Protocol
Este estudo está de acordo com a Universidade Nacional de Singapura Institutional Animal Care e Use Committee (protocolo aprovado no. R15-0225).
1. Preparação cirúrgica do Modelo Animal
- canulações navio
- Anestesiar a ratazanas macho Sprague-Dawley (6 - 7 semanas de idade) de pesagem (203 ± 20) g com cetamina (37,5 mg / ml) e xilazina (5 mg / ml) cocktail através de injecção intraperitoneal (ip) de injecção (2 ml / kg) . Não recapitular a agulha ou removê-lo a partir da seringa, após a injecção.
- Uma vez que o animal foi anestesiado (confirmado por dedo do pé que comprime a), colocá-la sobre uma almofada de aquecimento para manter a sua temperatura do corpo a 37 ° C. Delicadamente raspar o cabelo na escápula, colo do útero anterior, abdômen, perna medial e saco escrotal. Gentilmente conter as pernas usando fitas de papel adesivas.
- Executar todos os procedimentos cirúrgicos com uma tesoura de microdissecção e pinças angulares durante a visualização atravésum estereomicroscópio. Coloque todos os instrumentos cirúrgicos afiados em uma bandeja resistente a perfurações para evitar lesões durante a cirurgia.
- Esfregue todos os locais cirúrgicos 3 vezes com alternância de iodo e álcool 70% antes de realizar a incisão. Lave todos os cateteres com 30 solução de heparina salina UI / ml.
- Faça de 1 - 1,5 centímetros incisão na pele na linha média sobre as escápulas usando um par de tesouras cirúrgicas sobre a veia jugular direita. Separa-se a fáscia por dissecção cega para expor a veia jugular e canular-lo com um tubo de polietileno (PE-50) cheio com heparina-solução salina utilizando 5-0 suturas de seda. Infundir anestesia suplementar quando necessário (1/3 a 1/2 da dose inicial, por via intravenosa (iv)) ao longo do curso da experiência e cirurgia.
- Realização da traqueostomia para manter a desobstrução das vias aéreas. Adicione de 1 - 1,5 centímetros incisão na área cervical anterior. Canular a traqueia usando um tubo de polietileno (PE-205) com fio de seda 2-0 para fixar o cateter no local.
- Monitor de pressão arterialatravés de punção na artéria femoral. Faça de 1 - 1,5 centímetros incisão na face medial esquerdo da perna traseira. Separar a artéria femoral por dissecção romba. Canular a artéria femoral, com um tubo de polietileno (PE-10) cheio com heparina-solução salina utilizando 5-0 suturas de seda.
- Cremaster Muscle Preparação and Flow Visualization
- Insira uma sutura 5-0 seda através do ápice do saco escrotal para estendê-lo. Realizar uma incisão ao longo da superfície ventral do saco escrotal. Regularmente aplicar a solução isotónica quente (37 ° C; pH 7,4) para o músculo exposta.
- Remover circundante tecidos conjuntivos com cuidado e profundidade usando um aplicador com ponta de algodão.
- Insira uma sutura 5-0 seda através do ápice do músculo cremaster. Corte a sutura em duas partes de igual comprimento e faça um nó em cada lado. Corte o músculo entre os dois nós e esticá-la em uma plataforma transparente de acrílico personalizado puxando suavemente a sutura. Consertara extremidade do fio de sutura para a plataforma com a aderência azul.
NOTA: a remoção completa de cercar tecidos conjuntivos é crucial na obtenção de contraste de imagem ideal. - 1.2.3 Repita o passo até 5 a 6 fixações são feitas. Remova cuidadosamente o músculo cremaster do epidídimo usando alta cautério temperatura. Superfuse solução isotónica quente para o músculo exposta para evitar a desidratação do tecido.
- Cerque o músculo cremaster com peças dobradas de gaze. Cobrir o músculo exposta com uma película de polivinil. Os pedaços de gaze com o filme formar uma bacia rasa para segurar solução isotônica quente para o objetivo de imersão em água microscópio (Figura 1A).
- Transferir o animal para a fase de animais de um microscópio intravital (Figura 1C). Ligue a punção arterial a um sistema de aquisição de dados fisiológica para monitorização da pressão contínua (Figura 1E).
- Manter a temperat muscularure a 35 ° C com um elemento de aquecimento ligado por baixo da plataforma do animal (Figura 1B). Coloque um sensor de temperatura junto ao músculo para fornecer feedback negativo para o controlador de energia do elemento de aquecimento (Figura 1D).
- Deixar o animal no estágio durante 15 minutos para equilibrar com o ambiente.
- Visualizar o fluxo sanguíneo ao microscópio intravital com um objetivo de imersão em água 40X e um condensador de funcionamento longa.
- Escolha uma arteríola não ramificado (<60 um), com base em um foco de imagem clara e contraste entre o núcleo de RBC, CFL e dos vasos paredes, a fim de focar o microscópio sobre o plano diametral do vaso sanguíneo. Rodar a câmara montada no microscópio para alinhar verticalmente a parede do vaso.
- Grave o fluxo de sangue usando uma câmera de vídeo de alta velocidade com uma taxa de quadros de 3.000 / seg por 1 segundo. Salvar o vídeo gravado em formato AVI em tons de cinza não-comprimido de 8 bits para preservar a qualidade da imagem.
NOTA: Recomenda-se uma velocidade mínima do quadro de gravação de 3.000 quadros / seg para assegurar que a medição de CFL pode ser realizada pelo menos uma vez por RBC sob condições de fluxo fisiológicas arteriolar. - Usar um filtro azul com pico de transmissão em comprimento de onda de 394 nm, e passa-banda espectral de 310 - 510 nm, para aumentar o contraste entre as hemácias e plasma.
NOTA: Certifique-se de que o espectro de luz que passa através do filtro azul da fonte de luz microscópica (lâmpada de halogéneo de 100 W) é de baixa intensidade de luz para evitar qualquer dano tecidual potencial. - No final da experiência, os animais a eutanásia com uma sobredose de pentobarbital de sódio.
Análise 2. Imagem
- Pré-processamento para a medição da largura do CFL
- Abra MATLAB e execute o arquivo 'CFL_pre.m'. (Este e outros arquivos MATLAB pode ser encontrado noip "> Suplementar MATLAB Arquivo.)
- Clique em "Abrir arquivo" para selecionar o arquivo de vídeo para analisar.
- Ajuste o controle deslizante de "rotação" para alinhar as paredes dos vasos verticalmente.
NOTA: Os usuários podem exibir as linhas de grade de apoio para o alinhamento navio, selecionando o botão de opção 'Grid On' e ajuste o nível de zoom da imagem deslizando o controle deslizante 'Zoom'. - Clique no botão 'Confirmar Editar' para confirmar o alinhamento navio.
- Clique no botão 'Definir ROI para a cultura' para definir a região de interesse (ROI). A imagem alinhada será exibido em uma janela pop-up. Ajustar o objetivo rectangular na imagem e clique duas vezes para confirmar a ROI. Pule esta etapa se o corte de imagem não é necessária.
NOTA: Apenas incluem um único recipiente na ROI para analisar a largura do recipiente de CFL. Clique no botão "Reiniciar Imagem 'para restaurar a imagem à sua forma original, se necessário. - Clique no9; Extrato 'botão para extrair todos os quadros de vídeo editados em imagens de mapas de bits consecutivos (8-bit em tons de cinza "Imagens BMP'). As imagens extraídas podem ser encontrados na pasta com o mesmo nome do arquivo de vídeo selecionado.
- Medição da largura CFL
- Abra MATLAB e execute o arquivo 'CFL_measure.m'.
- Clique em "Selecionar Pasta" para selecionar a pasta que contém as imagens extraídas.
- Clique na pasta que contém as imagens e clique em "Selecionar Pasta". O primeiro quadro de imagem na pasta será carregado e mostrado no painel 'Tons de cinza imagem', juntamente com o seu cinza histograma de intensidade no painel 'Imagem Histograma'.
- Selecione o quadro de imagem desejada na caixa de lista para realizar a análise, caso contrário, o primeiro quadro de imagem será selecionado.
- Clique "Encontrar navio Paredes 'para identificar o interior da parede do vaso na imagem, que é determinada no local onde oluz perfil de intensidade de pico trânsitos de escuro para claro ao longo de dois pixels.
- Verificar 'filtro mediano' para aplicar um filtro de média para a imagem para reduzir o ruído de "sal e pimenta".
- Check 'Auto Contraste' para ajustar as intensidades de imagem digital para aumentar o contraste da imagem.
- Selecione um algoritmo de limiarização na caixa de listagem que determina automaticamente um valor limiar (τ) que divide os níveis de cinza em duas classes - pixels brancos com níveis de cinza acima τ (CFL), e pixels pretos com níveis de cinza abaixo τ (RBC core).
NOTA: Como um método alternativo, use limiar manual se nenhum dos algoritmo de limiarização automatizado proporciona um limiar de imagem apropriado. Clique no botão de opção 'Manual' e ajuste o controle deslizante para definir o valor de limiar manual. - Para medir a variação espacial das larguras CFL, digite a resolução de pixels na caixa de 'pixels de resolução' (a resoluçãoCom esta configuração experimental foi de 0,42 mm / pixel).
- Clique no botão "Calcular" para obter a variação espacial das larguras CFL. Clique em '.csv Exportar' para exportar os dados de largura CFL em um formato de tabela.
- Para medir a variação temporal das larguras CFL em uma linha de análise específica ao longo do vaso, clique no botão de opção 'Temporal Variação "e insira as informações taxa de quadros (a taxa de quadros usada nesta configuração experimental foi 3.000 frames / seg).
- Digite o primeiro quadro e último quadro das imagens para a análise nas caixas 'Iniciar Frame' e 'Última frame', respectivamente.
- Seleccione a posição da linha de análise ao longo do vaso deslizando barra deslizante da "Linha Análise '. Confirmar a posição da linha de análise, o qual é ilustrado em ambos os 'imagem em escala de cinza "e" imagem binária'.
- Clique em "Calcular" para obter a variação temporal das larguras CFL. click 'Export .csv' para exportar os dados de largura CFL em um formato de tabela.
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Representative Results
A visualização da CFL in vivo é largamente dependente das preparações cirúrgicos do animal. perda excessiva de sangue ou duração da cirurgia estendida pode sujeitar o animal ao choque e aberrações do fluxo sanguíneo. Manutenção da temperatura do tecido usando uma almofada de aquecimento, bem como uma plataforma de personalização durante a cirurgia e experiência também é crucial para manter as condições fisiológicas do rato. Por utilização de uma lâmpada de halogéneo de 100 W no sistema de microscópio, sem danos nos tecidos discernível foi observado mesmo no final da experiência.
A Figura 2A mostra um típico fluxo GV através de uma arteríola não ramificado no músculo cremaster de rato, em que o CFL pode ser observado entre o núcleo de RBC e a parede do vaso interior (Figura 2C). Um bom contraste entre esses componentes durante a experiência é fundamental para garantir a precisão dos CFL medidas de largura. A fase inicial da análise de imagem envolve odetecção da parede do vaso interior. Ao adquirir o perfil intensidade de luz ao longo da linha de análise perpendicular ao navio, a localização é aproximada no pico que trânsitos de escuro para claro ao longo de dois pixels (Figura 2B).
Como hemácias e CFL possuem diferentes transmissão da luz, a diferença de níveis de cinza pode ser subdividida em duas classes (imagem binária). No entanto, a identificação de um valor limite preciso entre os dois picos no histograma da imagem pode ser limitada por uma má qualidade de imagem e o contraste (Figura 3A). Para melhorar o contraste entre os GVs e CFL, um filtro azul pode ser utilizado (Figura 3B). Isto é também evidente na Figura 4, em que os limites do núcleo de glóbulos vermelhos pode ser identificado de forma mais precisa com a utilização de um filtro azul. Além disso, a selecção de algoritmo de limiar 20-23 também pode influenciar a medição da largura CFL (Figura4). É evidente na figura 4A que diferentes algoritmos de limiar resultou em diferentes fronteira núcleo RBC identificados, o que poderia levar a medições CFL erradas. Para melhor ilustrar a influência do algoritmo de limiar sobre a medição da largura do CFL na Figura 4B, os perfis espaciais para as larguras de CFL obtidos usando diferentes algoritmos de limiar são mostrados na Figura 5 e resumidos na Tabela 1.
Figura 1:. Intravital Sistema microscópica e Cremaster Preparação Muscle A:. Cirurgicamente exteriorizado músculo cremaster de rato B: Customized plataforma com elementos de aquecimento para colocar o músculo cremaster e manter a sua temperatura a 35 ° C C:. Sistema microscópico com cusmizadas palco animais e câmera de alta velocidade para a visualização dos fluxos de sangue da microcirculação no cremaster muscular D:. controlador de temperatura feedback negativo e fonte de alimentação E:. sistema de aquisição de dados fisiológicos para monitorização da pressão contínua. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Processamento de Imagem para Determinação do navio parede Posição e CFL Largura A:.. Imagem em tons de cinza típico de fluxo RBC em uma arteríola (diâmetro do vaso = 52 mm) B: perfil de intensidade de luz ao longo da linha de análise (linha sólida no painel A) . C: resultado representativo de medida CFL ao longo do vaso. osetas a cheio e a tracejado indicam a parede do vaso interior e bordo exterior do núcleo de RBC, respectivamente. (LWB & RWB: esquerda e direita navio fronteira parede, LCB & RCB: esquerda e direita RBC núcleo de fronteira) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:.. Aperfeiçoamento de contraste da imagem com um filtro azul Optical histograma da imagem das imagens em tons de cinza obtidos sem (A) e com filtro azul (B) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figure 4: RBC Núcleo Largura Determinada utilizando cinco diferentes algoritmos de limiarização Fronteiras do núcleo RBC ea parede do reservatório sobreposto a imagens em tons de cinza na Figura 3.. (linha superior (A): sem filtro azul, linha de baixo (B): com filtro azul) usando (da esquerda para a direita) o método do Otsu, método mínimo, método intermode, método de seleção iterativa (Isodata) e limiar entrópica difusa (Shanbhag). As linhas contínuas e tracejadas indicam a parede do vaso interior e borda externa do núcleo RBC, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Variação espacial de CFL Largura CFL larguras correspondentes à Figura 4B ao longo da esquerda (A).e direito (B) paredes dos vasos, respectivamente. (D: distância em diâmetro do vaso) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Valores limiar e CFL largura de dados na Figura 5. * p <0,001: diferença significativa do método de Otsu. † p <0,001: diferença significativa a partir da esquerda. As análises estatísticas foram realizadas utilizando testes t não pareado bicaudal.
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Discussion
A medição da largura CFL é essencial para uma melhor compreensão da hemodinâmica na microcirculação. Em particular, a medição de larguras CFL tem sido realizada em mesentérica 6, espinhotrapézio 24 e cerebrais 25 microcirculations. Medição convencional de in vivo larguras CFL foi restrita a estimativas por inspeção manual dos quadros de vídeo gravadas. As medições manuais necessários a média de vários quadros de vídeo sucessivas antes de identificar visualmente os limites das centrais e dos vasos paredes RBC 15,16. Em outro estudo, isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com RBCs e rodamina-B isotiocianato (RITC) de plasma marcadas foram utilizados para determinar as larguras médias CFL no CAT microvasos cerebrais 25. Estes métodos de medições anteriores são muito demorados e requerem passos adicionais para a marcação fluorescente, o que limita a resolução espacial e temporal do wi CFLmedição de DTH. Em contraste, por acoplamento de gravações câmara de alta velocidade a uma segmentação da imagem efectiva e a análise, a técnica demonstrada aqui permite a quantificação de variações temporais e espaciais da CFL com uma resolução espacial (0,42 mm) de uma ordem mais pequeno do que o tamanho de um RBC e uma resolução temporal de 1 / 3.000 seg.
preparação cirúrgica adequada do músculo cremaster é crítica na determinação da precisão das medições de largura CFL. Em particular, a remoção completa dos tecidos conjuntivos adjacentes é essencial para garantir um bom foco das arteríolas do músculo cremaster. Além disso, a resolução espacial e temporal da medição depende das especificações do microscópio e a câmara. Embora um objectivo ampliação mais elevada pode melhorar a resolução espacial, que reduz o campo de visão, que por sua vez, limita o comprimento do vaso obtida para quantificar a variação espacial da largura de CFL. Portanto, o microscopiconfigurações C pode ser modificado de acordo com a aplicação específica da técnica.
segmentação de imagens é outro fator importante para a precisão da medição da largura do CFL. De entre as várias técnicas desenvolvidas, limiar da imagem com base no nível de cinzento do histograma proporciona uma abordagem simples e eficaz para a segmentação e análise de imagem. Por conseguinte, objectos de fundo são extraídos do fundo com base na diferença entre os níveis de cinzento. No caso ideal, o histograma da imagem vai ser bimodal e um valor de limiar, na parte inferior do vale é trivial. No entanto, in vivo imagens experimentais nem sempre apresentam tais perfis de nível em tons de cinza. Nossos resultados têm mostrado como a qualidade da imagem e contraste podem influenciar o processo de segmentação de imagens. A utilização de um filtro azul óptica melhorada significativamente o contraste entre as hemácias e o plasma numa arteríola (Figura 3), e parece ser essencial quando applying o limiar com base em histograma para a medição da largura do CFL independentemente dos algoritmos (Figura 4). Isso resulta em um histograma da imagem bimodal distintos, o que permite identificar o valor do limiar de forma eficaz. No entanto, deve notar-se que, mesmo com um histograma bimodal obtidos a partir das imagens in vivo, uma variação extremamente desigual de dois picos (máximos locais) e um vale largo (mínimo local) do histograma ainda pode influenciar a selecção de limiar (Tabela 1 ). Portanto, a seleção de um algoritmo de limiar apropriada precisa ser examinado com base na qualidade da imagem e os usuários tem que considerar as limitações de cada algoritmo de limiarização para a melhor adequação na quantificação larguras CFL.
Como as larguras CFL são largamente dependente das condições de escoamento, a medição da pressão arterial contínua ao longo do curso do experimento é essencial. A fim de determinar as condições de escoamento locais,a taxa pseudoshear do fluxo sanguíneo pode ser calculado através da medição da velocidade média de fluxo no vaso sanguíneo 5.
Em resumo, os protocolos para a preparação cirúrgica de um músculo cremaster de rato e análise de imagem quantitativa descritos aqui foram utilizados para obter informação quantitativa sobre a variação dinâmica das larguras CFL in vivo. Os principais desafios para garantir a precisão dos CFL largura medições incluem preparação cirúrgica adequada da segmentação muscular e imagem, sendo que ambos foram abordados acima. Esta técnica pode ser facilmente adaptada para outros estudos para investigar a microcirculação e as aberrações hemorreológica hemodinâmicas em várias condições fisiológicas e patológicas. Consequentemente, estes resultados contribuem para o futuro desenvolvimento de abordagens terapêuticas microvasculares e intervenção clínica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intravital microscope | Olympus | BX51WI | Equipment |
| High speed camera | Photron | 1024PCI | Equipment |
| Blue filter | HOYA | B390 | Equipment |
| Pressure sensor & biopac system | Biopac system | TSD104A, MP100 | Equipment |
| Temperature controller | Shimaden | SR 1 | Equipment |
| Plasma Lyte A | Baxter | NDC:0338-0221 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Saline 0.9% | Braun | ||
| Heparin (5,000 IU/ml) | LEO | ||
| PE-10 polyethylene tube | Becton Dickinson | 427400 | .024" OD x .011" ID |
| PE-50 polyethene tube | Becton Dickinson | 427411 | .038" OD x .023" ID |
| PE-205 polyethene tube | Becton Dickinson | 427446 | .082" OD x .062" ID |
| 2-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 113-S | |
| 5-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 106-S | |
| Water circulating heating pad | Gaymar | ||
| Water bath | Fisher Scientific | Isotemp 205 | Equipment |
| Sterile Cotton Gauze | Fisher Scientific | 22-415-468 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-124 | |
| Dumont Forceps | Kent Scientific | INS14188 | Surgical instrument |
| Micro Dissecting forceps | Kent Scientific | INS15915 | Surgical instrument |
| Iris forceps 1 x 2 teeth | Kent Scientific | INS15917 | Surgical instrument |
| Vessel cannulation forceps | Kent Scientific | INS500377 | Surgical instrument |
| Micro scissor | Kent Scientific | INS14177 | Surgical instrument |
| Iris scissor | Kent Scientific | INS14225 | Surgical instrument |
| Vessel clip | Kent Scientific | INS14120 | Surgical instrument |
| Gemini cautery system | Braintree Scientific | GEM 5917 | Surgical instrument |
References
- Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).
- Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S. Effect of erythrocyte aggregation and flow rate on cell-free layer formation in arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H1870-H1878 (2010).
- Namgung, B., Kim, S. Effect of uneven red cell influx on formation of cell-free layer in small venules. Microvasc Res. 92, 19-24 (2014).
- Goldsmith, H. L. The Microcirculatory Society. Eugene M. Landis Award Lecture. The Microrheology of Human-Blood. Microvasc Res. 31 (2), 121-142 (1986).
- Buerk, D. G. Can We Model Nitric Oxide Biotransport? A Survey of Mathematical Models for a Simple Diatomic Molecule with Surprisingly Complex Biological Activities. Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 109-143 (2001).
- Tateishi, N., Suzuki, Y., Soutani, M., Maeda, N. Flow dynamics of erythrocytes in microvessels of isolated rabbit mesentery: cell-free layer and flow resistance. J Biomech. 27 (9), 1119-1125 (1994).
- Ong, P. K., Cho, S., Namgung, B., Kim, S. Effects of cell-free layer formation on NO/O2 bioavailability in small arterioles. Microvasc Res. 83 (2), 168-177 (2012).
- Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Modulation of NO bioavailability by temporal variation of the cell-free layer width in small arterioles. Ann Biomed Eng. 39 (3), 1012-1023 (2011).
- Park, S. W., Intaglietta, M., Tartakovsky, D. M. Impact of stochastic fluctuations in the cell free layer on nitric oxide bioavailability. Front Comput Neurosci. 9, 131 (2015).
- Ng, Y. C., Namgung, B., Kim, S. Two-dimensional transient model for prediction of arteriolar NO/O2 modulation by spatiotemporal variations in cell-free layer width. Microvasc Res. 97, 88-97 (2015).
- Sriram, K., et al. The effect of small changes in hematocrit on nitric oxide transport in arterioles. Antioxid Redox Sign. 14 (2), 175-185 (2011).
- Hightower, C. M., et al. Integration of cardiovascular regulation by the blood/endothelium cell-free layer. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 458-470 (2011).
- Ng, Y. C., Namgung, B., Leo, H. L., Kim, S. Erythrocyte aggregation may promote uneven spatial distribution of NO/O in the downstream vessel of arteriolar bifurcations. J Biomech. , (2015).
- Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. Temporal variations of the cell-free layer width may enhance NO bioavailability in small arterioles: Effects of erythrocyte aggregation. Microvasc Res. 81 (3), 303-312 (2011).
- Maeda, N. Erythrocyte rheology in microcirculation. Jpn J Physiol. 46 (1), Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8743714 1-14 (1996).
- Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels - Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), Available from: http://ajpheart.physiology.org/content/268/5/H1959 H1959-H1965 (1995).
- Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. A computer-based method for determination of the cell-free layer width in microcirculation. Microcirculation. 13 (3), 199-207 (2006).
- Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels. Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), H1959-H1965 (1995).
- Namgung, B., et al. A comparative study of histogram-based thresholding methods for the determination of cell-free layer width in small blood vessels. Physiol Meas. 31 (9), N61-N70 (2010).
- Ong, P. K., et al. An automated method for cell-free layer width determination in small arterioles. Physiol Meas. 32 (3), N1-N12 (2011).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
- Prewitt, J. M., Mendelsohn, M. L. The analysis of cell images. Ann N Y Acad Sci. 128 (3), 1035-1053 (1966).
- Ridler, T. W., Calvard, S. Picture Thresholding Using an Iterative Selection Method. IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 8 (8), 630-632 (1978).
- Shanbhag, A. G. Utilization of Information Measure as a Means of Image Thresholding. Cvgip-Graph Model Im. 56 (5), 414-419 (1994).
- Bishop, J. J., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. Effects of erythrocyte aggregation and venous network geometry on red blood cell axial migration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (2), H939-H950 (2001).
- Yamaguchi, S., Yamakawa, T., Niimi, H. Cell-free plasma layer in cerebral microvessels. Biorheology. 29 (2-3), 251-260 (1992).
