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Biology

चूहा cremaster मांसपेशियों की धमनियों में दृश्य और सेल मुक्त लेयर की मात्रा

Published: October 19, 2016 doi: 10.3791/54550
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 1,2,3, 2
1NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore, 2Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

Protocol

इस अध्ययन सिंगापुर संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (अनुमोदित प्रोटोकॉल नहीं। R15-0225) के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के अनुसार है।

1. पशु मॉडल की शल्य चिकित्सा की तैयारी

  1. पोत cannulations
    1. असंवेदनता एक पुरुष Sprague-Dawley चूहों (6 - 7 सप्ताह पुराने) वजन (203 ± 20) ketamine (37.5 मिलीग्राम / एमएल) और xylazine (5 मिलीग्राम / एमएल) कॉकटेल intraperitoneal के माध्यम से ग्राम (आईपी) इंजेक्शन (2 मिलीलीटर / किग्रा) । सुई संक्षिप्त या इंजेक्शन के बाद सिरिंज से यह न निकालें।
    2. एक बार जानवर anesthetized कर दिया गया है (पैर की अंगुली pinching द्वारा पुष्टि की), एक हीटिंग पैड पर जगह 37 डिग्री सेल्सियस पर अपने शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए। धीरे scapulae, पूर्वकाल गर्भाशय ग्रीवा, पेट के निचले हिस्से, औसत दर्जे हिंद पैर और अंडकोषीय थैली पर बाल दाढ़ी। धीरे चिपकने वाला कागज टेप का उपयोग पैरों को नियंत्रित।
    3. microdissection कैंची और कोणीय संदंश जबकि के माध्यम से देखने का उपयोग कर सभी सर्जिकल प्रक्रियाओं का प्रदर्शनएक stereomicroscope। सर्जरी के दौरान चोट को रोकने के लिए एक पंचर प्रतिरोधी ट्रे पर सभी तेज सर्जिकल उपकरण रखें।
    4. सभी सर्जिकल साइटों बारी आयोडीन और 70% शराब के साथ 3 बार साफ़ चीरा प्रदर्शन से पहले। 30 आइयू / एमएल हेपरिन खारा समाधान के साथ सभी कैथेटर फ्लश।
    5. scapulae सही गले नस के ऊपर शल्य कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करने पर 1.5 सेमी midline त्वचा चीरा - एक 1 बनाओ। कुंद विच्छेदन द्वारा प्रावरणी अलग गले नस को बेनकाब करने के लिए है और यह एक पॉलीथीन ट्यूब (पीई 50) हेपरिन खारा 5-0 रेशम टांके का उपयोग कर के साथ भर के साथ cannulate। पूरक संज्ञाहरण दिखे जब आवश्यक (प्रारंभिक खुराक का 1/2 भाग 1/3, अंतःशिरा (चतुर्थ)) सर्जरी और प्रयोग के पाठ्यक्रम में।
    6. एयरवे प्रत्यक्षता बनाए रखने के लिए ट्रेकियोस्टोमी प्रदर्शन करना। पूर्वकाल ग्रीवा क्षेत्र में 1.5 सेमी चीरा - एक 1 बनाओ। 2-0 रेशम टांके के साथ एक पॉलीथीन ट्यूब (पीई-205) का उपयोग जगह में कैथेटर को सुरक्षित करने के श्वासनली Cannulate।
    7. रक्तचाप की निगरानीऔर्विक धमनी पर केन्युलेशन के माध्यम से। हिंद पैर के बाईं औसत दर्जे की सतह पर 1.5 सेमी चीरा - एक 1 बनाओ। अलग कुंद विच्छेदन द्वारा और्विक धमनी। एक पॉलीथीन ट्यूब (पीई 10) हेपरिन खारा 5-0 रेशम टांके का उपयोग कर के साथ भर के साथ और्विक धमनी Cannulate।
  2. Cremaster मांसपेशियों तैयारी और प्रवाह दर्शन
    1. यह विस्तार करने के लिए अंडकोषीय थैली के शीर्ष के माध्यम 5-0 रेशम सीवन डालें। अंडकोषीय थैली के उदर सतह के साथ एक चीरा। संपर्क में पेशी के लिए, नियमित रूप से गर्म isotonic समाधान (7.4 पीएच 37 डिग्री सेल्सियस) लागू होते हैं।
    2. संयोजी ऊतक आसपास के ध्यान से और अच्छी तरह से एक कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग कर निकालें।
    3. cremaster मांसपेशियों के शीर्ष के माध्यम 5-0 रेशम सीवन डालें। बराबर लंबाई के दो टुकड़ों में काटें और सिवनी प्रत्येक पक्ष पर एक गाँठ बाँध। दो समुद्री मील के बीच मांसपेशियों में कटौती और एक स्वनिर्धारित पारदर्शी Plexiglas मंच पर यह खिंचाव धीरे सिवनी खींच कर। ठीक करसीवन के अंत नीले कील के साथ मंच पर।
      नोट: संयोजी ऊतक आसपास की पूरी तरह से हटाने इष्टतम छवि के विपरीत प्राप्त करने में महत्वपूर्ण है।
    4. दोहराएँ कदम 1.2.3 तक 5 से 6 fixations बना रहे हैं। ध्यान से उच्च तापमान दाग़ना का उपयोग कर अधिवृषण से cremaster मांसपेशियों को हटा दें। ऊतक के निर्जलीकरण को रोकने के संपर्क में पेशी के लिए गर्म isotonic समाधान Superfuse।
      1. धुंध की तह टुकड़े के साथ cremaster मांसपेशियों को चारों ओर। एक polyvinyl फिल्म के साथ संपर्क में पेशी को कवर किया। फिल्म के साथ धुंध टुकड़े पानी विसर्जन माइक्रोस्कोप उद्देश्य (चित्रा 1 ए) के लिए गर्म isotonic समाधान कराने के लिए एक उथले बेसिन के रूप में।
    5. एक intravital माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 सी) के पशु मंच पर जानवर स्थानांतरण। निरंतर दबाव की निगरानी (चित्रा 1E) के लिए एक शारीरिक डाटा अधिग्रहण प्रणाली के लिए धमनी केन्युलेशन कनेक्ट करें।
    6. पेशी temperat बनाए रखेंएक हीटिंग तत्व पशु मंच (चित्रा 1 बी) के नीचे संलग्न के साथ 35 डिग्री सेल्सियस पर Ure। एक तापमान जांच पेशी के बगल में जगह हीटिंग तत्व (चित्रा -1) की शक्ति नियंत्रक करने के लिए नकारात्मक प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए।
    7. मंच पर पशु छोड़ दो 15 मिनट के पर्यावरण के साथ संतुलित करने के लिए।
    8. एक 40x पानी विसर्जन उद्देश्य है और एक लंबे समय तक काम कंडेनसर के साथ एक intravital खुर्दबीन के नीचे रक्त का प्रवाह कल्पना।
    9. एक unbranched धमनिका (<60 माइक्रोन) एक साफ छवि ध्यान केंद्रित करने और आरबीसी कोर के बीच इसके विपरीत पर आधारित चुनें, सीएफएल और वाहिनियों की दीवारों, क्रम में माइक्रोस्कोप रक्त वाहिनियों का पूरा पूरा विमान पर ध्यान केंद्रित करना। कैमरा माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू की खड़ी पोत दीवार के लिए पंक्ति में घुमाएं।
    10. 1 सेकंड के लिए 3,000 / सेकंड की एक फ्रेम दर पर एक उच्च गति वीडियो कैमरे का उपयोग रक्त के प्रवाह को रिकॉर्ड। छवि गुणवत्ता की रक्षा करने के लिए असम्पीडित 8-बिट स्केल AVI प्रारूप के रूप में दर्ज वीडियो सहेजें।
      ध्यान दें: 3,000 फ्रेम / सेकंड की एक न्यूनतम रिकॉर्डिंग फ्रेम दर सुनिश्चित करने के लिए कि सीएफएल माप शारीरिक arteriolar प्रवाह शर्तों के तहत कम से कम एक बार आरबीसी के अनुसार किया जा सकता है की सिफारिश की है।
    11. लाल रक्त कोशिकाओं और प्लाज्मा के बीच विपरीत बढ़ाने के लिए 510 एनएम - 310 पर 394 एनएम और वर्णक्रम bandpass की तरंग दैर्ध्य में चोटी के ट्रांसमिशन के साथ एक नीले रंग फिल्टर का प्रयोग करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करें कि प्रकाश स्पेक्ट्रम सूक्ष्म प्रकाश स्रोत (100 डब्ल्यू हैलोजन लैंप) से नीला फिल्टर के माध्यम से गुजर कम प्रकाश की तीव्रता किसी भी संभावित ऊतकों को नुकसान को रोकने के लिए की है।
    12. प्रयोग के अंत में, pentobarbital सोडियम की अधिक मात्रा के साथ पशु euthanize।

2. छवि विश्लेषण

  1. सीएफएल चौड़ाई माप के लिए Preprocessing
    1. MATLAB खोलें और 'CFL_pre.m' फ़ाइल चलाते हैं। (यह और अन्य MATLAB फ़ाइलों में पाया जा सकता हैआईपी "> पूरक MATLAB पुरालेख।)
    2. वीडियो फ़ाइल का चयन करने के लिए विश्लेषण करने के लिए 'ओपन फाइल' पर क्लिक करें।
    3. खड़ी वाहिनियों की दीवारों के लिए पंक्ति में 'रोटेशन' स्लाइडर को समायोजित करें।
      नोट: 'प्रयोक्ता ग्रिड पर' रेडियो बटन का चयन करके पोत संरेखण के लिए की सहायता ग्रिड लाइन प्रदर्शित कर सकते हैं, और 'ज़ूम' स्लाइडर फिसलने से छवि के ज़ूम स्तर को समायोजित।
    4. पोत संरेखण पुष्टि करने के लिए 'पुष्टि संपादन' बटन पर क्लिक करें।
    5. ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए 'रॉय सेट फसल के लिए' बटन पर क्लिक करें। गठबंधन की छवि एक पॉप-अप विंडो में प्रदर्शित किया जाएगा। छवि पर आयताकार उद्देश्य को समायोजित करें, और डबल रॉय पुष्टि करने के लिए क्लिक करें। इस कदम को छोड़ अगर छवि की फसल की आवश्यकता नहीं है।
      नोट: केवल रॉय पोत से सीएफएल चौड़ाई का विश्लेषण करने के लिए एक एकल पोत शामिल हैं। , अपने मूल रूप में छवि को बहाल करने के लिए यदि आवश्यक हो तो 'रीसेट छवि' बटन पर क्लिक करें।
    6. दबाएं9; '(बीएमपी' प्रारूप लगातार सा नक्शा छवियों 8-बिट स्केल) में सभी संपादित वीडियो फ्रेम निकालने के लिए बटन 'छवियाँ निकालें। निकाली गई छवियों चयनित वीडियो फ़ाइल के रूप में एक ही नाम के साथ फ़ोल्डर में पाया जा सकता है।
  2. सीएफएल चौड़ाई का मापन
    1. MATLAB खोलें और 'CFL_measure.m' फ़ाइल चलाते हैं।
    2. निकाली गई छवियों वाले फ़ोल्डर का चयन करने के लिए 'द्वारा चयनित फ़ोल्डर' पर क्लिक करें।
    3. छवियों वाले फ़ोल्डर पर क्लिक करें और क्लिक करें 'का चयन फ़ोल्डर'। फ़ोल्डर में पहली छवि फ्रेम भरी हुई है और 'स्केल छवि' पैनल में दिखाया गया है, 'छवि हिस्टोग्राम' पैनल में अपनी ग्रे तीव्रता हिस्टोग्राम के साथ की जाएगी।
    4. विश्लेषण, अन्यथा पहली छवि फ्रेम का चयन किया जाएगा प्रदर्शन करने के लिए सूची बॉक्स से वांछित छवि फ्रेम का चयन करें।
    5. 'वाहिनियों की दीवारों खोजें' छवि है, जो स्थान पर चुना गया है में आंतरिक पोत दीवार की पहचान के लिए क्लिक करें जहांअंधेरे से प्रकाश की तीव्रता प्रोफ़ाइल चोटी पारगमन दो पिक्सल पर प्रकाश करने के लिए।
    6. 'नमक और काली मिर्च' शोर को कम करने के लिए छवि के लिए एक मंझला फिल्टर लागू करने के लिए 'मंझला फिल्टर' की जाँच करें।
    7. छवि के विपरीत बढ़ाने के लिए डिजिटल छवि तीव्रता को समायोजित करने के लिए 'ऑटो कंट्रास्ट' की जाँच करें।
    8. सूची बॉक्स जो स्वत: एक thresholding मूल्य (τ) निर्धारित करता है में एक thresholding कलन विधि का चयन करें कि दो वर्गों में ग्रे स्तर बिताते हैं - τ ऊपर ग्रे स्तर (सीएफएल), और τ नीचे ग्रे स्तर (आरबीसी कोर) के साथ काले रंग पिक्सल के साथ सफेद पिक्सेल।
      नोट: एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में, मैनुअल thresholding का उपयोग करता है, तो स्वचालित-thresholding एल्गोरिथ्म में से कोई भी एक उपयुक्त छवि thresholding प्रदान करता है। 'मैनुअल' रेडियो बटन पर क्लिक करें और मैनुअल thresholding मूल्य को परिभाषित करने के लिए स्लाइडर को समायोजित।
    9. सीएफएल चौड़ाई के स्थानिक विभिन्नता संकल्प को मापने के लिए, 'पिक्सेल संकल्प' बॉक्स में दर्ज पिक्सेल संकल्प (इस प्रयोगात्मक सेटअप के साथ 0.42 माइक्रोन / पिक्सेल) था।
    10. सीएफएल चौड़ाई के स्थानिक विभिन्नता प्राप्त करने के लिए 'गणना' बटन पर क्लिक करें। एक सारणीबद्ध प्रारूप में सीएफएल चौड़ाई डेटा निर्यात करने के लिए 'निर्यात .csv' पर क्लिक करें।
    11. पोत के साथ एक विशिष्ट विश्लेषण लाइन पर सीएफएल चौड़ाई के अस्थायी बदलाव को मापने के लिए, 'बदलाव अस्थायी' रेडियो बटन पर क्लिक करें और फ्रेम दर जानकारी दर्ज (फ्रेम इस प्रयोगात्मक सेटअप में इस्तेमाल की दर 3,000 फ्रेम / सेक) था।
    12. 'शुरू फ्रेम' और 'अंतिम फ्रेम' बक्से में क्रमश: पहला फ्रेम और विश्लेषण के लिए छवियों के अंतिम फ्रेम दर्ज करें।
    13. 'विश्लेषण' रेखा स्लाइड पट्टी फिसलने से पोत के साथ विश्लेषण लाइन की स्थिति का चयन करें। विश्लेषण लाइन है, जो दोनों 'स्केल छवि' और 'द्विआधारी छवि' पर यह साफ है की स्थिति की पुष्टि करें।
    14. सीएफएल चौड़ाई के अस्थायी बदलाव प्राप्त करने के लिए 'गणना' पर क्लिक करें। सीएलआईसी.के. 'निर्यात .csv' एक सारणीबद्ध प्रारूप में सीएफएल चौड़ाई डेटा निर्यात करने के लिए।

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Representative Results

विवो में सीएफएल के दृश्य काफी हद तक जानवर की शल्य चिकित्सा की तैयारी पर निर्भर है। अत्यधिक खून की कमी या विस्तारित अवधि सर्जरी सदमे और रक्त का प्रवाह aberrations के लिए पशु विषय हो सकता है। एक हीटिंग पैड के साथ ही सर्जरी और प्रयोग के दौरान एक स्वनिर्धारित मंच का उपयोग ऊतक तापमान के रखरखाव भी चूहे की शारीरिक स्थिति को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। माइक्रोस्कोप प्रणाली में एक 100 डब्ल्यू हैलोजन लैंप का उपयोग करके, कोई प्रत्यक्ष ऊतकों को नुकसान भी प्रयोग के अंत में मनाया गया।

चित्रा 2A चूहा cremaster मांसपेशियों में एक unbranched धमनिका, जहां सीएफएल आरबीसी कोर और भीतरी दीवार पोत (चित्रा 2 सी) के बीच मनाया जा सकता है के माध्यम से एक ठेठ आरबीसी प्रवाह को दर्शाता है। प्रयोग के दौरान इन घटकों के बीच एक अच्छा इसके विपरीत सीएफएल चौड़ाई माप की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। छवि विश्लेषण के प्रारंभिक चरण शामिलभीतरी दीवार पोत का पता लगाने। पोत को सीधा विश्लेषण रेखा के साथ प्रकाश की तीव्रता प्रोफ़ाइल प्राप्त करके, स्थान चोटी है कि अंधेरे से पारगमन दो पिक्सल (चित्रा 2 बी) पर प्रकाश करने पर अनुमानित है।

लाल रक्त कोशिकाओं और सीएफएल अलग तरह के प्रकाश संप्रेषण के अधिकारी के रूप में, ग्रे स्तर में अंतर दो वर्गों (बाइनरी छवि) में विभाजित किया जा सकता है। हालांकि, छवि हिस्टोग्राम में दो चोटियों के बीच एक सटीक सीमा मूल्य की पहचान के गरीब छवि गुणवत्ता और विपरीत (चित्रा 3) के द्वारा प्रतिबंधित किया जा सकता है। लाल रक्त कोशिकाओं और सीएफएल, एक नीले रंग फिल्टर का इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 3 बी) के बीच इसके विपरीत में सुधार करना। यह भी स्पष्ट चित्रा 4 में, जिसमें आरबीसी कोर की सीमाओं को और अधिक सही एक नीला फिल्टर के उपयोग के साथ पहचाना जा सकता है। इसके अलावा, thresholding एल्गोरिथ्म 20-23 का चयन भी सीएफएल चौड़ाई की माप को प्रभावित कर सकते हैं (चित्रा4)। ऐसा नहीं है कि अलग अलग thresholding एल्गोरिदम, अलग आरबीसी कोर पहचान सीमा में हुई चित्रा -4 ए में स्पष्ट है जो कर सकते थे गलत सीएफएल माप करने के लिए बारी के नेतृत्व में। बेहतर चित्रा 4 बी में सीएफएल चौड़ाई माप पर thresholding एल्गोरिथ्म के प्रभाव के उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, अलग अलग thresholding एल्गोरिदम का उपयोग कर प्राप्त सीएफएल की चौड़ाई के लिए स्थानिक प्रोफाइल चित्रा 5 में दिखाया गया है और तालिका 1 में संक्षेप हैं।

आकृति 1
। चित्रा 1:। Intravital सूक्ष्म प्रणाली और cremaster मांसपेशियों तैयारी एक:। शल्य चिकित्सा exteriorized चूहा cremaster मांसपेशियों बी: cremaster मांसपेशियों रखने और 35 डिग्री सेल्सियस सेल्सियस पर अपने तापमान को बनाए रखने के लिए हीटिंग तत्वों के साथ स्वनिर्धारित मंच: ग्राहकों के साथ सूक्ष्म प्रणाली। नकारात्मक प्रतिक्रिया तापमान नियंत्रक और बिजली की आपूर्ति ई:। शारीरिक डाटा अधिग्रहण प्रणाली निरंतर दबाव की निगरानी के लिए cremaster मांसपेशियों डी में microcirculatory रक्त प्रवाह के दृश्य के लिए पशु मंच और उच्च गति कैमरा tomized। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:।। एक भी धमनियों में आरबीसी प्रवाह की विशिष्ट स्केल छवि (पोत व्यास = 52 माइक्रोन) बी:: विश्लेषण रेखा के साथ हल्की तीव्रता प्रोफ़ाइल (पैनल में ठोस लाइन) के पोत दीवार स्थिति और सीएफएल चौड़ाई एक दृढ़ संकल्प के लिए इमेज प्रोसेसिंग । सी: पोत के साथ सीएफएल माप के प्रतिनिधि परिणाम।ठोस और धराशायी तीर, भीतरी दीवार पोत और आरबीसी कोर के बाहरी छोर से संकेत मिलता है क्रमशः। (LWB और RWB: छोड़ दिया और सही पोत दीवार सीमा, LCB और आरसीबी: छोड़ दिया और सही आरबीसी कोर सीमा) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:।। एक ऑप्टिकल नीला फिल्टर के साथ छवि के विपरीत संवर्धन (ए) के बिना और नीले रंग फिल्टर (बी) के साथ प्राप्त स्केल छवियों की छवि हिस्टोग्राम यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
Figurई 4:।। (:, नीचे पंक्ति (बी) नीला फिल्टर के बिना: नीला फिल्टर के साथ शीर्ष पंक्ति (ए)) का उपयोग आरबीसी कोर चौड़ाई पांच विभिन्न थ्रेशोल्डिंग एल्गोरिदम आरबीसी कोर और पोत दीवार चित्रा 3 में स्केल छवियों पर आरोपित की सीमाओं का उपयोग निर्धारित Otsu की विधि, न्यूनतम विधि, intermode विधि, चलने का चयन विधि (Isodata) और फजी entropic thresholding (शानबाग) (बाएं से दाएं)। ठोस और धराशायी लाइनों भीतरी दीवार पोत और आरबीसी कोर के बाहरी छोर से संकेत मिलता है, क्रमशः। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: सीएफएल चौड़ाई के स्थानिक विभिन्नता सीएफएल चौड़ाई बाएं साथ 4 बी चित्रा के लिए इसी (ए)।और दाएँ (बी) वाहिनियों की दीवारों, क्रमशः। (डी: पोत व्यास में दूरी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: दहलीज मूल्यों और चित्रा 5. * पी <0.001 में सीएफएल चौड़ाई डाटा: Otsu की विधि से महत्वपूर्ण अंतर है। † पी <0.001: बाएं से महत्वपूर्ण अंतर है। सांख्यिकीय विश्लेषण के दो पूंछ unpaired टी परीक्षण का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया।

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Discussion

सीएफएल चौड़ाई की माप microcirculation में hemodynamics का एक बेहतर समझ के लिए आवश्यक है। विशेष रूप से, सीएफएल चौड़ाई की माप mesenteric 6 में प्रदर्शन किया गया है, 24 और मस्तिष्क 25 microcirculations spinotrapezius। इन विवो सीएफएल चौड़ाई की पारंपरिक माप रिकॉर्ड वीडियो फ्रेम के मैनुअल निरीक्षण द्वारा अनुमानों के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया था। मैनुअल माप नेत्रहीन आरबीसी कोर और वाहिनियों की दीवारों 15,16 की सीमाओं की पहचान करने से पहले लगातार कई वीडियो फ्रेम के औसत की आवश्यकता है। एक अन्य अध्ययन में fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) लाल रक्त कोशिकाओं -labelled और rhodamine-बी isothiocynate (RITC) लेबल प्लाज्मा बिल्ली मस्तिष्क microvessels 25 में मतलब सीएफएल की चौड़ाई निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। ये पिछले माप तरीकों बहुत समय लगता है और फ्लोरोसेंट लेबलिंग, सीएफएल वाई के स्थानिक और लौकिक संकल्प सीमा जिसके लिए अतिरिक्त कदम की आवश्यकता होती हैडीटीएच माप। इसके विपरीत, एक प्रभावी छवि विभाजन और विश्लेषण करने के लिए उच्च गति कैमरा रिकॉर्डिंग युग्मन द्वारा, तकनीक का प्रदर्शन यहां एक स्थानिक संकल्प (0.42 माइक्रोन) एक आदेश के साथ सीएफएल के spatiotemporal रूपों की मात्रा का ठहराव एक आरबीसी और के आकार से छोटा परमिट 1 / 3,000 सेकंड की एक अस्थायी समाधान।

cremaster मांसपेशियों के समुचित शल्य चिकित्सा की तैयारी सीएफएल चौड़ाई माप की सटीकता का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, आसन्न संयोजी ऊतक की पूरी तरह से हटाने cremaster मांसपेशियों में धमनियों का एक अच्छा ध्यान यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, माप के अस्थायी और स्थानिक संकल्प माइक्रोस्कोप और कैमरा विशिष्टताओं पर निर्भर है। एक उच्च बढ़ाई उद्देश्य स्थानिक संकल्प को बढ़ाने सकता है, यह देखने के क्षेत्र है, जो बारी में सीएफएल चौड़ाई के स्थानिक विभिन्नता बढ़ाता के लिए प्राप्य पोत लंबाई सीमा कम कर देता है। इसलिए, microscopiसी विन्यास तकनीक के विशिष्ट आवेदन के अनुसार संशोधित किया जा सकता है।

छवि विभाजन सीएफएल चौड़ाई माप की सटीकता के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है। विकसित विभिन्न तकनीकों के बीच, छवि ग्रे स्तर हिस्टोग्राम पर आधारित thresholding छवि विभाजन और विश्लेषण के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका प्रदान करता है। तदनुसार, अग्रभूमि वस्तुओं पृष्ठभूमि उनके ग्रे स्तर में अंतर के आधार पर से निकाले जाते हैं। आदर्श मामले में, छवि हिस्टोग्राम bimodal हो जाएगा और घाटी के तल पर एक सीमा मूल्य तुच्छ है। हालांकि, विवो में प्रयोगात्मक छवियों हमेशा इस तरह के स्केल स्तर प्रोफाइल प्रदर्शन नहीं करते। हमारे परिणाम से पता चला है कि कैसे छवि गुणवत्ता और इसके विपरीत छवि विभाजन की प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं। एक ऑप्टिकल नीला फिल्टर का उपयोग काफी लाल रक्त कोशिकाओं और एक धमनिका में प्लाज्मा के बीच विपरीत बढ़ाया (चित्रा 3), और यह जब applyin आवश्यक प्रतीत हो रहा हैजी एल्गोरिदम (चित्रा 4) की परवाह किए बिना सीएफएल चौड़ाई माप के लिए हिस्टोग्राम आधारित thresholding। यह एक अलग bimodal छवि हिस्टोग्राम, जो एक प्रभावी ढंग से सीमा मूल्य की पहचान के लिए अनुमति देता है में परिणाम है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह भी एक bimodal इन विवो छवियों से प्राप्त हिस्टोग्राम के साथ, दो चोटियों (स्थानीय Maxima) के एक बेहद असमान विचरण और हिस्टोग्राम की एक विस्तृत घाटी (स्थानीय न्यूनतम) अभी भी सीमा चयन (1 टेबल प्रभावित कर सकते हैं )। इसलिए, एक उचित thresholding एल्गोरिथ्म के चयन की जांच की छवि गुणवत्ता के आधार पर किए जाने की जरूरत है और उन सीएफएल चौड़ाई बढ़ाता में सबसे अच्छा उपयुक्तता के लिए प्रत्येक thresholding कलन विधि की सीमाओं पर विचार किया है।

जैसा कि सीएफएल की चौड़ाई काफी हद तक प्रवाह की स्थिति पर निर्भर कर रहे हैं, प्रयोग के दौरान पूरे निरंतर धमनी दबाव माप आवश्यक है। क्रम में स्थानीय प्रवाह की स्थिति का निर्धारण करने के लिए,रक्त के प्रवाह की दर pseudoshear रक्त वाहिका 5 में मतलब प्रवाह वेग को मापने के द्वारा की जा सकती है।

सारांश में, एक चूहा cremaster मांसपेशियों और मात्रात्मक छवि विश्लेषण यहाँ वर्णित की शल्य चिकित्सा की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल vivo में सीएफएल चौड़ाई के गतिशील परिवर्तन पर मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया है। सीएफएल चौड़ाई माप की सटीकता सुनिश्चित करने में प्राथमिक चुनौतियों मांसपेशियों और छवि विभाजन, जो दोनों के ऊपर संबोधित किया गया है की उचित शल्य चिकित्सा की तैयारी में शामिल हैं। इस तकनीक को आसानी से अन्य microcirculatory पढ़ाई करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता hemorheological और विभिन्न शारीरिक और रोग की स्थिति में रक्तसंचारप्रकरण aberrations जांच करने के लिए। नतीजतन, इन निष्कर्षों microvascular चिकित्सकीय दृष्टिकोण और नैदानिक ​​हस्तक्षेप के भविष्य के विकास के लिए योगदान करते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Intravital microscope Olympus BX51WI Equipment
High speed camera Photron 1024PCI Equipment
Blue filter HOYA B390 Equipment
Pressure sensor & biopac system Biopac system TSD104A, MP100 Equipment
Temperature controller Shimaden SR 1 Equipment
Plasma Lyte A Baxter NDC:0338-0221 Warm in 37 °C water bath before use
Saline 0.9% Braun
Heparin (5,000 IU/ml) LEO
PE-10 polyethylene tube Becton Dickinson 427400 .024" OD x .011" ID 
PE-50 polyethene tube Becton Dickinson 427411 .038" OD x .023" ID
PE-205 polyethene tube Becton Dickinson 427446 .082" OD x .062" ID
2-0 non-absorbable silk suture Deknatel 113-S
5-0 non-absorbable silk suture Deknatel 106-S
Water circulating heating pad Gaymar
Water bath Fisher Scientific Isotemp 205 Equipment
Sterile Cotton Gauze  Fisher Scientific 22-415-468
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific 23-400-124
Dumont Forceps Kent Scientific INS14188 Surgical instrument
Micro Dissecting forceps Kent Scientific INS15915 Surgical instrument
Iris forceps 1 x 2 teeth Kent Scientific INS15917 Surgical instrument
Vessel cannulation forceps Kent Scientific INS500377 Surgical instrument
Micro scissor Kent Scientific INS14177 Surgical instrument
Iris scissor Kent Scientific INS14225 Surgical instrument
Vessel clip Kent Scientific INS14120 Surgical instrument
Gemini cautery system Braintree Scientific GEM 5917 Surgical instrument

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References

  1. Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).
  2. Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S. Effect of erythrocyte aggregation and flow rate on cell-free layer formation in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H1870-H1878 (2010).
  3. Namgung, B., Kim, S. Effect of uneven red cell influx on formation of cell-free layer in small venules. Microvasc Res. 92, 19-24 (2014).
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Ng, Y. C., Fisher, L. K., Salim, V., Kim, S., Namgung, B. Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle. J. Vis. Exp. (116), e54550, doi:10.3791/54550 (2016).

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