Protocol
Это исследование в соответствии с Национальным университетом Сингапура Институциональные уходу и использованию животных комитета (утвержденным протоколом нет. R15-0225).
1. Хирургическая Подготовка модели животных
- судно cannulations
- Обезболить мужского пола крыс Sprague-Dawley (6 - 7 недель) весом (203 ± 20) г с кетамина (37,5 мг / мл) и ксилазина (5 мг / мл) коктейля через внутрибрюшинного (ф) инъекции (2 мл / кг) , Не используйте иглу или удалить его из шприца после инъекции.
- После того, как животное было под наркозом (подтверждается пят щипать), поместите его на грелку, чтобы поддерживать температуру тела при температуре 37 ° С. Осторожно брить волосы на лопатками, передняя шейке, нижней части живота, медиальная задней ноги и мошонку. Аккуратно сдерживаться ноги с помощью клейкой ленты бумаги.
- Выполнение всех хирургических процедур с использованием микродиссекции ножницы и пинцет под углом при просмотре черезВысококласнный стереоскопический. Поместите все острые хирургические инструменты на устойчивых к проколу лотка для предотвращения травм во время операции.
- Скраб все хирургические участки 3 раза с чередованием йода и 70% спирта перед выполнением надрез. Сбрасывают все катетеры с 30 МЕ / мл гепарин-физиологический раствор.
- Сделать 1 - 1,5 см разрез по средней линии кожи на лопатками с использованием пары хирургических ножниц над правой яремной вены. Разделить лицевой панели тупым, чтобы выставить яремную вену и иглу она с полиэтиленовой трубки (PE-50), заполненную гепарин-физиологический раствор с использованием 5-0 шелковыми швами. Настаивать дополнительной анестезии при необходимости (от 1/3 до 1/2 от первоначальной дозы, внутривенное (IV)) в течение всего курса хирургии и эксперимента.
- Выполните трахеотомию для поддержания проходимости дыхательных путей. Сделать 1 - см разрез 1,5 в передней шейной области. Трахею иглу с помощью полиэтиленовой трубки (PE-205) с 2-0 шелковыми швами, чтобы закрепить катетер на месте.
- Монитор артериального давлениячерез канюлю в бедренной артерии. Сделать 1 - см разрез 1.5 на левой медиальной поверхности задней ноги. Отделить бедренной артерии тупым. Вводить иглу в бедренную артерию с полиэтиленовой трубы (ПЭ-10), заполненную гепарин-физиологический раствор, используя 5-0 шелковыми швами.
- Кремастер Мышцы Подготовка и Flow Visualization
- Вставьте 5-0 шелковой нитью через вершину мошонку, чтобы продлить его. Сделайте надрез вдоль вентральной поверхности мошонку. Регулярно применять теплый изотонический раствор (37 ° С, рН 7,4), к открытой мышцы.
- Удалить окружающих соединительные ткани тщательно и тщательно с использованием ватным аппликатором.
- Вставьте 5-0 шелковой нити через вершину кремастер мышцы. Вырезать шов на две части равной длины и завяжите узел на каждой стороне. Разрежьте мышцу между двумя узлами и растянуть его на индивидуальные прозрачные плексигласа платформы, осторожно потянув за нить. исправлятьконец шовного материала на платформу с синим клейкости.
Примечание: Тщательное удаление окружающих соединительных тканей имеет решающее значение для получения оптимального контраста изображения. - Повторите шаг 1.2.3 до 5 до 6 фиксаций не сделаны. Осторожно удалите кремастер мышцы от придатка с использованием высоких температур прижигания. Переливать теплого изотонического раствора к открытой мышцы, чтобы предотвратить обезвоживание ткани.
- Окружите кремастер мышцы со сложенными кусками марли. Накройте подвергаются мышцы с поливинилового пленкой. Марлю кусочки с пленкой образуют неглубокий резервуар для хранения теплый изотонический раствор для объектива водно-иммерсионного (рис 1А).
- Передача животных на сцену животном с прижизненной микроскопом (рис 1C). Подключите артериальную катетеризацию к физиологической системы сбора данных для непрерывного мониторинга давления (рис 1E).
- Поддержание мышечной TEMPERATЮр при температуре 35 ° C с нагревательного элемента , соединенного под животной платформы (Фиг.1В). Поместите датчик температуры рядом с мышцей , чтобы обеспечить отрицательную обратную связь с регулятором мощности нагревательного элемента (рис 1D).
- Оставьте животное на сцене в течение 15 мин для уравновешивания с окружающей средой.
- Визуализируйте поток крови под микроскопом прижизненной с целью погружения в воде 40х и долгого рабочего конденсатора.
- Выберите неразветвленную артериолу (<60 мкм) на основе четкого фокуса изображения и контраст между ядром RBC, CFL и стенках сосудов, для того, чтобы сфокусировать микроскоп на диаметральной плоскости кровеносного сосуда. Поворачиваем камеру, установленную на микроскоп, чтобы выровнять стенки сосуда по вертикали.
- Записывают поток крови с помощью камеры высокоскоростного видео с частотой кадров 3000 / с в течение 1 сек. Сохранение записанного видео в несжатом 8-битный формат AVI в оттенках серого, чтобы сохранить качество изображения.
ЗАМЕТКА: Минимальная частота кадров записи 3000 кадров / сек рекомендуется убедиться, что измерение CFL может быть выполнена по меньшей мере, один раз в РБК в физиологических условиях артериол потока. - Используйте синий фильтр с пика пропускания при длине волны 394 нм и спектральной полосой пропускания при 310 - 510 нм, чтобы увеличить контраст между эритроцитами и плазмой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что спектр света, проходящий через синий фильтр из микроскопической источника света (100 Вт галогенной лампы) является низкой интенсивности света, чтобы предотвратить любое возможное повреждение тканей. - В конце эксперимента, усыпить животное с передозировкой пентобарбитала натрия.
Анализ 2. Изображение
- Предварительная обработка для измерения ширины CFL
- Откройте MATLAB и запустите файл 'CFL_pre.m'. (Это и другие файлы MATLAB можно найти вф "> Справочная MATLAB архив.)
- Нажмите на кнопку "Открыть файл", чтобы выбрать видеофайл для анализа.
- Отрегулируйте ползунок в 'вращения' для выравнивания стенок сосудов в вертикальном положении.
Примечание: Пользователи могут отображать оказывающее помощь линии сетки для выравнивания судна, выбрав переключатель "сетки на", а также настроить уровень масштабирования изображения, перемещая ползунок "ZOOM". - Нажмите кнопку "Подтвердить Редактирование", чтобы подтвердить выравнивание судна.
- Нажмите кнопку "Установить ROI для урожая", чтобы определить область интереса (ROI). Выровнен изображение будет отображаться в всплывающем окне. Отрегулируйте прямоугольную цель на изображении, а затем дважды щелкните, чтобы подтвердить ROI. Пропустить этот шаг, если обрезка изображения не требуется.
Примечание: включают в себя только один сосуд, в ROI для анализа ширины CFL от судна. Нажмите кнопку "Сброс" изображения, чтобы восстановить изображение к своей первоначальной форме, если это необходимо. - Нажмите9; Extract "кнопку, чтобы извлечь все отредактированные видеокадры в последовательных изображений битовой карты (оттенки серого 8-бит 'изображения в формате BMP'). Извлеченные изображения можно найти в папке с тем же именем, выбранного видеофайла.
- Измерение ширины CFL
- Откройте MATLAB и запустите файл 'CFL_measure.m'.
- Нажмите на кнопку "Выбрать папку", чтобы выбрать папку, содержащую извлеченные изображения.
- Нажмите на папку, содержащую изображения и нажмите кнопку "Выбрать папку". Первый кадр изображения в папке будут загружены и показаны в «черно-белое изображение" панели, наряду с серой интенсивности гистограммы в панели '' гистограмму изображения.
- Выберите нужный кадр изображения из списка для выполнения анализа, в противном случае первый кадр изображения будет выбран.
- Нажмите кнопку "Найти стенки сосудов ', чтобы определить внутреннюю стенку сосуда в изображении, которое определяется в том месте, гдесвет профиль интенсивности пика переходит от темноты к свету более двух пикселей.
- Проверить "медианный фильтр", чтобы применить медианный фильтр к изображению, чтобы уменьшить "соль и перец" шум.
- Проверьте "АВТОКОНТРАСТ" для регулировки интенсивности изображения в цифровом виде для повышения контрастности изображения.
- Выберите алгоритм пороговой в окне списка, который автоматически определяет значение порога (т), которая делит уровни серого на два класса - белых пикселей с уровнями серого выше т (КЛЛ) и черных пикселей с уровнями серого ниже т (РБК основных).
Примечание: В качестве альтернативного метода можно использовать ручной пороговую, если ни один из алгоритмов автоматизирован-не обеспечивает выбора порога выбор подходящего пороговую изображения. Нажмите на кнопку "Manual" радио и отрегулируйте ползунок, чтобы определить вручную значение пороговой. - Для измерения пространственного изменения ширины CFL, введите разрешение пикселей в поле "разрешение пиксела" (разрешениес этой экспериментальной установки составляла 0,42 мкм / пиксель).
- Нажмите кнопку "Рассчитать", чтобы получить пространственное изменение ширины CFL. Нажмите кнопку "Экспорт" .csv для экспорта данных ширины CFL в табличном формате.
- Для измерения временного изменения ширины CFL в определенном анализе линии вдоль судна, нажмите на переключатель "временные вариации" и введите информацию о частоте кадров (частоту кадров, используемую в этой экспериментальной установки было 3000 кадров / сек).
- Введите первый кадр и последний кадр изображения для анализа в 'Start Frame' и 'коробки Последний кадр', соответственно.
- Выберите позицию анализа линии вдоль судна, сдвинув бегунок в «Анализе линии». Подтвердите положение линии анализа, который показан как на "черно-белое изображение" и "бинарное изображение".
- Нажмите на кнопку "Рассчитать", чтобы получить временную изменение ширины CFL. Cliск 'Экспорт CSV для экспорта данных ширины CFL в табличном формате.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Визуализация CFL в естественных условиях во многом зависит от хирургических препаратов животного. Чрезмерная потеря крови или продолжительности операции могут подвергнуть животное к ударам и аберраций кровотока. Поддержание температуры тканей с использованием грелку, а также настроенную платформу во время хирургического вмешательства и эксперимента также имеет решающее значение для поддержания физиологического состояния крыс. С помощью 100 Вт галогеновую лампу в системе микроскопа, не наблюдалось никаких повреждений ткани различимы даже в конце эксперимента.
На фиг.2А показан типичный поток RBC через неразветвленной артериол в крысе кремастер мышцы, где КЛЛ можно наблюдать между сердечником RBC и внутренней стенкой сосуда (фиг.2с). Хороший контраст между этими компонентами в процессе эксперимента имеет решающее значение для обеспечения точности измерений ширины CFL. На начальном этапе анализа изображения включает в себяобнаружение внутренней стенки сосуда. Приобретая световой профиль интенсивности вдоль анализа линии , перпендикулярной к судну, местоположение приближается на пике , который переходит от темного к светлому более двух точек (рис 2B).
Как Эритроциты и КЛЛ обладают разной коэффициент пропускания света, разница в уровнях серого можно разделить на два класса (бинарное изображение). Тем не менее, определение точного порогового значения между двумя пиками гистограммы изображения может быть ограничен плохим качеством изображения и контрастности (Рисунок 3А). Для того, чтобы улучшить контраст между эритроцитами и КЛЛ, синий фильтр может быть использован (Рисунок 3B). Это также видно на рисунке 4, в котором границы ядра клетки крови можно более точно определить с использованием синего фильтра. Кроме того, выбор алгоритма 20-23 выбора порога может также влиять на измерение ширины КЛЛ (рис4). Очевидно , на рисунке 4A , что различные алгоритмы пороговой обработки приводят к различным основной РБК границы определены, что в свою очередь может привести к ошибочным измерениям CFL. Чтобы лучше проиллюстрировать влияние алгоритма выбора порога на измерения ширины CFL на рисунке 4B, пространственные профили для ширины CFL , полученных с использованием различных алгоритмов пороговых значений показаны на рисунке 5 и в таблице 1.
Рисунок 1:. Прижизненные микроскопической системы и мышц кремастер Подготовка A:. Хирургически экстериоризировалась крысы кремастер мышцы B: Customized платформа с нагревательными элементами для размещения кремастер мышц и поддержание его температуры при 35 ° C C:. Микроскопическое система с клиживотной стадии под индивидуальные и высокоскоростной камеры для визуализации потоков микроциркуляции крови в кремастер мышцы . D: Негативный регулятор температуры обратной связи и источник питания E:. Физиологический системы сбора данных для непрерывного мониторинга давления. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Обработка изображений для определения Стенка положения и CFL Ширина A:.. Типичная черно - белое изображение потока RBC в артериол (диаметр сосуда = 52 мкм) B: Светлый профиль интенсивности вдоль анализа линии (сплошная линия на панели A) . с: представитель результат измерения CFL вдоль судна.сплошные и штриховые стрелки указывают на внутреннюю стенку сосуда и внешний край сердечника RBC, соответственно. (LWB & РБГ: левый и правый сосуд граница стены, LCB & RCB: левая и правая граница ядра РБК) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3:.. Повышение контрастности изображения с оптическим синим фильтром изображения гистограмма черно - белых изображений , полученных без (а) и с синим фильтром (B) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Figurе 4: РБК Ядро Ширина определяется с использованием пяти различных пороговой обработки алгоритмов Границы ядра RBC и стенки сосуда , наложенного на черно - белых изображений на рисунке 3.. (верхний ряд (А): без синего фильтра, нижний ряд (B): с синим фильтром) , используя (слева направо) во время метода Оцу, по минимальным методом, методом межмодовому, итерационный метод выбора (ISODATA) и нечеткая энтропийный порога (Shanbhag). Сплошные и пунктирные линии указывают на внутреннюю стенку сосуда и внешний край сердечника РБК, соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: пространственное изменение CFL Ширина CFL ширины , соответствующие фиг.4В вдоль левого (А).и вправо (B) стенки сосудов, соответственно. (D: расстояние в диаметре сосуда) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: пороговые значения и CFL Ширина данных на рисунке 5. * р <0,001: существенное отличие от Метод Оцу. † р <0,001: существенная разница слева. Статистический анализ проводили с использованием двух хвостатых непарные т-тесты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Измерение ширины CFL имеет важное значение для лучшего понимания гемодинамики в микроциркуляции. В частности, измерение ширины CFL было выполнены в брыжеечных 6, spinotrapezius 24 и церебральных 25 микроциркуляций. Традиционное измерение в естественных условиях ширины CFL была ограничена по оценкам ручной проверки записанных видеокадров. В ручных измерений требуется усреднение нескольких последовательных видеокадров , прежде чем визуально идентифицировать границы ядра и стенках сосудов RBC 15,16. В другом исследовании, флуоресцеин изотиоцианат (FITC) меченным RBCs и родамина-B isothiocynate (RITC) маркированы плазмы были использованы для определения средних ширины CFL в кошки церебральных микрососудов 25. Эти предыдущие методы измерения очень много времени и требуют дополнительных шагов для флуоресцентного мечения, что ограничивает пространственное и временное разрешение Wi CFLDTH измерения. В отличие от этого, путем соединения с высокой скоростью записи камеры для эффективной сегментации и анализа изображений, методика продемонстрирована здесь позволяет количественно оценить пространственно-временных вариаций КЛЛ с пространственным разрешением (0,42 мкм) на порядок меньше, чем размер в RBC и временное разрешение 1/3000 сек.
Правильная хирургическая подготовка кремастер мышц имеет решающее значение при определении точности измерений ширины CFL. В частности, тщательное удаление прилегающих соединительных тканей имеет важное значение для обеспечения хорошего фокуса артериол в кремастер мышцы. Кроме того, временное и пространственное разрешение измерения зависит от технических характеристик микроскопа и камеры. В то время как более объективное увеличение может улучшить пространственное разрешение, это уменьшает поле зрения, что, в свою очередь, ограничивает получаемую длину судна для количественной оценки пространственное изменение ширины CFL. Таким образом, microscopiC конфигурации могут быть изменены в зависимости от конкретного применения техники.
Сегментация изображения является еще одним важным фактором для точности измерения ширины CFL. Среди различных методов, разработанных, пороговая изображения на основе гистограммы уровня серого обеспечивает простой и эффективный подход к сегментации и анализа изображений. Соответственно, объекты переднего плана извлекаются из фона, основанного на различии их уровней серого. В идеальном случае, гистограмма изображения будет Бимодальная и пороговое значение в нижней части долины тривиально. Однако в естественных условиях экспериментальные изображения не всегда обладают такими профили оттенков серого уровня. Наши результаты показали, как качество изображения и контраст может влиять на процесс сегментации изображений. Использование оптического фильтра синего значительно повысить контраст между эритроцитами и плазмой в артериол (рисунок 3), и это , кажется, важно , когда applyinг гистограмма на основе пороговых значений для измерения ширины CFL независимо от алгоритмов (рисунок 4). Это приводит к отчетливым бимодальной гистограммы изображения, что позволяет эффективно идентифицировать пороговое значение. Тем не менее, следует отметить , что даже с бимодальной гистограммы , полученные из изображений в естественных условиях, чрезвычайно неравным дисперсия двух пиков (локальных максимумов) , и широкая долина (локальный минимум) гистограммы может по- прежнему влиять на выбор порога (таблица 1 ). Таким образом, выбор соответствующего алгоритма выбора порога необходимо изучить на основании качества изображения, и пользователи должны учитывать ограничения каждого алгоритма выбора порога для лучшей пригодности для количественной оценки CFL ширины.
Поскольку ширина CFL в значительной степени зависят от условий течения, измерение давления непрерывного артериальной на протяжении всего эксперимента имеет важное значение. Для определения локальных условий потока,скорость pseudoshear кровотока может быть вычислена путем измерения средней скорости потока в кровеносном сосуде 5.
Таким образом, протоколы для хирургической подготовки крыс кремастер мышце и количественного анализа изображения , описанного здесь, были использованы для получения количественной информации о динамическом изменении ширины CFL в естественных условиях. Основные проблемы в обеспечении точности измерений ширины CFL включают надлежащую хирургическую подготовку мышц и сегментации изображений, оба из которых были рассмотрены выше. Этот метод может быть легко адаптирована к другим микроциркуляции исследований для изучения гемореологического и гемодинамические аберраций в различных физиологических и патологических состояниях. Следовательно, эти результаты вносят вклад в будущее развитие микрососудистых терапевтических подходов и клинического вмешательства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intravital microscope | Olympus | BX51WI | Equipment |
| High speed camera | Photron | 1024PCI | Equipment |
| Blue filter | HOYA | B390 | Equipment |
| Pressure sensor & biopac system | Biopac system | TSD104A, MP100 | Equipment |
| Temperature controller | Shimaden | SR 1 | Equipment |
| Plasma Lyte A | Baxter | NDC:0338-0221 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Saline 0.9% | Braun | ||
| Heparin (5,000 IU/ml) | LEO | ||
| PE-10 polyethylene tube | Becton Dickinson | 427400 | .024" OD x .011" ID |
| PE-50 polyethene tube | Becton Dickinson | 427411 | .038" OD x .023" ID |
| PE-205 polyethene tube | Becton Dickinson | 427446 | .082" OD x .062" ID |
| 2-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 113-S | |
| 5-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 106-S | |
| Water circulating heating pad | Gaymar | ||
| Water bath | Fisher Scientific | Isotemp 205 | Equipment |
| Sterile Cotton Gauze | Fisher Scientific | 22-415-468 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-124 | |
| Dumont Forceps | Kent Scientific | INS14188 | Surgical instrument |
| Micro Dissecting forceps | Kent Scientific | INS15915 | Surgical instrument |
| Iris forceps 1 x 2 teeth | Kent Scientific | INS15917 | Surgical instrument |
| Vessel cannulation forceps | Kent Scientific | INS500377 | Surgical instrument |
| Micro scissor | Kent Scientific | INS14177 | Surgical instrument |
| Iris scissor | Kent Scientific | INS14225 | Surgical instrument |
| Vessel clip | Kent Scientific | INS14120 | Surgical instrument |
| Gemini cautery system | Braintree Scientific | GEM 5917 | Surgical instrument |
References
- Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).
- Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S. Effect of erythrocyte aggregation and flow rate on cell-free layer formation in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H1870-H1878 (2010).
- Namgung, B., Kim, S. Effect of uneven red cell influx on formation of cell-free layer in small venules. Microvasc Res. 92, 19-24 (2014).
- Goldsmith, H. L.
- Buerk, D. G. Can We Model Nitric Oxide Biotransport? A Survey of Mathematical Models for a Simple Diatomic Molecule with Surprisingly Complex Biological Activities. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 109-143 (2001).
- Tateishi, N., Suzuki, Y., Soutani, M., Maeda, N. Flow dynamics of erythrocytes in microvessels of isolated rabbit mesentery: cell-free layer and flow resistance. J Biomech. 27 (9), 1119-1125 (1994).
- Ong, P. K., Cho, S., Namgung, B., Kim, S. Effects of cell-free layer formation on NO/O2 bioavailability in small arterioles. Microvasc Res. 83 (2), 168-177 (2012).
- Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Modulation of NO bioavailability by temporal variation of the cell-free layer width in small arterioles. Ann Biomed Eng. 39 (3), 1012-1023 (2011).
- Park, S. W., Intaglietta, M., Tartakovsky, D. M. Impact of stochastic fluctuations in the cell free layer on nitric oxide bioavailability. Front Comput Neurosci. 9, 131 (2015).
- Ng, Y. C., Namgung, B., Kim, S. Two-dimensional transient model for prediction of arteriolar NO/O2 modulation by spatiotemporal variations in cell-free layer width. Microvasc Res. 97, 88-97 (2015).
- Sriram, K., et al. The effect of small changes in hematocrit on nitric oxide transport in arterioles. Antioxid Redox Sign. 14 (2), 175-185 (2011).
- Hightower, C. M., et al. Integration of cardiovascular regulation by the blood/endothelium cell-free layer. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 458-470 (2011).
- Ng, Y. C., Namgung, B., Leo, H. L., Kim, S. Erythrocyte aggregation may promote uneven spatial distribution of NO/O in the downstream vessel of arteriolar bifurcations. J Biomech. , (2015).
- Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Temporal variations of the cell-free layer width may enhance NO bioavailability in small arterioles: Effects of erythrocyte aggregation. Microvasc Res. 81 (3), 303-312 (2011).
- Maeda, N.
- Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels - Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), Available from: http://ajpheart.physiology.org/content/268/5/H1959 H1959-H1965 (1995).
- Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. A computer-based method for determination of the cell-free layer width in microcirculation. Microcirculation. 13 (3), 199-207 (2006).
- Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels. Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), H1959-H1965 (1995).
- Namgung, B., et al. A comparative study of histogram-based thresholding methods for the determination of cell-free layer width in small blood vessels. Physiol Meas. 31 (9), N61-N70 (2010).
- Ong, P. K., et al. An automated method for cell-free layer width determination in small arterioles. Physiol Meas. 32 (3), N1-N12 (2011).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
- Prewitt, J. M., Mendelsohn, M. L.
- Ridler, T. W., Calvard, S. Picture Thresholding Using an Iterative Selection Method. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 8 (8), 630-632 (1978).
- Shanbhag, A. G. Utilization of Information Measure as a Means of Image Thresholding. Cvgip-Graph Model Im. 56 (5), 414-419 (1994).
- Bishop, J. J., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Effects of erythrocyte aggregation and venous network geometry on red blood cell axial migration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (2), H939-H950 (2001).
- Yamaguchi, S., Yamakawa, T., Niimi, H. Cell-free plasma layer in cerebral microvessels. Biorheology. 29 (2-3), 251-260 (1992).
