturen, men denne forenkling gælder ikke for polyelektrolytter, herunder polypeptider i dette arbejde, og blev også vist sig ikke at være hensigtsmæssigt for små organiske molekyler 3. CE adskiller sig fra andre separationsteknikker i, at den ikke har en stationær fase, kun en baggrund elektrolyt (normalt en puffer). Dette gør det muligt teknik til at være robust i sin evne til at analysere en lang række prøver med komplekse matricer 4 såsom plantefibre 5, gæring brygger 6 podning på syntetiske polymerer 7, mad prøver 8 og næppe opløselige peptider 9 uden kedelige prøveforberedelse og oprensning. Dette er især vigtigt for komplekse polyelektrolytter som har opløsnings-spørgsmål (such som chitosan 10 og gellangummi 11), og derfor eksistere som aggregeret eller udfældes i opløsning, og med succes er blevet analyseret uden prøve filtrering. Endvidere er analysen af sukkerarter i morgenmadscerealier involveret injicere prøver med partikler morgenmadsprodukter prøver udfældes i vand 8. Dette omfatter også en analyse af forgrenede polyelektrolytter eller copolymerer 12,13. Omfattende arbejde er også blevet gennemført i udviklingen af CE teknikker specielt til analyse af proteiner for proteomics 14, chirale adskillelse af naturlige eller syntetiske peptider 15 og mikrochip separationer af proteiner og peptider 16. Eftersom adskillelsen og analysen finder sted i et kapillarrør, er kun små volumener af prøve og opløsningsmidler anvendt som muliggør CE at have en lavere driftsomkostninger end andre separationsteknikker, herunder kromatografi 5,6,17. Da adskillelsen af CE er hurtig, det tillader monitoring af reaktionskinetik. Dette blev demonstreret i forbindelse med podning af peptider på chitosan film til forbedret celleadhæsion 18.
Chitosan er et polysaccharid afledt fra N -deacetylation af chitin. Chitosan film kan anvendes til forskellige biomedicinske applikationer såsom bioklæbemidler 19 og celle vækstsubstrater 18,20, grundet chitosan s biokompatibilitet 21. Cell tilknytning til specifikke ekstracellulære matrix proteiner, såsom fibronectin, collagener og laminin, er direkte forbundet med overlevelse af cellerne 22. Især forskellige celletyper kræver ofte fastgørelse til forskellige ekstracellulære matrixproteiner for overlevelse og korrekt funktion. Cell tilknytning til chitosan film viste sig at blive styrket gennem podning af fibronektin 23; Men forberedelse, rensning og podning af sådanne store proteiner ikke er økonomisk rentabel. Skiftevis en række små peptider have vist sig at være i stand til at efterligne egenskaberne af store ekstracellulære matrixproteiner. For eksempel peptider, såsom fibronectin mimetika RGD (arginin - glycin - asparaginsyre) og RGDS (arginin - glycin - asparaginsyre - serin) er blevet anvendt til at fremme og øge cellebinding 24. Kovalent podning af RGDS onto chitosan film resulterede i forbedret vedhæftning celle for celler er kendt for at knytte til fibronektin in vivo 18. Substituere større proteiner kan lide fibronectin med mindre peptider, der har den samme funktionalitet giver en betydelig omkostningsreduktion.
Her, peptid podning til chitosan blev udført som tidligere publiceret 18.. Som tidligere demonstreret, denne tilgang giver enkel og effektiv podning ved hjælp af koblingsmidler EDC-HCI (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) og NHS (N-hydroxysuccinimid) at funktionalisere carboxylsyren af RGDS at være podet påchitosan film. To fordele ved denne podning metode er, at det ikke kræver nogen ændring af chitosan eller af peptidet, og de udføres i vandigt medium for at maksimere kompatibilitet med fremtidige cellekulturanvendelser 18,20. Som koblingsmidler og peptidet kan oplades, CE er en egnet fremgangsmåde til analyse af reaktionskinetikken. Vigtigere, analyse af reaktionskinetikken via CE muliggør real-time monitorering af podningsreaktionen og således muliggør både optimering og kvantificere graden af podning.
Selv om det ikke rutinemæssigt nødvendigt, kan resultaterne af CE-analyse valideres off-line ved en direkte måling af peptidet podning på chitosan film under anvendelse faststof NMR (kernemagnetisk resonans) spektroskopi 25,26 for at demonstrere den kovalente podning af peptidet på filmen 18. Men sammenlignet med faststof NMR spektroskopi, analyse i realtid fraCE muliggør kvantificering af peptidet forbrug i realtid og dermed evnen til at vurdere kinetikken for reaktionen.
Den ovennævnte fremgangsmåde er enkel og tillader tidstro analyse af peptid podning på chitosan film med indirekte kvantificering af omfanget af podningen. Den påvist fremgangsmåde kan udvides til realtid kvantitativ vurdering af forskellige kemiske reaktioner, så længe reaktanterne eller produkterne, der skal analyseres kan oplades.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af chitosan film
- Afvej 2 g iseddikesyre, komplet til 100 ml med ultrarent vand.
- Afvej 1,7 g chitosan pulver, tilsættes 100 ml af 2% m / m vandig eddikesyreopløsning. Der omrøres i 5 dage under omrøring bar og magnetisk omrøring plade ved stuetemperatur enten dækket med aluminiumsfolie eller i mørke.
- Centrifugeres chitosan dispersion ved 1.076 xg ved 23 ° C i 1 time. Saml supernatanten med en sprøjte og kassér bundfald.
- For hver film, alikvot 10 ml chitosan suspensionen i en 9 cm petriskål af plastik ved stuetemperatur. Lad filmene dækket til tørre i mindst 7 dage.
- Brug af saks skære tørre film i 1 x 1 cm kvadrater. Bemærk: Eksperimentet kan sættes på pause i denne fase.
2. Fremstilling af phosphatbufret saltvand (PBS)
- Afvej 8 g natriumchlorid, 0,2 g kaliumchlorid, 1,44 g dinatriumhydrogenphosphat phossulfat og 0,24 g kaliumdihydrogenphosphat.
- Opløs disse afvejet kemikalier i 800 ml ultrarent vand og titreres opløsningen med koncentreret saltsyre til pH 7,4.
Bemærk: Eksperimentet kan sættes på pause i denne fase.
3. Fremstilling af 75 mM natriumboratpuffer ved pH 9,2
- Afvej 3,0915 g borsyre. Opløs det i 75 ml ultrarent vand.
- borsyreopløsningens til en pH på 9,2 med en natriumhydroxidopløsning titreres ved en koncentration på 10 M eller højere.
Forsigtig: Koncentreret natriumhydroxidopløsning løsninger er ætsende og skal håndteres med handsker. - Komplet med ultrarent vand til opnåelse af 100 ml opløsning. Dette giver en 500 mM natriumborat ved pH 9,2.
- Fortynd 500 mM natriumboratpuffer med ultrarent vand til 75 mM natriumboratpuffer. Bemærk: Eksperimentet kan sættes på pause i denne fase.
4. Fremstilling af chitosan Films for podningsreaktionen
- Skyl 10 kvadratiske chitosan film (1 x 1 cm) i 5 ml PBS i 2 timer i en petriskål ved stuetemperatur.
- I løbet af denne tid, forberede og validere kapillarelektroforese instrument (trin 5).
5. Udarbejdelse og validering af kapillarelektroforese Instrument
- Forbered en 43,5 cm nøgne kvartsglas kapillar med en indvendig diameter på 50 um (43,5 cm er den samlede længde, den effektive længde til vinduet afsløring typisk 35 cm) ved at svække den polymer ydre belægning af kapillarrøret ved den indstillede længde med en stump redskab derefter snappe kapillarrøret.
- Skabe et vindue til kapillarrøret ved anvendelse af en lighter at brænde polymerbelægningen på 8,5 cm fra indløbet, og efter det køler tørre det rene med ethanol. Burn overtrækket af kapillæren ved hver ende et par millimeter med en lettere, og efter det køler tørre det rene med ethanol.
- Place kapillær insiVinduet de afsløring og installere den i kapillær kassetten ved at placere den på lige længder i ind- og udløb og snoede det rundt spindler kassetten. Installer derefter kassetten i kapillarelektroforese instrument.
- Indstille parametrene for fremgangsmåden for hver separation. I software-menuen vælg "metode" og derefter "redigere hele metoden". Indstil temperatur, tid, spænding, og hætteglas, der anvendes til separation (for eksempel 25 ° C, 10 min, 30 kV).
- I den præ-conditioning sektion, indstille de konsekutive flushes: 10 min med 1 M natriumhydroxid (i vand), 5 min med 0,1 M natriumhydroxid (i vand), 5 min med ultrarent vand og 5 min med 75 mM natrium- boratbuffer ved pH 9,2 for den første fremgangsmåde til en række analyser.
- For de følgende metoder, indstille sættet fortløbende tømninger i før-conditioning sektion: 1 min med 1 M natriumhydroxid (i vand), 5 min med 75 mM natriumboratpuffer ved pH 9.2.
- I injektion sektionen, indstille parametre for en hydrodynamisk injektion med 30 mbar tryk i 10 sek for alle metoder. I adskillelsessektion, indstille separationsbetingelserne til 30 kV ved 25 ° C i 9 min for alle metoder.
BEMÆRK: Se brugervejledningen specifik CE instrument som procedure for betjening af CE instrument kan variere mellem producenterne. Forbered 1 M natriumhydroxidopløsning på dagen.
- Injicer og adskille en neutral intern standard (10 pi 10% v / v dimethylsulfoxid (DMSO), i vand fortyndet i 450 pi 75 mM natriumboratpuffer). Så injicere og adskilt på samme måde en oligoacrylate standard (opløst i ultrarent vand ved 10 g ∙ L -1, se Liste over Materials) til at kontrollere gyldigheden af kapillær. Pause sekvensen her indtil podningsreaktionen er klar til start.
6. Podning af RGDS onto chitosan Film
- Afvej peptid (1 mg RGDS)og koblingsmidler (3 mg EDC-HCI og 2 mg NHS).
- 2 timer efter starten af den chitosan film iblødsætning i PBS, opløse peptidet og koblingsmidler i 5 ml PBS.
- Tag en 50 pi alikvot af denne opløsning. Tilsæt 2 pi 10% v / v DMSO i vand som en intern neutral standard til portionen. Analyser delprøve med CE (se trin 7).
- Fjern de 5 ml PBS bruges til skylning af chitosan film fra petriskålen. Tilsæt 5 ml opløsning af peptid- og koblingsmidler til petriskålen indeholdende chitosan film.
- Dæk petriskål med paraffin film og læg den på en orbitalryster ved stuetemperatur. Tag 50 pi prøver af reaktion medier på bestemte tidspunkter.
BEMÆRK: Den samlede analysetid med CE er 15 min, således en alikvot kan tages hver 15 min (eller hver 30 min, hvis to reaktioner overvåges i parallel, etc.).- Tilsæt 2 pi 10% v / v DMSO i vand som en intern neutral standard til hver aliquot.
BEMÆRK: Prøver skal analyseres med CE, så snart de er taget (se trin 7).
- Tilsæt 2 pi 10% v / v DMSO i vand som en intern neutral standard til hver aliquot.
- Efter 4 timer af rystelser og alikvot fjernelse, fjerne petriskålen fra shakeren. Fjern reaktionsmediet fra petriskålen. Der tilsættes 5 ml PBS for at skylle de chitosan film.
- Fjern PBS fra petriskålen, skylles chitosan film med ultrarent vand og lad dem tørre natten over. Fjern ultrarent vand og opbevares filmene ved -20 ° C i en plast Petri-skål.
7. Overvågning af Podning Reaction Brug CE
- Sprøjt og separate portioner af reaktions- medier umiddelbart efter fjernelse fra petriskålen ved hjælp af analyse betingelser som i afsnit 5.2.
- Ved afslutningen af de separationer skylles kapillaret med ultrarent vand i 10 min. Tør det gennem en flush med en tom hætteglas (luft) i 10 minutter.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause i denne fase.
8. data Trea tment for CE
- Tjek gyldigheden af hver separation, ved at kontrollere, at både den nuværende under separation og migration tidspunktet for den elektroosmotiske mobilitet markør (DMSO i dette tilfælde) svarer til de observerede for oligoacrylate standard adskillelse dem.
BEMÆRK: Op til 10-15% variation er acceptabel fra den forventede nuværende værdi af omkring 50 uA og migration tidsmæssige værdi af 1,3 min (elektroforetiske mobilitet værdier bør anvendes i stedet for migration gange, hvis en højere gentagelsesnøjagtighed er påkrævet). - For hver succesfuld separation, eksportere rådata fra kapillarelektroforese software ved at vælge et bestemt datasæt, højre klikke på eksport og vælge et passende signal.
- Konvertere de rå data, der registreres af CE (præsenteret som UV-absorbans som funktion af migration tid). Konverter X-aksen (migration tid t m) i en elektroforetisk mobilitet μ følgende ligning 1:
n 1 "src =" / files / ftp_upload / 54.549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
hvor L d er længden til detektoren, L t er den totale længde af kapillarrøret, V er den spænding, og t eo er migrationen cirka en neutral specie (DMSO intern standard i dette tilfælde) 27.
Konverter Y-aksen af rådata (absorbans i AU) til en fordeling af elektroforetiske mobiliteter W (μ) efter ligning 2: 28
(2)
(2) 9. Supplerende Karakterisering af Peptid-transplanterede Films 18
- Indsæt peptid-transplanterede chitosan film, valset omkring sig selv, i en 4 mm faststof NMR rotor. Fyld rotoren med phosphatbufret saltvand for at kvælde filmene, og luk rotoren. Vente et par timer.
- Analyser filmen med 13 </ sup> C NMR spektroskopi 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CE er velegnet til overvågning af podning af peptider (f.eks RGDS) mere på chitosan film. Egnede koblingsmidler indbefatter EDC-HCI og NHS som aktiverer peptid, der skal podes på chitosan (figur 1). CE er i stand til at adskille de forskellige molekyler af interesse fra reaktionsmediet. For at tildele toppene på elektroferogrammet, rene RGDS, EDC, HCI og NHS blev opløst, injiceres og adskilt hver for sig. Efter højdepunktet opgaven blev reaktionsmediet injiceres og de forskellige reaktanter blev identificeret (figur 2). EDC-HCl omsættes til et biprodukt EDH-HCI (3 - (((ethylamino) (hydroxy) methylen) amino) - N, N -dimethylpropan-1-amin). Dimethylsulfoxid (DMSO) anvendes som en intern standard for CE separationer. Chitosan er til stede i podning eksperiment i form af uopløselige film og er således ikke indsprøjtet eller observeret i CE. Bemærk at for alle rådata, than indspillede migration tidsakse omdannes til en elektroforetisk mobilitet akse (ligning 1) og UV-absorbans akse i en fordeling af elektroforetiske mobiliteter W (μ) (ligning 2).
Da alikvoter taget fra reaktionsmediet de anbringes i CE instrument og injiceres. Omfanget af reaktionen overvåges gennem faldet af toppen forbundet med RGDS (figur 3). Det kan også ses, at EDC-HCI peak falder, mens EDH-HCI spidsbelastninger over tid. Det er vigtigt at bemærke, at der ikke er noget signal, som kan henføres til et produkt fra en sidereaktion af peptidet, er det derfor antaget, at RGDS fjernes fra reaktionsmediet bliver podet på chitosan film. Overlejrede elektroferogrammer (figur 3A) tillader kvantificering af peptid forbrug fra starten til slutningen af reaktionen. Det skal bemærkes, atselvom kinetikken oprindeligt blev målt i 18 timer (figur 3B), blev 4 timer anses for tilstrækkelig for at reaktionen kan forløbe til sin maksimale udstrækning. At tillade kvantificering en optimal injektionsvolumen skal sikre signal-til-støj-forholdet er højt nok samtidig forhindre overbelastning (figur 4A) og i tilfælde af RGDS blev injektioner skal være afsluttet i realtid for at forhindre polykondensation (figur 4B ).
CE-baserede teknikken beskrevet her for at analysere peptid podning til chitosan film er hurtig og enkel; imidlertid er det ikke kvantificere podningsprocessen direkte. NMR-spektroskopi bruges til at demonstrere podning; denne måling kan ikke ske i realtid (det typisk tager flere timer), og skal være afsluttet efter reaktion. Den kvalitative sammenligning af chitosan film før og efter podning viser vellykket podning af peptiderne throUH udseendet af et signal ved 70 ppm i de podede film svarer til amidbinding mellem chitosan og peptidet (figur 5).
Figur 1. Scheme af podning reaktion. Kemisk reaktionsskema viser aktivering med EDC-HCI og NHS af carboxylsyre funktionel gruppe RGDS efterfulgt af podning på chitosan film overflade. Klik her for at se en større version af dette tal .
Figur 2. Peak tildelingen af arten, der findes i reaktionsmediet. A. Adskillelse og peak opgave for opløsninger af delvist hydrolyseret EDC -HCI (Lyserød), RGDS (rød), NHS (blå), såvel som for PBS (lilla) og reaktionsmediet (sort). B. elektroferogrammer af reaktionsmedier (sort) præsenteret som en funktion af migration tid (elektroforetisk mobilitet bør bruges til at overvinde dårlig repeterbarhed i migration gange). klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. CE overvågning af RGDS forbrug. (A) Overlaid peptidtoppe på reaktionstid 30 min (lilla optrukket linje), 60 min (magenta punkterede linie), 90 min (blå optrukket linje), 120 min (grøn stiplet linie), 150 min (rød optrukket linje) og (B) kinetik podning afsluttet i løbet af 18 timer i gentagelser (firkant og cirkel).pload / 54.549 / 54549fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. overlejrede peptid toppe i reaktion medier viser suboptimale resultater (A) Varierende (hydrodynamiske) injektion gange:. 5 sek (blå linje), 10 sek (sort linje), 20 sek (rød linje) og 30 sek (magenta linje) . (B) Reaction medier tilbage i en CE hætteglas i en længere periode, før injektion:. 30 min (rød linje) og 90 min (blå linje) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. 13C opsvulmet-NMR spektre af chitosan film. Sammenligning af filmene før (sort linie) og efter (blå linie) peptid podning. Signaler der kun findes i spektret optaget efter podning er angivet med en asterisk. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkelheden i protokollen beskrevet her gør det velegnet til udbredt anvendelse. skal dog særlig opmærksomhed, der skal betales til af følgende centrale trin.
Korrekt CE forberedelse instrument
Det er vigtigt at adskille en kendt standard umiddelbart før adskillelsen af ukendte prøver (såvel som ved afslutningen af en række separationer) til at kontrollere gyldigheden af kapillæren og instrumentet på dagen. Denne standard kan være en oligoacrylate 27 eller en hvilken som helst prøve kendt for at give flere toppe over et bredt sortiment af migration gange. Overvågning af strømmen under alle separationer og analysere migration af en neutral markør i hver separation er vigtige skridt til at identificere problemer. Et ustabilt nuværende eller store variationer (mere end 10-15%) i plateau værdien af strømmen kan skyldes uoverensstemmelse i puffer (pH eller koncentration). Hvis den efterfølges af en forsinket migration tid af den neutrale maker det kan også skyldes kapillarrøret ikke er tilstrækkeligt rene. Rutinemæssig kontrol af pH i bufferen og en ekstra tømning af kapillarrøret i 10 min med 1 M natriumhydroxid (frisk fremstillet) kan anvendes til at forhindre / ændre dette problem. Under eksperimentet kan ekstra trin rengøring anvendes til at sikre en optimal separation, typisk indbefatter eller forlænge en flush med koncentreret vandig natriumhydroxid for at regenerere sikringen silica kapillær overflade.
Korrekt data behandling
Ved afslutningen af eksperimentet, passende behandling af de rå data er afgørende, når man sammenligner resultater. Dette indebærer omdannelse af X og Y-aksen opnået fra CE instrument (trin 8.3). De migration gange bestemt i CE har en forholdsvis dårlig repeterbarhed og vi anbefaler at bruge elektroforetiske mobiliteter i stedet, hvilket fører til en langt bedre gentagelsesnøjagtighed. Betydningen af korrekt t PRETTELSE data er tidligere blevet vist med separation og karakterisering af chitosan 10, poly (acrylsyre) 29, blokcopolymerer 13 og påvisning af sukker i morgenmadsprodukter 8 gennem mindre standardafvigelser (RSD) observeret mellem eksperimenter for mobilitet end for migration gange . Endvidere CE har vist sig at være mere robuste end HPLC i adskillelsen af monosaccharider i komplekse matricer 5. Andre trin i optimeringen kan indbefatte justering af Injektionsvolumen (cirka injektion) for at muliggøre separation med god følsomhed uden at forårsage overbelastning hvilket ville forhindre kvantificering. En injektion på cirka 10 sek anses optimal ved 30 mbar (figur 4B): en kortere injektionstid fører til en nedsat følsomhed mens længere injektionstider føre til en topform forvrængning indikerer kapillær overbelastning.
Betydningen af real-time overvågning
ove_content "> en kritisk styrken af denne CE-baserede metode er evnen til at overvåge reaktioner i realtid. Dette kræver optimale CE betingelser til påvisning og adskillelse af de relevante reaktant (er) og / eller produkt (er). Endvidere er det for analyse af kemiske reaktioner et passende tidspunkt nul skal tages som benchmark af reaktionen, hvilket består typisk i adskillelsen af de målte ud reaktanter lige før reaktionen starter dette kan gøres for eksempel før en bestemt reaktant indføres, før. temperaturen forøges, eller før UV-bestråling er begyndt at udløse reaktionen.I tilfælde af podningen af peptidet RGDS (onto chitosan eller til et andet substrat), peptidet er i stand til at reagere med sig selv til frembringelse af lineære oligomerer eller forgrenede strukturer gennem polykondensation 18. Dette skyldes, RGDS indeholder både amin og carboxylsyre funktionelle grupper. Disse peptidoligomerer har ikke den samme electrophoretic mobilitet som de oprindelige peptid RGDS, og derfor kan forårsage en unøjagtig kvantificering, gennem for eksempel co-migration med andre arter. Det er derfor vigtigt at sikre, at portioner af reaktionsmediet injiceres og adskilt inden for et par minutters bliver taget fra reaktionsmediet (figur 4B).
Korrekt forberedelse af chitosan film
Når specifikt beskæftiger sig med chitosan film er der en række skridt til at overholde. Under fremstillingen af chitosan film, skal overlades til tørre i mindst 7 dage (fortrinsvis flere) filmene. Hvis dette ikke er afsluttet, når filmene er placeret i PBS-buffer til at skylle de vil opløses i stedet danne en kvældet film, som derefter forhindrer de næste trin. Desuden er det vigtigt at neutralisere filmen forud for podningsreaktionen til fjernelse af eventuelt resterende eddikesyre, som kan udvaskes af filmen og konkurrere medpeptidet for podningsreaktionen 18. Dette kan gøres gennem iblødsætning i fortyndet vandig natriumhydroxid eller i PBS. PH af pufferen anvendt som opløsningsmiddel for podningsreaktionen er også kritisk: hvis det er for surt filmene vil delvist eller fuldstændigt opløst. Under podningsreaktionen er det vigtigt, at filmen er i stand til at have maksimal kontakt med reaktionsopløsningen. Derfor er petriskålen indeholdende filmene og reaktionsblandingen placeret på et rysteapparat. Det er også nødvendigt at forhindre fordampning af reaktionsblandingen for at forhindre ukontrollerede koncentration variationer resulterer i unøjagtige kvantificeringer; anvendelsen af paraffin film til dækning petriskålen var effektiv til at forhindre det.
Den væsentligste begrænsning af CE teknik er, at individuelt det ikke er i stand til at bekræfte podning processen. I forbindelse med den kemiske podning proces nævnt ovenfor kvantificering af peptidet podning er indirekte. Dennekan overvindes ved anvendelse af en komplementær teknik, såsom faststof NMR spektroskopi som tidligere nævnt. Andre begrænsninger for CE teknik omfatter, at det kræver forbindelsen af interesse, der skal opkræves. neutrale arter vil derfor migrere samtidigt. I visse tilfælde kan overvindes, hvis forbindelsen af interesse komplekser med borat. Endelig Hvis forbindelsen af interesse ikke indeholder kromoforer detektion bortset UV såsom ledningsevne kan være nødvendigt at blive brugt. Dette kræver yderligere køb af en ledningsevne detektor, som kræver optimering.
Fordele ved at analysere peptid podning via CE vs andre analysemetoder
CE metode har flere fordele i forhold alternative indirekte metoder, herunder højtryksvæskechromatografi (HPLC), aminosyreanalyse (AAA) og den direkte metode til NMR-spektroskopi. Sammenlignet med AAA det er en høj-throughput, robust metode which gør det muligt at analysere komplekse prøver effektivt uden kedelig prøveforberedelse. Dette er fordelagtigt, især ved analyse af kemiske reaktioner i realtid. HPLC er tidligere blevet anvendt for peptid podning analyse 30, men det blev anset for kun semikvantitativ. CE har en lavere driftsomkostninger end HPLC og kræver ikke prøve filtrering før analyse, hvilket minimerer risikoen for prøvetab 5. Selvom 13C NMR spektroskopi er i stand til direkte at måle produktet af interesse, er det en kostbar teknik og er ikke i stand til at måle det i realtid.
Protokollen descripted her tilvejebringer en hurtig, effektiv, billig og pålidelig fremgangsmåde til optimering peptid grafting til chitosan film. Denne nye fremgangsmåde tilvejebringer således betydelige fordele for at skræddersy cellevedhæftningsfaktorer egenskaber af chitosan film sammenlignet med traditionelt anvendte metoder, såsom kromatografi og AAA. Denne CE metode kan bruges til at overvåge en rækkeaf andre kemiske reaktioner i realtid, typisk reaktioner forekommer på tidsrammen for flere HR, hvor der / kan oplades reaktanterne produkter af interesse. I dette tilfælde er det dog vigtigt at bemærke, at CE-metoden bør optimeres inden analysen af en anden kemisk reaktion til at tillade en vellykket analyse. Dette omfatter analyser af de rene reaktanter og produkter før reaktionen for at tillade dem at blive identificeret og sikre, at de kan påvises og adskilles, samt at sikre, at ingen forurenende stoffer kan forhindre kvantificering. Adskillelsen kan forbedres, og den totale analysetid ændres ved at variere den kapillære længde, buffer sammensætning og spænding, og potentielt ved anvendelse af en kapillær med coatede vægge. Påvisningen kan forbedres ved at modificere de betingelser, hvorunder prøven injiceret at favorisere de ladede reaktanter eller ved at indsprøjte en større mængde af prøven i kapillarrøret. Endvidere kan andre detektorer bortset fra UV detektion be anvendes, herunder fluorescens, kontaktløs ledningsevne detektorer eller CE kan kobles til et massespektrometer. Muligheden for at overvåge reaktioner i realtid giver podningsreaktionen skal udføres direkte i en CE hætteglas hvis substratet er i opløsning og er i stand til at blive analyseret af CE. Dette kan ske direkte inde CE instrument, som vi for nylig udførte det til podning af aminoantipyrin på poly (acrylsyre) 7 Endvidere er denne fremgangsmåde ikke begrænset til grafting reaktioner, men kan udvides til at overvåge forskellige andre kemiske reaktioner. Endvidere er overvågningen af reaktionerne muliggør optimering af reaktionen og kan også benyttes til at validere produktet af reaktionen. Så længe den pågældende forbindelse kan opløses og opladet, CE metode giver hurtig, billig og robust adskillelse, detektion og kvantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid - Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride - Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate - Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate - Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid - Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
- Muthukumar, M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. Electrophoresis. 17, 1167-1172 (1996).
- Barrat, J. L., Joanny, J. F. in Advances in Chemical Physics, Vol Xciv Vol. 94 Advances in Chemical Physics. , John Wiley & Sons Inc. 1-66 (1996).
- Fu, S. L., Lucy, C. A. Prediction of electrophoretic mobilities. 1. Monoamines. Anal. Chem. 70, 173-181 (1998).
- Harvey, D. Modern Analytical Chemistry. , McGraw Hill. (2000).
- Oliver, J. D., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust determination of monosaccharides in plant fibers in complex mixtures by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1291, 179-186 (2013).
- Oliver, J. D., Sutton, A. T., Karu, N., Phillips, M., Markham, J., Peiris, P., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust monitoring of ethanol fermentations by capillary electrophoresis. Biotechnology and Applied Biochemistry. 62, 329-342 (2015).
- Thevarajah, J. J., Sutton, A. T., Maniego, A. R., Whitty, E. G., Harrisson, S., Cottet, H., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantifying the Heterogeneity of Chemical Structures in Complex Charged Polymers through the Dispersity of Their Distributions of Electrophoretic Mobilities or of Compositions. Anal. Chem. 88, 1674-1681 (2016).
- Toutounji, M. R., Van Leeuwen, M. P., Oliver, J. D., Shrestha, A. K., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantification of sugars in breakfast cereals using capillary electrophoresis. Carbohydr. Res. 408, 134-141 (2015).
- Miramon, H., Cavelier, F., Martinez, J., Cottet, H. Highly Resolutive Separations of Hardly Soluble Synthetic Polypeptides by Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 82, 394-399 (2010).
- Mnatsakanyan, M., Thevarajah, J. J., Roi, R. S., Lauto, A., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6873-6877 (2013).
- Taylor, D. L., Ferris, C. J., Maniego, A. R., Castignolles, P., in het Panhuis, M., Gaborieau, M. Characterization of Gellan Gum by Capillary Electrophoresis. Australian Journal of Chemistry. 65, 1156-1164 (2012).
- Thevarajah, J. J., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation and characterization of synthetic polyelectrolytes and polysaccharides with capillary electrophoresis. Adv. Chem. 2014, 798503 (2014).
- Sutton, A. T., Read, E., Maniego, A. R., Thevarajah, J., Marty, J. -D., Destarac, M., Gaborieau, M., Castignolles, P. Purity of double hydrophilic block copolymers revealed by capillary electrophoresis in the critical conditions. J. Chromatogr. A. 1372, 187-195 (2014).
- Righetti, P. G., Sebastiano, R., Citterio, A. Capillary electrophoresis and isoelectric focusing in peptide and protein analysis. Proteomics. 13, 325-340 (2013).
- Ali, I., Al-Othman, Z. A., Al-Warthan, A., Asnin, L., Chudinov, A. Advances in chiral separations of small peptides by capillary electrophoresis and chromatography. J. Sep. Sci. 37, 2447-2466 (2014).
- Kasicka, V. Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013). Electrophoresis. 35, 69-95 (2014).
- JoVE Science Education Database. Capillary Electrophoresis (CE). Essentials of Analytical Chemistry. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/10226/capillary-electrophoresis-ce (2016).
- Taylor, D. L., Thevarajah, J. J., Narayan, D. K., Murphy, P., Mangala, M. M., Lim, S., Wuhrer, R., Lefay, C., O'Connor, M. D., Gaborieau, M., Castignolles, P. Real-time monitoring of peptide grafting onto chitosan films using capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 407, 2543-2555 (2015).
- Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603-632 (2006).
- Li, Z., Leung, M., Hopper, R., Ellenbogen, R., Zhang, M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31, 404-412 (2010).
- Domard, A. A perspective on 30 years research on chitin and chitosan. Carbohydr. Polym. 84, 696-703 (2011).
- Shekaran, A., Garcia, A. J. Nanoscale engineering of extracellular matrix-mimetic bioadhesive surfaces and implants for tissue engineering. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1810, 350-360 (2011).
- Custodio, C. A., Alves, C. M., Reis, R. L., Mano, J. F. Immobilization of fibronectin in chitosan substrates improves cell adhesion and proliferation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 316-323 (2010).
- Boateng, S. Y., Lateef, S. S., Mosley, W., Hartman, T. J., Hanley, L., Russell, B. RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C30-C38 (2005).
- Lefay, C., Guillaneuf, Y., Moreira, G., Thevarajah, J. J., Castignolles, P., Ziarelli, F., Bloch, E., Major, M., Charles, L., Gaborieau, M., Bertin, D., Gigmes, D. Heterogeneous modification of chitosan via nitroxide-mediated polymerization. Polym. Chem. 4, 322-328 (2013).
- Gartner, C., Lopez, B. L., Sierra, L., Graf, R., Spiess, H. W., Gaborieau, M. Interplay between Structure and Dynamics in Chitosan Films Investigated with Solid-State NMR, Dynamic Mechanical Analysis, and X-ray Diffraction. Biomacromolecules. 12, 1380-1386 (2011).
- Castignolles, P., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Sprong, E., Ferguson, C. J., Gilbert, R. G. High resolution separation of oligo(acrylic acid) by capillary zone electrophoresis. Macromol. Rapid Commun. 27, 42-46 (2006).
- Chamieh, J., Martin, M., Cottet, H. Quantitative Analysis in Capillary Electrophoresis: Transformation of Raw Electropherograms into Continuous Distributions. Anal. Chem. 87, 1050-1057 (2015).
- Maniego, A. R., Ang, D., Guillaneuf, Y., Lefay, C., Gigmes, D., Aldrich-Wright, J. R., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of poly(acrylic acid) salts according to topology using capillary electrophoresis in the critical conditions. Anal. Bioanal. Chem. 405, 9009-9020 (2013).
- Chung, T. W., Lu, Y. F., Wang, S. S., Lin, Y. S., Chu, S. H. Growth of human endothelial cells on photochemically grafted Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) chitosans. Biomaterials. 23, 4803-4809 (2002).
