Abstract
electroforesis capilar-solución libre (CE) separa los analitos, compuestos generalmente practicados en solución a través de la aplicación de un campo eléctrico. En comparación con otras técnicas de separación analíticas, tales como cromatografía, CE es barato, robusto y eficaz no requiere la preparación de muestras (para una serie de matrices naturales complejos o muestras poliméricas). CE es rápido y se puede utilizar para seguir la evolución de las mezclas en tiempo real (por ejemplo, cinética de la reacción química), ya que las señales observadas para los compuestos separados son directamente proporcionales a su cantidad en solución.
Aquí, la eficiencia de la CE se demuestra para el seguimiento del injerto covalente de los péptidos en las películas de quitosano para aplicaciones biomédicas posteriores. propiedades antimicrobianas y biocompatibles de quitosano lo convierten en un material atractivo para aplicaciones biomédicas tales como sustratos para el crecimiento celular. Covalentemente injerto de los RGDS de péptidos (arginina - glicina -ácido aspártico - serina) sobre la superficie de películas de quitosan tiene por objeto mejorar la unión celular. Históricamente, cromatografía y análisis de aminoácidos han sido utilizados para proporcionar una medición directa de la cantidad de péptido injertado. Sin embargo, la separación rápida y la ausencia de preparación de la muestra proporcionada por CE permite el monitoreo en tiempo real igualmente precisa todavía de el proceso de injerto de péptidos. CE es capaz de separar y cuantificar los diferentes componentes de la mezcla de reacción: la (no injertado) péptido y los agentes de acoplamiento químico. De esta manera el uso de CE resulta en películas mejoradas para aplicaciones de aguas abajo.
Las películas de quitosano se caracterizaron mediante espectroscopía de RMN de estado sólido (resonancia magnética nuclear). Esta técnica es más tiempo y no se puede aplicar en tiempo real, pero da una medición directa del péptido y por lo tanto valida la técnica de la CE.
Introduction
Electroforesis capilar solución libre (CE) es una técnica que separa compuestos en soluciones basadas en su relación de 1,2-carga a la fricción. Relación de carga de tamaño se menciona a menudo en la literatura, pero esta simplificación no se aplica a los polielectrolitos, incluyendo polipéptidos en este trabajo, y también se demuestra que no es apropiado para pequeñas moléculas orgánicas 3. CE se diferencia de otras técnicas de separación en que no tiene una fase estacionaria, solamente un electrolito de fondo (generalmente un tampón). Esto permite que la técnica sea robusto en su capacidad para analizar una amplia gama de muestras con matrices complejas 4 tales como fibras vegetales 5, cervezas de fermentación de 6 injerto sobre polímeros sintéticos 7, muestras de alimentos 8, y péptidos difícilmente solubles 9 sin preparación de la muestra tedioso y purificación. Esto es especialmente significativo para polielectrolitos complejos que tienen problemas de disolución (sUCH como quitosano 10 y gellan goma 11) y por lo tanto existe como agregado o precipitado en la solución y se han analizado con éxito sin la filtración de la muestra. Además, el análisis de azúcares en los cereales para el desayuno implicado la inyección de muestras con partículas de muestras de cereales para el desayuno precipitado en agua 8. Esto también se extiende al análisis de polielectrolitos o copolímeros 12,13 ramificados. Mucho trabajo también se ha completado en el desarrollo de técnicas de CE específicamente para el análisis de proteínas para la proteómica 14, la separación quiral de los péptidos naturales o sintéticos 15 y separaciones de microchips de proteínas y péptidos 16. Dado que la separación y análisis se llevan a cabo en un capilar, solamente pequeños volúmenes de muestra y los disolventes se utilizan que permite CE tener un coste de funcionamiento inferior a otras técnicas de separación incluyendo cromatografía 5,6,17. Dado que la separación por CE es rápido, permite que el monitoanillo de la cinética de reacción. Esto se demostró en el caso de los injertos de los péptidos en las películas de quitosano para mejorar la adhesión de las células 18.
El quitosano es un polisacárido derivado de la -deacetylation N de la quitina. Películas de quitosan se pueden utilizar para diversas aplicaciones biomédicas tales como bioadhesivos 19 y sustratos de crecimiento celular 18,20, debido a la biocompatibilidad de quitosano 21. La unión celular a las proteínas de la matriz extracelular específicas, tales como fibronectina, colágenos y laminina, está directamente relacionada con la supervivencia de las células 22. Notablemente, diferentes tipos de células a menudo requieren fijación a diferentes proteínas de la matriz extracelular para la supervivencia y la función apropiada. La unión celular a las películas de quitosano ha demostrado ser mejorado mediante el injerto de fibronectina 23; Sin embargo, la preparación, la purificación y el injerto de tales proteínas grandes no es económicamente viable. Alternativamente una serie de pequeños péptidos VHAe ha demostrado que es capaz de imitar las propiedades de las grandes proteínas de la matriz extracelular. Por ejemplo, los péptidos tales como los RGD miméticos fibronectina (arginina - glicina - ácido aspártico) y RGDS (arginina - glicina - ácido aspártico - serina) se han utilizado para facilitar y aumentar la unión celular 24. Covalente injerto de MFG sobre pelıculas de quitosano dio lugar a la unión celular mejorada para las células conocidas para unir a la fibronectina in vivo 18. La sustitución de proteínas más grandes le gusta la fibronectina con péptidos más pequeños que tienen la misma funcionalidad proporciona una importante reducción de costes.
Aquí, se realizó péptido injerto de quitosano como publicado previamente 18. Como se ha demostrado anteriormente, este enfoque proporciona injerto simple y eficiente mediante el uso de los agentes de acoplamiento EDC-HCl (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) y NHS (N -hidroxisuccinimida) para funcionalizar el ácido carboxílico de los RGDS ser injertado en lapelícula de quitosano. Dos ventajas de este método de injerto son que no requiere ninguna modificación del quitosano o del péptido, y se llevaron a cabo en medio acuoso para maximizar la compatibilidad con futuras aplicaciones de cultivo celular 18,20. Como los agentes de acoplamiento y el péptido pueden ser cargadas, CE es un método adecuado para el análisis de la cinética de reacción. Es importante destacar que, el análisis de la cinética de reacción a través de CE permite la supervisión en tiempo real de la reacción de injerto, y por lo tanto permite tanto la optimización y cuantificar el grado de injerto.
Si bien no es habitualmente necesario, los resultados del análisis CE se pueden validar fuera de línea por una medición directa del péptido injerto sobre las películas de quitosan mediante RMN en estado sólido (resonancia magnética nuclear) espectroscopia de 25,26 para demostrar el injerto covalente del péptido sobre la película 18. Sin embargo, en comparación con la espectroscopía de RMN en estado sólido, el análisis en tiempo real proporcionada porCE permite la cuantificación de la consumo de péptido en tiempo real y por lo tanto la capacidad de evaluar la cinética de la reacción.
El método mencionado anteriormente es simple y permite el análisis en tiempo real de péptido injerto sobre películas de quitosan con cuantificación indirecta de la extensión de la de injerto. El método demostrado se puede extender a la evaluación cuantitativa en tiempo real de las diferentes reacciones químicas, siempre que los reactivos o los productos a ser analizados se puede cargar.
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Protocol
1. Preparación de quitosano Films
- Pesar 2 g de ácido acético glacial, completa a 100 ml con agua ultrapura.
- Pesar 1,7 g de polvo de quitosano, añadir 100 ml de la solución al 2% m / m de ácido acético acuoso. Se agita durante 5 días con barra de agitación y placa de agitación magnética a temperatura ambiente, ya sea cubierto con papel de aluminio o en la oscuridad.
- Se centrifuga la dispersión de quitosano a 1.076 xg, a 23 ° C durante 1 hora. Recoger el sobrenadante con una jeringa y desechar el precipitado.
- Para cada película, alícuota de 10 ml de la suspensión de quitosano en un plato de plástico de 9 cm de Petri a temperatura ambiente. Deje las películas cubiertas secar durante al menos 7 días.
- Con unas tijeras cortan las películas secas en 1 x 1 cm cuadrados. Nota: El experimento se puede detener en esta etapa.
2. Preparación de solución salina tamponada con fosfato (PBS)
- Pesar 8 g de cloruro de sodio, 0,2 g de cloruro de potasio, 1,44 g de hidrógeno disódico phosfosfato y 0,24 g de fosfato de dihidrógeno de potasio.
- Disolver estos productos químicos pesaron en 800 ml de agua ultrapura y se valora la solución con ácido clorhídrico concentrado a pH 7,4.
Nota: El experimento se puede detener en esta etapa.
3. Preparación de 75 mM borato de sodio tampón a pH 9,2
- Pesar 3,0915 g de ácido bórico. Disolver en 75 ml de agua ultrapura.
- Valorar la solución de ácido bórico a un pH de 9,2 con una solución de hidróxido de sodio a una concentración de 10 M o superior.
Precaución: Concentrado soluciones de hidróxido sódico son corrosivos y deben ser manejados con guantes. - Completar con agua ultrapura para obtener 100 ml de solución. Esto produce un tampón de borato de sodio 500 mM a pH 9,2.
- Diluir el tampón de borato de sodio 500 mM con agua ultrapura a un tampón de borato de sodio 75 mM. Nota: El experimento se puede detener en esta etapa.
4. Preparación de Chitosan FiLMS para la reacción de injerto
- Enjuague 10 películas de quitosano cuadrados (1 x 1 cm) en 5 ml de PBS durante 2 horas en una placa de Petri a temperatura ambiente.
- Durante este tiempo, preparar y validar el instrumento de electroforesis capilar (paso 5).
5. Preparación y Validación de la Electroforesis Capilar Instrumento
- Preparar un capilar de sílice fundida de 43,5 cm desnudo con un diámetro interno de 50 mm (43,5 cm es la longitud total, la longitud efectiva de la ventana de detección es típicamente 35 cm) por el debilitamiento de la capa exterior de polímero del capilar a la longitud de conjunto con una objeto sin punta luego de tomar la capilaridad.
- Crear una ventana para el capilar mediante el uso de un encendedor para quemar el revestimiento de polímero a 8,5 cm de la entrada y después de enfriarse limpie con etanol. Grabar el recubrimiento del capilar en cada extremo por unos pocos milímetros con un encendedor, y después de que se enfríe limpie con etanol.
- INSI capilar lugarventana de detección e instalarlo en el casete capilar colocándolo en longitudes iguales en la entrada y la salida y enrollándolo alrededor de los ejes de la casete. A continuación, instalar el casete en el instrumento de electroforesis capilar.
- Establecer los parámetros del método para cada separación. En el menú del software seleccione "método" y luego "editar el método completo". Ajustar la temperatura, el tiempo, la tensión, y los viales utilizados para la separación (por ejemplo 25 ° C, 10 min, 30 kV).
- En la sección de pre-acondicionado, establecer los rubores consecutivos: 10 min con hidróxido sódico 1 M (en agua), 5 min con hidróxido de sodio 0,1 M (en agua), 5 min con agua ultrapura y 5 min con tampón de borato de sodio 75 mM a pH 9,2 para el primer método de una serie de análisis.
- Para los métodos siguientes, establecer el conjunto de los sofocos consecutivos en la sección de pre-acondicionamiento: 1 min con hidróxido de sodio 1 M (en agua), 5 min con tampón de borato de sodio 75 mM a pH 9.2.
- En la sección de inyección, establecer los parámetros para una inyección hidrodinámica con una presión de 30 mbar durante 10 seg para todos los métodos. En la sección de separación, establecer las condiciones de separación a 30 kV a 25 ° C durante 9 min para todos los métodos.
NOTA: Consulte el manual de usuario del instrumento CE específico como procedimiento para el funcionamiento del instrumento CE puede variar entre los fabricantes. Preparar la solución de hidróxido de sodio 1 M en el día.
- Inyectar y separar un estándar interno neutral (10 l de 10% v / v sulfóxido de dimetilo (DMSO), en agua diluida en 450 l de tampón de borato de sodio 75 mM). A continuación, inyectar y separar de la misma manera un estándar oligoacrylate (disuelto en agua ultrapura a 10 g ∙ L-1; ver Lista de Materiales) para comprobar la validez del capilar. Una pausa en la secuencia de aquí hasta que la reacción de injerto está listo para comenzar.
6. El injerto de MFG Onto quitosano Cine
- Se pesa el péptido (1 mg MFG)y los agentes de acoplamiento (3 mg EDC-HCl y 2 mg de NHS).
- 2 hr después del inicio de la película de quitosan remojo en PBS, se disuelve el péptido y los agentes de acoplamiento en 5 ml de PBS.
- Tomar una alícuota de 50 l de esta solución. Añadir 2 l de 10% v / v de DMSO en agua como un estándar neutral interna a la parte alícuota. Analizar la alícuota con el CE (véase el paso 7).
- Eliminar los 5 ml de PBS usan para enjuagar las películas de quitosano de la placa de Petri. Añadir la solución de 5 ml de los agentes peptídicos y de acoplamiento a la placa de Petri que contiene las películas de quitosano.
- Cubrir la placa de Petri con una película de parafina y colocarlo en un agitador orbital a temperatura ambiente. Tomar 50 ml de alícuotas de medios de reacción a horas fijas.
NOTA: El tiempo total de análisis con el CE es de 15 minutos, por lo que una parte alícuota se puede tomar cada 15 minutos (o cada 30 minutos si dos reacciones se controlan en paralelo, etc.).- Añadir 2 l de 10% v / v de DMSO en agua como un estándar interno neutral a cada aliquot.
NOTA: Las alícuotas deben ser analizados con el CE en cuanto se toman (véase el paso 7).
- Añadir 2 l de 10% v / v de DMSO en agua como un estándar interno neutral a cada aliquot.
- Después de 4 horas de agitación y remoción alícuota, retire la placa de Petri desde el agitador. Retire el medio de reacción de la placa de Petri. Añadir 5 ml de PBS para enjuagar las películas de quitosano.
- Retire la PBS de la placa de Petri, enjuague la película de quitosano con agua ultrapura y dejar que se sequen durante la noche. Eliminar el agua ultrapura y almacenar las películas a -20 ° C en una placa Petri de plástico.
7. Seguimiento de reacción de injerto Utilizando CE
- Inyectar y alícuotas separadas del medio de reacción inmediatamente después de la retirada de la placa de Petri utilizando las condiciones de análisis que en el apartado 5.2.
- Al término de las separaciones enjuagar el capilar con agua ultrapura para 10 min. Secar a través de una escalera con un vial vacío (aire) durante 10 min.
NOTA: El experimento se puede detener en esta etapa.
8. Los datos Trea tamento para CE
- Comprobar la validez de cada separación, comprobando que tanto la corriente durante la separación y el tiempo de migración del marcador de la movilidad electroosmótico (DMSO en este caso) son similares a los observados para el oligoacrylate separación estándar.
NOTA: Hasta 10-15% variación es aceptable desde el valor actual esperado de unos 50 mu y el valor de tiempo de migración de 1,3 min (valores de movilidad electroforética se deben utilizar en lugar de los tiempos de migración si se requiere una repetibilidad superior). - Para cada separación exitosa, exportar los datos en bruto procedentes del software de electroforesis capilar mediante la selección de un conjunto de datos específico, haciendo clic derecho en la exportación y la selección de una señal apropiada.
- Convertir los datos en bruto registrados por el CE (presentada como absorbancia UV como una función del tiempo de migración). Convertir el eje X (migración tiempo t m) en una μ movilidad electroforética siguiente Ecuación 1:
n 1 "src =" / files / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg "/> (1)
donde L es la longitud d al detector, L t es la longitud total del capilar, V es la tensión, y t eo es el tiempo de migración de una especie neutra (el patrón interno DMSO en este caso) 27.
Convertir el eje Y de los datos en bruto (absorbancia en au) a una distribución de movilidades electroforéticas W (μ) siguiente Ecuación 2: 28
(2)
(2) 9. Caracterización adicional de las películas 18 péptido injertado
- Insertar películas de quitosano péptido injertado, enrollados alrededor de sí mismos, en un rotor de estado sólido RMN 4 mm. Llene el rotor con solución salina tamponada con fosfato a engrosar las películas, y cerrar el rotor. Espere durante unas horas.
- Analizar la película con 13 </ sup> espectroscopia de RMN de C 18.
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Representative Results
CE es muy adecuado para el control de la injerto de péptidos (por ejemplo, RGDS) sobre películas de quitosano. Agentes de acoplamiento adecuados incluyen EDC-HCl y NHS que activan el péptido debe injertarse en el quitosán (Figura 1). CE es capaz de separar las diferentes moléculas de interés a partir del medio de reacción. Para asignar los picos en el electroferograma, MFG puros, EDC-HCl y se disolvieron NHS, inyectados y se separaron por separado. Después de la asignación de picos, se inyectó el medio de reacción y los diversos reactivos se identificaron (Figura 2). EDC-HCl hace reaccionar en un producto lado EDH-HCl (3 - (((etilamino) (hidroxi) metileno) amino) - N, N -dimethylpropan-1-amina). Dimetil sulfóxido (DMSO) se utiliza como un estándar interno para las separaciones CE. Chitosan está presente en el experimento de injerto en forma de películas insolubles y por lo tanto no se inyecta o se observa en la CE. Nótese que para todos los datos en bruto, tgrabó eje de tiempo de migración se convierte en un eje movilidad electroforética (Ecuación 1) y el eje de absorbancia UV en una distribución de movilidades electroforéticas W (μ) (Ecuación 2).
Como las alícuotas se toman del medio de reacción se colocan en el instrumento CE y se inyectan. La extensión de la reacción se controla a través de la disminución del pico asociado con RGDS (Figura 3). También se puede ver que el pico EDC-HCl disminuye mientras que el pico aumenta EDH-HCl con el tiempo. Es importante tener en cuenta que no hay señal de que se puede asignar a un producto de una reacción secundaria del péptido, por lo que se supone que los RGDS se eliminan del medio de reacción que se está injertado en la película de quitosano. Electroferogramas superpuestos (Figura 3A) permiten la cuantificación del consumo de péptido desde el principio hasta el final de la reacción. Es de señalar queAunque la cinética se midió inicialmente durante 18 horas (Figura 3B), 4 hr se consideró suficiente para que la reacción proceda a su extensión máxima. Para permitir la cuantificación se requiere un volumen de inyección óptima para asegurar la señal-ruido es lo suficientemente alta, mientras que la prevención de la sobrecarga (Figura 4A) y en el caso de RGDS, se requieren inyecciones para ser completado en tiempo real para evitar policondensación (Figura 4B ).
La técnica basada en la CE se describe aquí para analizar péptido injerto para películas de quitosano es rápido y sencillo; Sin embargo, no cuantifica directamente el proceso de injerto. espectroscopía de RMN se utiliza para demostrar el injerto; esta medida no se puede hacer en tiempo real (por lo general toma varias horas) y necesita ser completado post-reacción. La comparación cualitativa de las películas de quitosano antes y después del injerto muestra el injerto con éxito de los péptidos through la aparición de una señal en 70 ppm en las películas injertadas correspondientes al enlace amida entre el quitosano y el péptido (Figura 5).
Figura 1. Esquema de la reacción de injerto. Esquema de reacción química que muestra la activación de EDC-HCl y NHS del grupo funcional ácido carboxílico de MFG seguido de su injerto en la superficie de la película de quitosano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .
Figura 2. asignación de picos de las especies presentes en el medio de reacción. A. Separación y asignación de picos para las soluciones de parcialmente hidrolizado EDC HCI (rosa), MFG (rojo), NHS (azul), así como para PBS (púrpura) y el medio de reacción (negro). B. Electroferogramas de medios de reacción (negro) se presenta como una función del tiempo de migración (electroforesis la movilidad se debe utilizar para superar pobres repetibilidad en tiempos de migración). por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. CE monitoreo del consumo MFG. (A) superpone picos de péptidos en el tiempo de reacción de 30 minutos (línea sólida de color púrpura), 60 min (línea de trazos de color magenta), 90 min (línea continua azul), 120 min (línea discontinua verde), 150 min (línea continua roja) y (B) la cinética de injerto completado más de 18 horas de repeticiones (cuadrado y círculo).pload / 54549 / 54549fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Los picos de péptidos superpuestos en medios de reacción que muestran resultados subóptimos (A) Depende (hidrodinámica): tiempos de inyección. 5 seg (línea azul), 10 s (línea negro), 20 s (línea roja) y 30 segundos (línea magenta) . Medios (B) de reacción que quedan en un vial CE durante un período prolongado de tiempo antes de la inyección:. 30 min (línea roja) y 90 min (línea azul) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. 13C espectros de RMN de estado hinchado películas de quitosano. Comparación de las películas antes (línea de color negro) y después (línea azul) injerto de péptidos. Señales presentes sólo en el espectro registrado después del injerto se indican con asteriscos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La simplicidad del protocolo descrito aquí lo hace ideal para una amplia aplicación. Sin embargo, especial atención debe prestarse a los siguientes pasos clave.
La preparación del instrumento adecuado CE
Es importante separar un estándar conocido inmediatamente antes de la separación de muestras desconocidas (así como al final de una serie de separaciones) para comprobar la validez del capilar y el instrumento en el día. Esta norma puede ser una oligoacrylate 27 o cualquier muestra conocida para dar varios picos de más de una amplia gama de tiempos de migración. Control de la corriente durante todas las separaciones y el análisis de la migración de un marcador neutral en cada separación son pasos clave para identificar los problemas. Un variaciones de corriente o grandes inestables (más de 10 a 15%) en el valor de meseta de la corriente pueden ser debido a la inconsistencia en el tampón (pH o concentración). Si es seguido por un retraso Migration momento del fabricante neutral también puede ser debido a la capilaridad no ser suficientemente limpia. Las revisiones de rutina del pH del tampón y una descarga adicional del capilar durante 10 minutos con hidróxido de sodio 1 M (recién preparado) se pueden usar para prevenir / modificar este problema. Durante el experimento, los pasos adicionales de limpieza se pueden emplear para asegurar una separación óptima, típicamente incluyendo o alargar un color con hidróxido de sodio acuoso concentrado para regenerar la superficie fusible capilar de sílice.
El tratamiento adecuado de datos
Al final del experimento, el tratamiento adecuado de los datos en bruto es esencial para comparar los resultados. Este implica la conversión de la X y el eje Y obtenida del instrumento CE (paso 8.3). Los tiempos de migración determinados en CE tienen una relativamente pobre repetibilidad y que recomiendan el uso de movilidades electroforéticas en cambio, conduce a una mejor repetibilidad. El significado de t correctamente datos REACIÓN se ha demostrado previamente con la separación y caracterización de quitosano 10, poli (ácido acrílico) 29, copolímeros de bloque 13 y la detección de azúcares en los cereales de desayuno 8 a través de las desviaciones estándar más pequeñas (RSD) observadas entre los experimentos para movilidades que para los tiempos de migración . Además, la CE se ha demostrado que es más robusto que el HPLC en la separación de monosacáridos en matrices complejas 5. Otros pasos de optimización pueden incluir el ajuste del volumen de inyección (tiempo de inyección) para permitir la separación con buena sensibilidad sin causar sobrecarga que impediría la cuantificación. Un tiempo de inyección de 10 seg se considera óptima a 30 mbar (Figura 4B): un tiempo de inyección más corto conduce a una sensibilidad reducida mientras que los tiempos de inyección más largos conducen a una forma de distorsión pico indicativo de sobrecarga capilar.
Importancia de la monitorización en tiempo real
ove_content "> una fuerza crítica de este método basado en CE es la capacidad de controlar las reacciones en tiempo real. Esto requiere condiciones óptimas de CE para la detección y separación de la sustancia reaccionante (s) relevante y / o producto (s). Además, para la análisis de las reacciones químicas un tiempo cero adecuado se debe tomar como punto de referencia de la reacción, lo que por lo general consiste en la separación de los reactivos medidos a cabo justo antes de la reacción a partir esto puede hacerse, por ejemplo, antes de introducir un reactivo particular, antes. se aumenta la temperatura, o antes de la irradiación UV se inicia para desencadenar la reacción.En el caso de los injertos de los péptidos (RGDS Onto quitosano o sobre otro sustrato), el péptido es capaz de reaccionar con sí mismo para producir oligómeros lineales o ramificados, a través de estructuras de policondensación 18. Esto se debe a RGDS contiene tanto grupos funcionales de ácido carboxílico y amina. Estos oligómeros de péptidos no tienen el mismo emovilidad lectrophoretic como los péptidos RGDS iniciales y por lo tanto pueden causar una cuantificación inexacta, por ejemplo a través de co-migración con otras especies. Por tanto, es importante asegurarse de que partes alícuotas del medio de reacción se inyectan y se separan dentro de unos pocos minutos de ser tomado del medio de reacción (Figura 4B).
La preparación adecuada de las películas de quitosano
Cuando se trata específicamente con las películas de quitosano hay una serie de pasos para cumplir. Durante la producción de las películas de quitosano, las películas tienen que ser dejado secar durante al menos 7 días (preferiblemente más). Si esto no se ha completado, cuando las películas se colocan en tampón de PBS para enjuagar se disolverán en lugar de formar una película hinchada que impide entonces los siguientes pasos. Además, es importante para neutralizar la película antes de la reacción de injerto para eliminar cualquier ácido acético restante que puede lixiviar de la película y competir conel péptido para la reacción de injerto 18. Esto se puede hacer a través de remojo en hidróxido sódico acuoso diluido o en PBS. El pH del tampón se utiliza como disolvente para la reacción de injerto es también crítico: si es demasiado ácida las películas serán parcial o totalmente disolver. Durante la reacción de injerto es importante que la película es capaz de tener el máximo contacto con la solución de reacción. Por lo tanto, la placa de Petri que contiene las películas y la mezcla de reacción se colocó en un agitador. También es imprescindible para evitar la evaporación de la mezcla de reacción para evitar las variaciones de concentración no controlados resultantes en cuantificaciones inexactas; el uso de la película de parafina para cubrir la placa de Petri fue eficaz para prevenirlo.
La principal limitación de la técnica de la CE es que, individualmente, no es capaz de confirmar el proceso de injerto. En el contexto del proceso de injerto químico mencionado anteriormente, la cuantificación del injerto péptido es indirecta. Estase pueden superar con el uso de una técnica complementaria, tales como la espectroscopía de RMN de estado sólido como se ha mencionado anteriormente. Otras limitaciones de la técnica de la CE incluyen que requiere el compuesto de interés que se cargará. Por lo tanto especies neutras migrarán al mismo tiempo. En algunos casos esto puede ser superado si el compuesto de complejos de interés con borato. Por último, si el compuesto de interés no contiene detección cromóforos distintos de UV tales como la conductividad puede necesitar ser utilizado. Esto requiere la compra adicional de un detector de conductividad que requiere la optimización.
Ventajas de análisis de injerto péptido a través de CE vs otros métodos analíticos
El método CE tiene varias ventajas sobre los métodos indirectos alternativos que incluyen cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), análisis de aminoácidos (AAA) y el método directo de la espectroscopia de RMN. En comparación con AAA es un alto rendimiento, método robusto which le permite analizar muestras complejas de manera eficiente y sin preparación de la muestra tedioso. Esto es ventajoso especialmente en el análisis de las reacciones químicas en tiempo real. HPLC se ha utilizado anteriormente para el péptido análisis 30 de injerto, sin embargo se consideró solamente semi-cuantitativa. CE tiene un coste de funcionamiento inferior a HPLC y no requiere filtración de la muestra antes del análisis, lo que minimiza el riesgo de pérdida de la muestra 5. Aunque la espectroscopia de RMN de C 13 es capaz de medir directamente el producto de interés, que es una técnica costosa y no es capaz de medir en tiempo real.
El protocolo descripto aquí proporciona un método rápido, eficiente, de bajo costo y fiable para la optimización de péptido de injerto a la película de quitosano. Por tanto, este nuevo enfoque ofrece ventajas significativas para la adaptación de las propiedades de adhesión celular de las películas de quitosano en comparación con los métodos utilizados tradicionalmente como la cromatografía y AAA. Este método CE se puede utilizar para controlar un númerode otras reacciones químicas en tiempo real, por lo general reacciones que se producen en el marco de tiempo de varias horas, para lo cual / los productos de interés se pueden cargar los reactivos. En este caso, es sin embargo importante tener en cuenta que el método CE debe ser optimizado antes del análisis de una reacción química diferente para permitir un análisis exitoso. Esto incluye el análisis de los reactivos puros y productos antes de la reacción para permitir su identificación y asegurarse de que pueden ser detectados y separados, así como para asegurar que no hay contaminantes pueden prevenir la cuantificación. La separación se puede mejorar y el tiempo de análisis total de cambiarse variando la longitud capilar, la composición del tampón y de la tensión, y potencialmente el uso de un capilar con paredes revestidas. La detección se puede mejorar mediante la modificación de las condiciones en que se inyecta la muestra a favor de los reactivos cargados o mediante la inyección de una cantidad mayor de la muestra en el capilar. Además, otros detectores Además de la detección UV puede be empleado incluyendo fluorescencia, detectores de conductividad sin contacto o de la CE puede ser acoplado a un espectrómetro de masas. La capacidad para controlar las reacciones en tiempo real permite la reacción de injerto para llevar a cabo directamente en un vial de CE si el sustrato está en solución y es capaz de ser analizado por la CE. Esto puede llevarse a cabo directamente en el interior del instrumento CE, en fecha tan reciente que hemos realizado para el injerto de aminoantipirina en poli (ácido acrílico) 7 Además, el enfoque no se limita a reacciones de injerto, pero se puede ampliar para controlar varias otras reacciones químicas. Además, el seguimiento de las reacciones permite la optimización de la reacción y también se puede utilizar para validar el producto de la reacción. Siempre que el compuesto de interés puede ser disuelto y cargada, el método permite CE rápido, barato y robusto separación, detección y cuantificación.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid - Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride - Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate - Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate - Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid - Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
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